杏鮑菇多糖PEP-2的結構表征及其對肝癌細胞HepG-2抑制作用的研究

姜艷紅,張玲帆,呂 瑛,湯 曦,任道遠

(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院,食品科學與工程專業(yè),陜西西安 710119)

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杏鮑菇多糖PEP-2的結構表征及其對肝癌細胞HepG-2抑制作用的研究

姜艷紅,張玲帆,呂 瑛,湯 曦,任道遠*

(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院,食品科學與工程專業(yè),陜西西安 710119)

目的:研究杏鮑菇多糖(Pleurotuseryngiipolysaccharides)的結構表征及抗腫瘤活性。方法:杏鮑菇多糖經(jīng)過DEAE-52纖維素和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析分離純化,得到一種杏鮑菇多糖組分PEP-2。采用高效液相色譜(HPLC)法測定了PEP-2的單糖組成及分子量。采用MTT法檢測了PEP-2對肝癌細胞HepG-2存活率的影響。通過DAPI染色對HepG-2細胞形態(tài)進行觀察。結果:HPLC分析表明PEP-2是主要由葡萄糖組成的雜多糖,PEP-2的分子量為4.63×105u。對HepG-2抗腫瘤研究活性研究表明高分子量的PEP-2有很強的抗腫瘤活性。DAPI染色結果顯示沒有處理的細胞大而且圓,并沒有出現(xiàn)核質濃縮及核仁破碎現(xiàn)象,而PEP-2處理的細胞大部分出現(xiàn)核質濃縮核仁破碎的現(xiàn)象。結論:本研究為開發(fā)杏鮑菇多糖作為預防腫瘤的保健食品提供了新的理論依據(jù)。

杏鮑菇,多糖,純化,抗腫瘤,凋亡

多糖又稱多聚糖(polysaccharides),由10個以上單糖殘基通過糖苷鍵連接而成,廣泛存在于植物、動物和微生物中[1]。多糖是近年來科學研究的熱點之一,目前已經(jīng)從靈芝[2]、黑木耳[3]、茯苓[4]、山藥[5]、蘆薈[6]、銀杏[7]、人參[8]、當歸[9]和枸杞[10]等食用菌以及中藥中分離出了活性多糖。而食用菌多糖的研究近年來也逐漸走入人們的視野,我國的食用菌生產(chǎn)遍布全國各地,在食品工業(yè)[11]、發(fā)酵工業(yè)[12]及醫(yī)藥領域[13]上有著廣泛的應用。目前國內外已對多種食用菌,比如香菇[14]、銀耳[15]、冬蟲夏草[16]、靈芝[2]、黑木耳[3]、蜜環(huán)菌[17]等進行了多糖的提取純化、分離鑒定及功能性方面的研究。

杏鮑菇(Pleurotuseryngii),生長于典型的亞熱帶草原干旱的沙漠地區(qū),是腐生或者兼性寄生于大型傘型花科植物的根上和四周土中的野生食用菌,這些植物有刺芹、阿魏、拉瑟草等,杏鮑菇子實體通常中等偏大,菌肉為白色,質地肥嫩,有杏仁味。杏鮑菇學名刺芹側耳,具有降血脂、降血壓、降低膽固醇和增強肌體免疫力等功效[18]。杏鮑菇作為藥食兩用的食用菌,有著非常廣闊的應用前景。研究表明杏鮑菇富含維生素、礦物質以及可以降血壓血脂、降低膽固醇和抗衰老的多糖,是營養(yǎng)保健價值極高的食用菌[19]。另外,有研究表明,杏鮑菇的水溶性多糖能有效地提高肝損傷小鼠的抗氧化酶活性、清除自由基,進而降低高脂肪小鼠的總膽固醇、總甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇水平,同時增加高密度脂蛋白膽固醇水平[20-22]。但是,目前國內外對于杏鮑菇多糖的分離純化以及抗腫瘤活性方面都鮮有報道。

