超高壓法提取牡蠣中?；撬岬墓に囇芯?/h1>
2016-12-19 08:54:11盧虹玉章超樺
食品工業(yè)科技 2016年19期
徐 成,盧虹玉,章超樺,金 飛
(廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室, 廣東普通高等學校水產(chǎn)品深加工重點實驗室,國家貝類加工技術研發(fā)分中心(湛江), 南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心,廣東湛江 524088)
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超高壓法提取牡蠣中?；撬岬墓に囇芯?/p>
徐 成,盧虹玉*,章超樺,金 飛
(廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室, 廣東普通高等學校水產(chǎn)品深加工重點實驗室,國家貝類加工技術研發(fā)分中心(湛江), 南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心,廣東湛江 524088)
本文對超高壓技術提取牡蠣中牛磺酸的工藝技術進行了研究,采用高效液相色譜法(HPLC)測定?；撬岬奶崛×?并與傳統(tǒng)的熱水抽提法進行比較。單因素實驗結(jié)果表明:壓力、保壓時間、溫度以及料液比均對?；撬岬奶崛×坑休^大影響。在此基礎上通過正交實驗得到最佳提取工藝條件為:壓力300 MPa、保壓時間25 min、溫度45 ℃、料液比為1∶5,最高提取量22.96 mg/g,高于熱水抽提法的牛磺酸提取量(17.07 mg/g)。本研究為發(fā)展高新技術應用于牡蠣中?；撬岬奶崛√峁├碚撘罁?jù)。
牡蠣,?；撬?超高壓,HPLC
超高壓技術作為一種新型的非熱加工技術,已經(jīng)逐漸應用于食品領域。超高壓技術的主要優(yōu)點不僅是其能夠在低溫條件下操作,減少食品中熱敏成分的損失,而且還能在達到良好的滅菌等效果的同時保持食品的性狀和風味。目前,超高壓技術除了廣泛的用于食品的滅菌和蛋白質(zhì)或酶變性等方面,其提取活性成分的能力也逐漸受到人們的關注。利用超高壓技術從一些植物中提取黃酮類[1]、多酚[2]、花色苷[3]、毛柳甙[4]等活性物質(zhì)都已有相關報道。但采用超高壓技術提取天然?；撬岬难芯窟€鮮有報道。
天然?；撬崾亲钪匾陌被嶂?具有許多重要的生物學功能,普遍存在于海產(chǎn)品和許多哺乳動物組織中,其中海洋貝類是牛磺酸含量最為豐富的天然來源之一,尤其是牡蠣[6]、馬氏珠母貝、翡翠貽貝和企鵝珍珠貝中的?；撬岷窟h高于其他貝類。根據(jù)本研究的前期預實驗結(jié)果,采用超高壓技術提取牡蠣中的?；撬峋哂幸欢ǖ目尚行?可能具有增加提取效率、減少污染、節(jié)省成本等優(yōu)點。因此,利用超高壓技術提取牡蠣中的天然?；撬峋哂袕V闊的應用前景。
本研究擬采用超高壓技術對牡蠣中的?；撬徇M行提取,通過高效液相色譜法(HPLC)測定?；撬岷?從而確定超高壓最佳提取工藝,并與傳統(tǒng)熱水抽提取法進行比較。本研究將為新型技術在貝類?；撬崽崛≈械膽锰峁┣捌跀?shù)據(jù)和研究基礎。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
香港牡蠣 廣東省湛江市東風市場,新鮮剝殼后瀝干水分,-70 ℃冷藏;牛磺酸標準品 上海一基生物試劑有限公司(純度>97%);鄰苯二甲醛 特冠基化工貿(mào)易有限公司;β—巰基乙醇 北京索萊寶科技有限公司;甲醇 廣州市俱輝化工有限公司;乙腈 天津益仁達化工有限公司。
超高壓設備HPP.L2-600/0.6 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司;高效液相色譜儀島津LC-20AD型 日本島津公司;高速冷凍離心機 CR22GⅡ 上海玉研科學儀器有限公司;pH計 雷磁PHS-3C 上海儀電科學儀器股份有限公司;超低溫冷凍柜MDF-U53V 亞速旺(上海)商貿(mào)有限公司。
硼酸鈉緩沖溶液(0.4 mol/L):準確稱取2.48 g硼酸和1.41 g氫氧化鈉,用水溶解后定容至100 mL。衍生劑:準確稱取0.1 g鄰苯二甲醛,用10 mL甲醇溶解后,再加入0.1 mL的β-巰基乙醇,最后用0.4 mol/L的硼酸鈉緩沖溶液定容至100 mL。?；撬針藴嗜芤旱呐渲?1.000 mg/mL):精密稱取0.2500 g的?；撬針藴势?用水溶解后,移入250 mL的容量瓶中,并用水稀釋至刻度,搖勻。?；撬針藴适褂靡旱呐渲?0.01 mg/mL):吸取牛磺酸標準溶液1.00 mL于100 mL的容量瓶中,用水定容至刻度,搖勻。
1.2 超高壓提取
精密稱取牡蠣勻漿液并用超高壓袋分裝(每袋5.000 g),再按一定料液比向超高壓袋中加入蒸餾水,封口并搖勻(注意超高壓袋內(nèi)的空氣要排干凈),接著對牡蠣勻漿液進行超高壓處理,取出經(jīng)超高壓處理后的牡蠣勻漿液,在8000 r/min,4 ℃的條件下離心,取上清液待測。
1.3 單因素實驗
超高壓法提取?；撬峥赡芘c壓強、保壓時間、溫度以及料液比等因素相關,分別取這些因素的不同水平考察其對?；撬崽崛〉挠绊憽＞唧w選取水平值如下:
壓強的選擇:讓牡蠣勻漿液分別在50、100、150、200、250、300 MPa的壓強下進行處理,且此時保證溫度為20 ℃,保壓時間為20 min,料液比為1∶4。
保壓時間的選擇:讓牡蠣勻漿液分別在5、10、15、20、25、30 min的條件下進行超高壓處理,且此時保證溫度為20 ℃,壓強為200 MPa,料液比為1∶4。
溫度的選擇:讓牡蠣勻漿液分別在20、25、30、35、40、45 ℃的條件下進行超高壓處理,且此時保證壓強為200 MPa,時間為20 min,料液比為1∶4。
料液比的選擇:在牡蠣勻漿液中按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6的比例加入蒸餾水進行超高壓處理,且此時保證壓強為200 MPa、溫度為20 ℃、保壓時間為20 min。
1.4 正交實驗
根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,通過各個因素對于?；撬崽崛÷实挠绊?選擇最佳的單因素范圍,設計正交表,進行正交實驗,各因素水平見表1。
表1 因素水平
Table 1 The experimental factors and level
水平因素A溫度(℃)B料液比C保壓時間(min)D壓強(MPa)1351∶4202002401∶5252503451∶630300
1.5 水煮法提取
水煮法提取牡蠣中的牛磺酸參考王丹等[5]的方法,并稍作修改。準確稱取5.000 g的牡蠣勻漿液于50 mL的燒杯中,加入20 mL的蒸餾水。將燒杯置于60 ℃的水浴中蒸煮2 h。在蒸煮的過程中要不斷的用玻璃棒攪拌。之后待提取液冷卻后,在8000 r/min,4 ℃的條件下離心,取上清液備用。
1.6 ?；撬岷繖z測
本實驗采用高效液相色譜法測定?；撬岬暮縖6]。
1.6.1 高效液相色譜條件 進樣量:20 μL;流速:0.3 mL/min;柱溫:40 ℃;最高限壓:20 MPa檢測器波長:λEX:338 nm λEM:425 nm;流動相組成:甲醇∶乙腈∶水=1∶1∶8。
1.6.2 ?；撬針藴是€的制作 分別移取質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL的牛磺酸標準使用液0.10,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20 mL于2.0 mL的離心管中,用超純水稀釋至刻度,搖勻,得到了7個系列濃度的?；撬針藴势啡芤?再分別吸取1.0 mL的上述已經(jīng)稀釋的?；撬崛芤河诹硗庖粋€2.0 mL的離心管中,再準確加入事先配制好的鄰苯二甲醛溶液1.0 mL,混勻,衍生3 min后,經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾在2 mL的進樣瓶中[7],放入自動進樣器中,用高效液相色譜儀進行測定。以?；撬針藴势窛舛葹闄M坐標,峰面積為縱坐標,制作標準曲線。
1.6.3 牛磺酸檢測 分別取經(jīng)超高壓處理、水煮法處理的牡蠣上清液以及牡蠣樣品稀釋液0.5 mL到50 mL的比色管中,用蒸餾水定容至刻度并搖勻。取稀釋了10000倍的樣品液1 mL于2 mL的離心管中,再準確加入1 mL的衍生劑,混勻,衍生3 min后經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾在2 mL的進樣瓶中,放入自動進樣器中,用高效液相色譜儀進行測定,記錄峰面積。
1.6.4 精密度實驗 取400 μL已知質(zhì)量濃度為0.001 mg/mL的?；撬針藴势啡芤河? mL離心管中,用超純水定容至刻度,再取1.0 mL上述已稀釋的?；撬針藴势啡芤河?.0 mL的離心管中,加入1 mL的鄰苯二甲醛經(jīng)衍生3 min,通過0.45 μm的微孔濾膜過濾到2 mL的進樣瓶中進行測定。重復測定6次,記錄每一次的峰面積,通過計算?；撬岬臐舛?以相對標準偏差來度量儀器的精密度。
1.6.5 回收率測定 精密稱取5.000 g牡蠣樣品6份,分別在6份樣品中加入10.00、20.00、30.00、40.00、50.00、60.00 mg的?；撬針藴势?通過之前的單因素實驗已知在壓強300 MPa,溫度45 ℃,料液比1∶5,保壓時間25 min條件下處理牡蠣得到其牛磺酸含量為17.84 mg/g,故在此條件下處理牡蠣加標樣提取?；撬?用高效液相色譜檢測?；撬?計算牛磺酸的回收率。
1.6.6 ?；撬岷坑嬎?/p>
式中:X-試樣中?；撬岬暮?單位為毫克每克(mg/g);c-經(jīng)查圖和計算得進樣液中?；撬岬暮?單位為毫克每毫升(mg/mL);V2-試樣總的稀釋體積,單位為毫升(mL);V1-試樣的體積,單位為毫升(mL)。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素實驗結(jié)果
超高壓的原理就是利用超高壓使細胞的細胞膜破碎,從而使得細胞內(nèi)的物質(zhì)與溶劑結(jié)合,以達到提高目標產(chǎn)物提取率的效果,因此壓強是超高壓提取過程中一個重要的影響因素。從圖1可知牛磺酸的提取率,隨著壓強的增大而增大,當壓強達到250 MPa之后,?；撬岬奶崛×口呌谄椒€(wěn)。這是因為隨著壓強的增加,有效成分的傳質(zhì)速率不斷增加,細胞壁和細胞膜的破碎增加,從而使得?；撬岬奶崛×侩S著壓強的增加而增加,而當壓強超過250 MPa時,細胞的細胞膜和細胞壁已經(jīng)完全破碎,所以隨著壓強的增加?；撬岬奶崛×繘]有太大的變化。
圖1 壓強對?；撬崽崛×康挠绊慒ig.1 Effect of pressure on extraction of taurine
保壓時間長短與?；撬崽崛×康年P系,見圖2。保壓時間對有效成分的提取也十分重要,隨著保壓時間的增加,細胞內(nèi)溶物會不斷增加,但在一定壓強條件下,隨著時間的增加細胞內(nèi)溶物與周圍溶劑會逐漸達到平衡[8]。超高壓時間在10 min以內(nèi),對于牛磺酸提取量的影響很小,這可能是由于保壓時間過短,細胞膜還沒有被完全的破壞。從第10 min時開始?；撬崽崛×恐饾u上升,保壓時間在25 min之后其提取量則趨于平穩(wěn)。
圖2 保壓時間對?；撬崽崛×康挠绊慒ig.2 Effect of pressure-holding time on extraction of taurine
溫度與?；撬崽崛×康拇笮￡P系,見圖3。由圖可知,隨著溫度的升高,?；撬岬奶崛×坎粩嗟厣?當溫度到達40 ℃后,牛磺酸的提取量趨于平穩(wěn)。溫度對?；撬岬奶崛×恳伯a(chǎn)生了很大的影響,可能是由于牛磺酸是一種游離氨基酸,能夠溶于水,溫度的增加會使得?；撬岬奶崛×吭黾?。在孫利芹等人提取扇貝中?；撬岬膶嶒炛邪l(fā)現(xiàn)[9],溫度對?；撬岬奶崛∮兄@著的影響:在一定溫度范圍內(nèi),隨著溫度的升高,牛磺酸的提取量不斷增加。
圖3 溫度對?；撬崽崛×康挠绊慒ig.3 Effect of the temperatures on extraction of taurine
陳瑞占等[10]提取西洋參皂苷的研究中發(fā)現(xiàn)在提取的過程中,西洋參的溶質(zhì)濃度逐漸降低,而溶劑中的溶質(zhì)濃度逐漸增加,可見料液比在利用超高壓提取有效成分時起著重要作用。由圖4可知,隨著料液比的增加,?；撬岬奶崛×侩S之增加,當料液比為1∶4時牛磺酸提取量最高。
圖4 料液比對?；撬崽崛×康挠绊慒ig.4 Effect of material/liquid ration on extraction of taurine
表3 正交實驗的方差分析結(jié)果
Table 3 Results of variance analysis of orthogonal test
表4 精密度及穩(wěn)定性實驗結(jié)果(n=6)
Table 4 Results of instrument accuracy and stability analysis(n=6)
實驗號123456平均值相對標準偏差RSD(%)?；撬岷?mg)00039000370003900038000360003700038295
2.2 超高壓提取?；撬峁に嚨膬?yōu)化
根據(jù)正交實驗極差分析結(jié)果表明(表2),在已選定的溫度、液料比、保壓時間、壓強范圍內(nèi),影響牡蠣中牛磺酸提取得率的主次因素是壓強>溫度>料液比>保壓時間,各因素的最佳水平組合是A3B2C2D3,即壓強為300 MPa,溫度45 ℃,料液比為1∶5,保壓時間為25 min。由于最佳參數(shù)組合不在L9(34)正交實驗的組合內(nèi),故以最佳條件進行了驗證實驗,其得率為22.96 mg/g,說明該條件為超高壓提取牛磺酸的最優(yōu)條件。為了進一步檢驗正交實驗的有效性,對正交實驗數(shù)據(jù)進行方差分析,結(jié)果顯示與極差分析結(jié)果一致(表3),即壓強對?；撬岬牡寐视绊懽铒@著,其次為溫度,而料液比和保壓時間對?；撬岬牡寐视绊懖伙@著。
表2 L9(34)正交實驗結(jié)果和極差分析
Table 2 Results of range analysis and orthogonal test L9(34)
實驗號ABCD得率(mg/g)111111839212221882313332218421232176522311851623121769731321907832132289933211932K11980197419661874K21932200719971853K32043197319922228R111034031375
2.3 ?；撬岷繙y定結(jié)果
2.3.1 牛磺酸標準曲線的繪制 以?；撬針藴势窛舛葹闄M坐標,峰面積為縱坐標,得到?；撬針藴是€,如圖5所示。當牛磺酸濃度在0.0005～0.006 mg/mL范圍內(nèi),進樣濃度與峰面積呈良好的線性關系,回歸方程y=3109x+978380,相關系數(shù)R2=0.9927。
圖5 牛磺酸標準曲線圖Fig.5 Standard curve of taurine
圖6 ?；撬針藴势犯咝б合嗌V圖Fig.6 Chromatograms of taurine standard
圖7 牡蠣?；撬崛芤焊咝б合嗌V圖Fig.7 Chromatograms of oyster taurine sample
在牛磺酸標準曲線制作過程中,發(fā)現(xiàn)?；撬針藴势愤M樣會產(chǎn)生3個明顯的色譜峰,為了確定牛磺酸對應的保留時間,對所有標準液進樣后產(chǎn)生的三個色譜峰的峰面積進行了積分和分析,僅保留時間為12.8 min的色譜峰峰面積與濃度成線性關系,同時對比了單純衍生試劑的色譜峰,確認保留時間為12.8 min的色譜峰為?；撬?而雜峰是由于過量衍生劑未充分反應及雜質(zhì)所產(chǎn)生的。