本研究采用本實驗室較為成熟的熱水提取的方法,來對杏鮑菇粗多糖(PEP)進行初提取。再經(jīng)過多糖的除蛋白以及脫色處理之后,利用HPLC-UV初步分析其單糖組成,并檢測其抗氧化能力的強弱。然后采用MTT法檢測了PEP-2對肝癌細胞HepG-2存活率的影響,并通過DAPI染色對HepG-2細胞形態(tài)進行了研究,為開發(fā)杏鮑菇多糖作為預防腫瘤的保健食品提供了新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏鮑菇 西安華潤萬家超市;DEAE-52纖維素 Solarbio公司;Sephadex G-100 Pharmacia公司;標準葡聚糖、D-甘露糖(Man)、D-核糖(Rib)、L-鼠李糖(Rha)、D-葡萄糖醛酸(GlcUA)、D-半乳糖醛酸(GalUA)、D-葡萄糖(Glc)、D-木糖(Xyl)、D-半乳糖(Gal)、L-阿拉伯糖(Ara)、D-巖藻糖(Fuc)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) 美國Sigma公司;甲醇、乙腈均為色譜純 美國Honeywell公司;RPMI 1640 Grand Island,USA;胎牛血清FBS Woodland,USA;乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒 上海貝博公司;氟尿嘧啶(5-Fu) 上海潤成生物科技有限公司。

Shimadzu LC-2010A高效液相色譜儀、Shimadzu Class-VP6.1色譜工作站 日本島津公司;Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司;RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;FACSCalibur流式細胞儀 美國BD公司;IX71倒置熒光顯微鏡 Nikon公司;ESCO生物安全柜、ESCO CO2培養(yǎng)箱 新加坡ESCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杏鮑菇多糖的提取與精制 提取方法根據(jù)參考文獻[23]的方法并稍加改動,杏鮑菇經(jīng)粉碎機粉碎、稱取200 g勻漿置于圓底燒瓶中,加入1000 mL乙醇脫脂。取脫脂后的杏鮑菇組織100 g于燒瓶中,加入10倍體積蒸餾水,80 ℃水浴,回流提取4 h,過濾。重復提取一次,合并濾液并濃縮至300 mL,加四倍體積無水乙醇,放置冰箱過夜,重復兩次。離心,棄去乙醇,沉淀加水溶解,采用反復凍融10次除蛋白[23],而后透析2 d,每天換3次水,冷凍干燥,即得杏鮑菇多糖樣品。

1.2.2 PEP的分離純化 杏鮑菇多糖參照文獻[24]的方法純化。取粗多糖0.3 g溶于蒸餾水10 mL中,離心,上清液經(jīng)DEAE-52型纖維素柱層析分離,依次用蒸餾水,0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液洗脫,體積流量為1 mL/min,DBS-100型收集器進行收集,每管8 mL,苯酚-硫酸法檢測,收集各組分洗脫液,減壓濃縮后冷凍干燥。主峰多糖組分0.1 mol/L NaCl溶液洗脫所得組分,命名為P-2,取P-2 30 mg溶于蒸餾水5 mL中,離心,上清液再經(jīng)Sephadex G-100 型凝膠柱層析純化,蒸餾水為洗脫液,體積流量為0.3 mL/min,每管收集3 mL,苯酚-硫酸法檢測,收集洗脫液。冷凍干燥得到多糖PEP-2。

1.2.3 HPLC-UV分析PEP-2的單糖組成 參考文獻[23]。

1.2.3.1 對照品溶液的制備 精確稱取一定量的10種單糖分別用10 mL的10%甲醇溶液配成0.1 mol/L的母液,然后取適量的各種母液梯度稀釋為5個不同濃度的系列單糖溶液,備用。用PMP對樣品衍生化,取系列單糖溶液各10 μL,充分混合后共100 μL,依次加入200 μL 的PMP甲醇溶液(0.5 mol/L)和300 μL 的NaOH溶液(0.3 mol/L)?；靹蚝?在70 ℃下水浴反應1 h,冷卻至室溫后,加入300 μL 的HCl溶液(0.3 mol/L),充分震蕩。然后再用氯仿萃取:加入氯仿2.0 mL,充分震蕩后,3000 r/min下離心2 min,用細針頭取掉有機相,重復操作3次。取水相稀釋到適當?shù)臐舛?并過0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液備用。