2.3.2 精密度測定 如表4所示,相對標準偏差RSD=2.95%,說明采用高效液相色譜法檢測牛磺酸具有良好的精密度。
2.3.3 回收率結(jié)果 由表5可知6種加標回收率分別為90.98%～97.38%,平均回收率達到94.55%(RSD=2.66%),說明用超高壓法處理牡蠣回收率較好。
表5 方法加標回收率實驗結(jié)果
Table 5 Spike recoveries of the methods
序號123456本底值(mg/g)178417841784178417841784加標量(mg/g)20040060080010001200理論值(mg/g)198421842384258427842984回收率(%)949191999602909897389601平均回收率(%)9455相對標準偏差RSD(%)266
2.4 與水煮提取法比較結(jié)果
經(jīng)檢測,傳統(tǒng)的水煮提取法提取得到的牛磺酸為17.07 mg/g。由此可知,超高壓提取法效率要高于傳統(tǒng)的熱水提取法。
3 結(jié)論與討論
?；撬崾遣溉閯游镏幸环N重要的游離氨基酸,在中樞神經(jīng)以及肌肉中都起著重要的作用,而在我國具有高產(chǎn)量的牡蠣含有豐富的?；撬帷Ｄ壳?提取牡蠣中的?；撬岬姆椒ㄖ饕菬崴樘岱?此外有機溶劑抽提法,如乙醇抽提法,還常常利用超聲波等輔助手段來提高牡蠣中牛磺酸的提取量。但上述傳統(tǒng)的提取方法常常具有提取時間長,效率低下等缺點。Hyun-Sun Lee[11]等人同時采用超高壓技術和傳統(tǒng)的熱提取法來從人參中提取人參皂苷,結(jié)果表明超高壓能提高人參皂苷的提取量以及縮短提取時間。本實驗通過從料液比、溫度、壓強、保壓時間四個水平進行單因素實驗結(jié)合隨后的正交實驗得出超高壓法提取牡蠣的最佳工藝條件為壓強300 MPa,溫度45 ℃,液料比1∶5,保壓時間25 min,此時的牛磺酸提取量為22.96 mg/g,高于熱水抽提法得到的?；撬崃?17.07 mg/g)。
目前,檢測?；撬岬姆椒ㄏ鄬Ρ容^成熟,包括高效液相色譜法、紫外分光光度法、熒光法以及氨基酸自動分析法;其中高效液相色譜法的樣品預處理簡單,方法準確度、精確度及靈敏度較高,在測定食品和生物組織中?；撬岷康膽弥腥找鎻V泛[7]。本實驗采用的高效液相色譜法的精密度及穩(wěn)定性和回收率的RSD均在5%以內(nèi),證明實驗中采用的高效液相色譜法具有良好的穩(wěn)定性、精密度和回收率,能較準確的測定?；撬岬暮?。綜上所述,相對傳統(tǒng)的熱水抽提法來說,超高壓法能有效的從牡蠣中提取?；撬?可作為一種提取?；撬岬男路椒ā?/p>
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Process research of taurine extraction from oyster (Crassostreahongkongensis)by high hydrostatic pressure
XU Cheng,LU Hong-yu*,ZHANG Chao-hua,JIN Fei
(College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Guangdong Province Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing(Zhanjiang),South China Sea Bio-Resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center,Zhanjiang 524088,China)
Inthisstudy,HighHydrostaticPressure(HHP)wasusedtoextracttaurinefromoyster,thenthetaurinecontentweredeterminedbyHighPerformanceLiquidChromatography(HPLC),andtheresultsofHHPandHotWaterExtraction(HWE)werecompared.Resultsofthesinglefactorexperimentsshowedthatpressure,pressure-holdingtime,temperatureandsolid-liquidratiohadsignificantinfluenceontheextractionoftaurine.Orthogonaltestbasedontheresultsofthesinglefactorexperimentsshowedthattheoptimumconditionswerepressureof300MPa,pressure-holdingtimeof25min,temperatureof45 ℃,Solid-liquidratioof1∶5;andthecontentoftaurinewas22.96mg/gundertheoptimumconditionswhichwashigherthantheHWEextraction(17.07mg/g).
oyster;taurine;highhydrostaticpressure;HPLC
2016-04-21
徐成(1989-)，男，碩士，研究方向：水產(chǎn)品高值化加工與利用，E-mail:paulxuxu@hotmail.com。
*通訊作者:盧虹玉(1976-)，女，博士，研究方向：海洋活性物質(zhì)研究與開發(fā)，E-mail:41751678@qq.com。
國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-48-07B)。
TS254.1
B
1002-0306(2016)19-0192-05
10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.029
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(廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室, 廣東普通高等學校水產(chǎn)品深加工重點實驗室,國家貝類加工技術研發(fā)分中心(湛江), 南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心,廣東湛江 524088)
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徐 成,盧虹玉*,章超樺,金 飛
(廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室, 廣東普通高等學校水產(chǎn)品深加工重點實驗室,國家貝類加工技術研發(fā)分中心(湛江), 南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心,廣東湛江 524088)
本文對超高壓技術提取牡蠣中牛磺酸的工藝技術進行了研究,采用高效液相色譜法(HPLC)測定?；撬岬奶崛×?并與傳統(tǒng)的熱水抽提法進行比較。單因素實驗結(jié)果表明:壓力、保壓時間、溫度以及料液比均對?；撬岬奶崛×坑休^大影響。在此基礎上通過正交實驗得到最佳提取工藝條件為:壓力300 MPa、保壓時間25 min、溫度45 ℃、料液比為1∶5,最高提取量22.96 mg/g,高于熱水抽提法的牛磺酸提取量(17.07 mg/g)。本研究為發(fā)展高新技術應用于牡蠣中?；撬岬奶崛√峁├碚撘罁?jù)。
牡蠣,?；撬?超高壓,HPLC
超高壓技術作為一種新型的非熱加工技術,已經(jīng)逐漸應用于食品領域。超高壓技術的主要優(yōu)點不僅是其能夠在低溫條件下操作,減少食品中熱敏成分的損失,而且還能在達到良好的滅菌等效果的同時保持食品的性狀和風味。目前,超高壓技術除了廣泛的用于食品的滅菌和蛋白質(zhì)或酶變性等方面,其提取活性成分的能力也逐漸受到人們的關注。利用超高壓技術從一些植物中提取黃酮類[1]、多酚[2]、花色苷[3]、毛柳甙[4]等活性物質(zhì)都已有相關報道。但采用超高壓技術提取天然?；撬岬难芯窟€鮮有報道。
天然?；撬崾亲钪匾陌被嶂?具有許多重要的生物學功能,普遍存在于海產(chǎn)品和許多哺乳動物組織中,其中海洋貝類是牛磺酸含量最為豐富的天然來源之一,尤其是牡蠣[6]、馬氏珠母貝、翡翠貽貝和企鵝珍珠貝中的?；撬岷窟h高于其他貝類。根據(jù)本研究的前期預實驗結(jié)果,采用超高壓技術提取牡蠣中的?；撬峋哂幸欢ǖ目尚行?可能具有增加提取效率、減少污染、節(jié)省成本等優(yōu)點。因此,利用超高壓技術提取牡蠣中的天然?；撬峋哂袕V闊的應用前景。
本研究擬采用超高壓技術對牡蠣中的?；撬徇M行提取,通過高效液相色譜法(HPLC)測定?；撬岷?從而確定超高壓最佳提取工藝,并與傳統(tǒng)熱水抽提取法進行比較。本研究將為新型技術在貝類?；撬崽崛≈械膽锰峁┣捌跀?shù)據(jù)和研究基礎。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
香港牡蠣 廣東省湛江市東風市場,新鮮剝殼后瀝干水分,-70 ℃冷藏;牛磺酸標準品 上海一基生物試劑有限公司(純度>97%);鄰苯二甲醛 特冠基化工貿(mào)易有限公司;β—巰基乙醇 北京索萊寶科技有限公司;甲醇 廣州市俱輝化工有限公司;乙腈 天津益仁達化工有限公司。
超高壓設備HPP.L2-600/0.6 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司;高效液相色譜儀島津LC-20AD型 日本島津公司;高速冷凍離心機 CR22GⅡ 上海玉研科學儀器有限公司;pH計 雷磁PHS-3C 上海儀電科學儀器股份有限公司;超低溫冷凍柜MDF-U53V 亞速旺(上海)商貿(mào)有限公司。
硼酸鈉緩沖溶液(0.4 mol/L):準確稱取2.48 g硼酸和1.41 g氫氧化鈉,用水溶解后定容至100 mL。衍生劑:準確稱取0.1 g鄰苯二甲醛,用10 mL甲醇溶解后,再加入0.1 mL的β-巰基乙醇,最后用0.4 mol/L的硼酸鈉緩沖溶液定容至100 mL。?；撬針藴嗜芤旱呐渲?1.000 mg/mL):精密稱取0.2500 g的?；撬針藴势?用水溶解后,移入250 mL的容量瓶中,并用水稀釋至刻度,搖勻。?；撬針藴适褂靡旱呐渲?0.01 mg/mL):吸取牛磺酸標準溶液1.00 mL于100 mL的容量瓶中,用水定容至刻度,搖勻。
1.2 超高壓提取
精密稱取牡蠣勻漿液并用超高壓袋分裝(每袋5.000 g),再按一定料液比向超高壓袋中加入蒸餾水,封口并搖勻(注意超高壓袋內(nèi)的空氣要排干凈),接著對牡蠣勻漿液進行超高壓處理,取出經(jīng)超高壓處理后的牡蠣勻漿液,在8000 r/min,4 ℃的條件下離心,取上清液待測。
1.3 單因素實驗
超高壓法提取?；撬峥赡芘c壓強、保壓時間、溫度以及料液比等因素相關,分別取這些因素的不同水平考察其對?；撬崽崛〉挠绊憽＞唧w選取水平值如下:
壓強的選擇:讓牡蠣勻漿液分別在50、100、150、200、250、300 MPa的壓強下進行處理,且此時保證溫度為20 ℃,保壓時間為20 min,料液比為1∶4。
保壓時間的選擇:讓牡蠣勻漿液分別在5、10、15、20、25、30 min的條件下進行超高壓處理,且此時保證溫度為20 ℃,壓強為200 MPa,料液比為1∶4。
溫度的選擇:讓牡蠣勻漿液分別在20、25、30、35、40、45 ℃的條件下進行超高壓處理,且此時保證壓強為200 MPa,時間為20 min,料液比為1∶4。
料液比的選擇:在牡蠣勻漿液中按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6的比例加入蒸餾水進行超高壓處理,且此時保證壓強為200 MPa、溫度為20 ℃、保壓時間為20 min。
1.4 正交實驗
根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,通過各個因素對于?；撬崽崛÷实挠绊?選擇最佳的單因素范圍,設計正交表,進行正交實驗,各因素水平見表1。
表1 因素水平
Table 1 The experimental factors and level
水平因素A溫度(℃)B料液比C保壓時間(min)D壓強(MPa)1351∶4202002401∶5252503451∶630300
1.5 水煮法提取
水煮法提取牡蠣中的牛磺酸參考王丹等[5]的方法,并稍作修改。準確稱取5.000 g的牡蠣勻漿液于50 mL的燒杯中,加入20 mL的蒸餾水。將燒杯置于60 ℃的水浴中蒸煮2 h。在蒸煮的過程中要不斷的用玻璃棒攪拌。之后待提取液冷卻后,在8000 r/min,4 ℃的條件下離心,取上清液備用。
1.6 ?；撬岷繖z測
本實驗采用高效液相色譜法測定?；撬岬暮縖6]。
1.6.1 高效液相色譜條件 進樣量:20 μL;流速:0.3 mL/min;柱溫:40 ℃;最高限壓:20 MPa檢測器波長:λEX:338 nm λEM:425 nm;流動相組成:甲醇∶乙腈∶水=1∶1∶8。
1.6.2 ?；撬針藴是€的制作 分別移取質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL的牛磺酸標準使用液0.10,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20 mL于2.0 mL的離心管中,用超純水稀釋至刻度,搖勻,得到了7個系列濃度的?；撬針藴势啡芤?再分別吸取1.0 mL的上述已經(jīng)稀釋的?；撬崛芤河诹硗庖粋€2.0 mL的離心管中,再準確加入事先配制好的鄰苯二甲醛溶液1.0 mL,混勻,衍生3 min后,經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾在2 mL的進樣瓶中[7],放入自動進樣器中,用高效液相色譜儀進行測定。以?；撬針藴势窛舛葹闄M坐標,峰面積為縱坐標,制作標準曲線。
1.6.3 牛磺酸檢測 分別取經(jīng)超高壓處理、水煮法處理的牡蠣上清液以及牡蠣樣品稀釋液0.5 mL到50 mL的比色管中,用蒸餾水定容至刻度并搖勻。取稀釋了10000倍的樣品液1 mL于2 mL的離心管中,再準確加入1 mL的衍生劑,混勻,衍生3 min后經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾在2 mL的進樣瓶中,放入自動進樣器中,用高效液相色譜儀進行測定,記錄峰面積。
1.6.4 精密度實驗 取400 μL已知質(zhì)量濃度為0.001 mg/mL的?；撬針藴势啡芤河? mL離心管中,用超純水定容至刻度,再取1.0 mL上述已稀釋的?；撬針藴势啡芤河?.0 mL的離心管中,加入1 mL的鄰苯二甲醛經(jīng)衍生3 min,通過0.45 μm的微孔濾膜過濾到2 mL的進樣瓶中進行測定。重復測定6次,記錄每一次的峰面積,通過計算?；撬岬臐舛?以相對標準偏差來度量儀器的精密度。
1.6.5 回收率測定 精密稱取5.000 g牡蠣樣品6份,分別在6份樣品中加入10.00、20.00、30.00、40.00、50.00、60.00 mg的?；撬針藴势?通過之前的單因素實驗已知在壓強300 MPa,溫度45 ℃,料液比1∶5,保壓時間25 min條件下處理牡蠣得到其牛磺酸含量為17.84 mg/g,故在此條件下處理牡蠣加標樣提取?；撬?用高效液相色譜檢測?；撬?計算牛磺酸的回收率。
1.6.6 ?；撬岷坑嬎?/p>
式中:X-試樣中?；撬岬暮?單位為毫克每克(mg/g);c-經(jīng)查圖和計算得進樣液中?；撬岬暮?單位為毫克每毫升(mg/mL);V2-試樣總的稀釋體積,單位為毫升(mL);V1-試樣的體積,單位為毫升(mL)。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素實驗結(jié)果
超高壓的原理就是利用超高壓使細胞的細胞膜破碎,從而使得細胞內(nèi)的物質(zhì)與溶劑結(jié)合,以達到提高目標產(chǎn)物提取率的效果,因此壓強是超高壓提取過程中一個重要的影響因素。從圖1可知牛磺酸的提取率,隨著壓強的增大而增大,當壓強達到250 MPa之后,?；撬岬奶崛×口呌谄椒€(wěn)。這是因為隨著壓強的增加,有效成分的傳質(zhì)速率不斷增加,細胞壁和細胞膜的破碎增加,從而使得?；撬岬奶崛×侩S著壓強的增加而增加,而當壓強超過250 MPa時,細胞的細胞膜和細胞壁已經(jīng)完全破碎,所以隨著壓強的增加?；撬岬奶崛×繘]有太大的變化。
圖1 壓強對?；撬崽崛×康挠绊慒ig.1 Effect of pressure on extraction of taurine
保壓時間長短與?；撬崽崛×康年P系,見圖2。保壓時間對有效成分的提取也十分重要,隨著保壓時間的增加,細胞內(nèi)溶物會不斷增加,但在一定壓強條件下,隨著時間的增加細胞內(nèi)溶物與周圍溶劑會逐漸達到平衡[8]。超高壓時間在10 min以內(nèi),對于牛磺酸提取量的影響很小,這可能是由于保壓時間過短,細胞膜還沒有被完全的破壞。從第10 min時開始?；撬崽崛×恐饾u上升,保壓時間在25 min之后其提取量則趨于平穩(wěn)。
圖2 保壓時間對?；撬崽崛×康挠绊慒ig.2 Effect of pressure-holding time on extraction of taurine
溫度與?；撬崽崛×康拇笮￡P系,見圖3。由圖可知,隨著溫度的升高,?；撬岬奶崛×坎粩嗟厣?當溫度到達40 ℃后,牛磺酸的提取量趨于平穩(wěn)。溫度對?；撬岬奶崛×恳伯a(chǎn)生了很大的影響,可能是由于牛磺酸是一種游離氨基酸,能夠溶于水,溫度的增加會使得?；撬岬奶崛×吭黾?。在孫利芹等人提取扇貝中?；撬岬膶嶒炛邪l(fā)現(xiàn)[9],溫度對?；撬岬奶崛∮兄@著的影響:在一定溫度范圍內(nèi),隨著溫度的升高,牛磺酸的提取量不斷增加。
圖3 溫度對?；撬崽崛×康挠绊慒ig.3 Effect of the temperatures on extraction of taurine
陳瑞占等[10]提取西洋參皂苷的研究中發(fā)現(xiàn)在提取的過程中,西洋參的溶質(zhì)濃度逐漸降低,而溶劑中的溶質(zhì)濃度逐漸增加,可見料液比在利用超高壓提取有效成分時起著重要作用。由圖4可知,隨著料液比的增加,?；撬岬奶崛×侩S之增加,當料液比為1∶4時牛磺酸提取量最高。
圖4 料液比對?；撬崽崛×康挠绊慒ig.4 Effect of material/liquid ration on extraction of taurine
表3 正交實驗的方差分析結(jié)果
Table 3 Results of variance analysis of orthogonal test
表4 精密度及穩(wěn)定性實驗結(jié)果(n=6)
Table 4 Results of instrument accuracy and stability analysis(n=6)
實驗號123456平均值相對標準偏差RSD(%)?；撬岷?mg)00039000370003900038000360003700038295
2.2 超高壓提取?；撬峁に嚨膬?yōu)化
根據(jù)正交實驗極差分析結(jié)果表明(表2),在已選定的溫度、液料比、保壓時間、壓強范圍內(nèi),影響牡蠣中牛磺酸提取得率的主次因素是壓強>溫度>料液比>保壓時間,各因素的最佳水平組合是A3B2C2D3,即壓強為300 MPa,溫度45 ℃,料液比為1∶5,保壓時間為25 min。由于最佳參數(shù)組合不在L9(34)正交實驗的組合內(nèi),故以最佳條件進行了驗證實驗,其得率為22.96 mg/g,說明該條件為超高壓提取牛磺酸的最優(yōu)條件。為了進一步檢驗正交實驗的有效性,對正交實驗數(shù)據(jù)進行方差分析,結(jié)果顯示與極差分析結(jié)果一致(表3),即壓強對?；撬岬牡寐视绊懽铒@著,其次為溫度,而料液比和保壓時間對?；撬岬牡寐视绊懖伙@著。
表2 L9(34)正交實驗結(jié)果和極差分析
Table 2 Results of range analysis and orthogonal test L9(34)
實驗號ABCD得率(mg/g)111111839212221882313332218421232176522311851623121769731321907832132289933211932K11980197419661874K21932200719971853K32043197319922228R111034031375
2.3 ?；撬岷繙y定結(jié)果
2.3.1 牛磺酸標準曲線的繪制 以?；撬針藴势窛舛葹闄M坐標,峰面積為縱坐標,得到?；撬針藴是€,如圖5所示。當牛磺酸濃度在0.0005～0.006 mg/mL范圍內(nèi),進樣濃度與峰面積呈良好的線性關系,回歸方程y=3109x+978380,相關系數(shù)R2=0.9927。
圖5 牛磺酸標準曲線圖Fig.5 Standard curve of taurine
圖6 ?；撬針藴势犯咝б合嗌V圖Fig.6 Chromatograms of taurine standard
圖7 牡蠣?；撬崛芤焊咝б合嗌V圖Fig.7 Chromatograms of oyster taurine sample
在牛磺酸標準曲線制作過程中,發(fā)現(xiàn)?；撬針藴势愤M樣會產(chǎn)生3個明顯的色譜峰,為了確定牛磺酸對應的保留時間,對所有標準液進樣后產(chǎn)生的三個色譜峰的峰面積進行了積分和分析,僅保留時間為12.8 min的色譜峰峰面積與濃度成線性關系,同時對比了單純衍生試劑的色譜峰,確認保留時間為12.8 min的色譜峰為?；撬?而雜峰是由于過量衍生劑未充分反應及雜質(zhì)所產(chǎn)生的。
2.3.2 精密度測定 如表4所示,相對標準偏差RSD=2.95%,說明采用高效液相色譜法檢測牛磺酸具有良好的精密度。
2.3.3 回收率結(jié)果 由表5可知6種加標回收率分別為90.98%～97.38%,平均回收率達到94.55%(RSD=2.66%),說明用超高壓法處理牡蠣回收率較好。
表5 方法加標回收率實驗結(jié)果
Table 5 Spike recoveries of the methods
序號123456本底值(mg/g)178417841784178417841784加標量(mg/g)20040060080010001200理論值(mg/g)198421842384258427842984回收率(%)949191999602909897389601平均回收率(%)9455相對標準偏差RSD(%)266
2.4 與水煮提取法比較結(jié)果
經(jīng)檢測,傳統(tǒng)的水煮提取法提取得到的牛磺酸為17.07 mg/g。由此可知,超高壓提取法效率要高于傳統(tǒng)的熱水提取法。
3 結(jié)論與討論
?；撬崾遣溉閯游镏幸环N重要的游離氨基酸,在中樞神經(jīng)以及肌肉中都起著重要的作用,而在我國具有高產(chǎn)量的牡蠣含有豐富的?；撬帷Ｄ壳?提取牡蠣中的?；撬岬姆椒ㄖ饕菬崴樘岱?此外有機溶劑抽提法,如乙醇抽提法,還常常利用超聲波等輔助手段來提高牡蠣中牛磺酸的提取量。但上述傳統(tǒng)的提取方法常常具有提取時間長,效率低下等缺點。Hyun-Sun Lee[11]等人同時采用超高壓技術和傳統(tǒng)的熱提取法來從人參中提取人參皂苷,結(jié)果表明超高壓能提高人參皂苷的提取量以及縮短提取時間。本實驗通過從料液比、溫度、壓強、保壓時間四個水平進行單因素實驗結(jié)合隨后的正交實驗得出超高壓法提取牡蠣的最佳工藝條件為壓強300 MPa,溫度45 ℃,液料比1∶5,保壓時間25 min,此時的牛磺酸提取量為22.96 mg/g,高于熱水抽提法得到的?；撬崃?17.07 mg/g)。
目前,檢測?；撬岬姆椒ㄏ鄬Ρ容^成熟,包括高效液相色譜法、紫外分光光度法、熒光法以及氨基酸自動分析法;其中高效液相色譜法的樣品預處理簡單,方法準確度、精確度及靈敏度較高,在測定食品和生物組織中?；撬岷康膽弥腥找鎻V泛[7]。本實驗采用的高效液相色譜法的精密度及穩(wěn)定性和回收率的RSD均在5%以內(nèi),證明實驗中采用的高效液相色譜法具有良好的穩(wěn)定性、精密度和回收率,能較準確的測定?；撬岬暮?。綜上所述,相對傳統(tǒng)的熱水抽提法來說,超高壓法能有效的從牡蠣中提取?；撬?可作為一種提取?；撬岬男路椒ā?/p>
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Process research of taurine extraction from oyster (Crassostreahongkongensis)by high hydrostatic pressure
XU Cheng,LU Hong-yu*,ZHANG Chao-hua,JIN Fei
(College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Guangdong Province Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing(Zhanjiang),South China Sea Bio-Resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center,Zhanjiang 524088,China)
Inthisstudy,HighHydrostaticPressure(HHP)wasusedtoextracttaurinefromoyster,thenthetaurinecontentweredeterminedbyHighPerformanceLiquidChromatography(HPLC),andtheresultsofHHPandHotWaterExtraction(HWE)werecompared.Resultsofthesinglefactorexperimentsshowedthatpressure,pressure-holdingtime,temperatureandsolid-liquidratiohadsignificantinfluenceontheextractionoftaurine.Orthogonaltestbasedontheresultsofthesinglefactorexperimentsshowedthattheoptimumconditionswerepressureof300MPa,pressure-holdingtimeof25min,temperatureof45 ℃,Solid-liquidratioof1∶5;andthecontentoftaurinewas22.96mg/gundertheoptimumconditionswhichwashigherthantheHWEextraction(17.07mg/g).
oyster;taurine;highhydrostaticpressure;HPLC
2016-04-21
徐成(1989-)，男，碩士，研究方向：水產(chǎn)品高值化加工與利用，E-mail:paulxuxu@hotmail.com。
*通訊作者:盧虹玉(1976-)，女，博士，研究方向：海洋活性物質(zhì)研究與開發(fā)，E-mail:41751678@qq.com。
國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-48-07B)。
TS254.1
B
1002-0306(2016)19-0192-05
10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.029
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