1.2.3.2 供試品溶液的制備 配制3.0 mol·L-1的TFA,量取2.0 mL放置在安培瓶中,再將準確稱取的10 mg PEP-2充分溶解于TFA,安瓿瓶充氮氣封口。樣品在90 ℃水解8 h,冷卻,1000 r/min,離心5 min,上清液轉至5.0 mL圓底燒瓶,減壓濃縮,蒸干后用1.0 mL超純水溶解,得多糖水解液。取水解液樣品100 μL,按“1.3.3.1”項下PMP衍生化方法制備PMP標記物。

1.2.3.3 HPLC色譜條件 采用梯度洗脫方式,色譜條件:流動相A:純乙腈;流動相B:0.45 g KH2PO4、0.45 mL TEA、100 mL乙腈和900 mL超純水組成,調pH至7.5。色譜柱:Venusil C18柱(250 mm×4.6 mm id,5 μm);梯度洗脫:0～5 min 91%B洗脫,5～15 min 91%～90% B洗脫,15～25 min 90% B洗脫,25～30 min 90%～88% B洗脫。進樣量20 μL,流速1.0 mL/min,檢測波長為250 nm,柱溫為35 ℃。

1.2.4 PEP-2的純度和相對分子質量測定 采用HPLC對PEP-2進行純度鑒定。稱取PEP-2適量,配置2 mg/mL質量濃度多糖溶液,進行HPLC分析。色譜條件:Waters1525型高效液相色譜系統(tǒng),色譜柱為Shodex Ohpak SB-804 HQ,流動相為超純水,體積流量為0.8 mL/min,Waters2414型示差折光監(jiān)測器,柱溫30 ℃,進樣量為20 μL,以洗脫峰的保留時間為橫坐標,已知葡聚糖標品相對分子質量的對數(shù)值為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.5 紫外吸收光譜(UV)分析 利用紫外吸收光譜的原理[25],準確稱取PEP-2,10 mg,定容10 mL,得到濃度為1 mg/mL的多糖溶液,以蒸餾水作為空白,以200～900 nm為掃描范圍,進行全波長的掃描。

1.2.6 紅外波譜(IR)分析 根據(jù)文獻[25],稱取一定量的PEP-2,加入適量的KBr研磨混均壓片,進行IR掃描,利用BRUKER EQUINOX55型紅外光譜儀,4000～500 cm-1范圍掃描,以KBr 為掃描背景。

1.2.7 MTT法檢測細胞增殖 參照文獻[24]操作取對數(shù)生長期細胞,用新鮮培養(yǎng)基制成細胞懸液,接種在96孔培養(yǎng)板中,調濃度至約1×105個/mL。每孔加90 μL,置于恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后分別加入10 μL濃度梯度的多糖樣品溶液,使終濃度為50、100、200 μg/mL(陽性對照為5-Fu 100 μg/mL,陰性對照為10 μL的生理鹽,分別加10 μL)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,每孔分別加入20 μL MTT(5 mg/mL),培養(yǎng)4 h,最后加入SDS終止反應,在CO2細胞培養(yǎng)箱中放置過夜后,用酶標分析儀在570 nm處測定吸光值,每個處理設置三個重復實驗。

細胞存活率的計算公式:細胞存活率(%)=1-(對照孔A570-實驗孔A570)/對照孔A570×100。

1.2.8 LDH法檢測細胞毒性 細胞前期處理同“1.2.7”,區(qū)別在于,細胞懸液的濃度調至約2×105個/mL,接種于6孔培養(yǎng)板,每孔900 μL,置于CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后,棄去培養(yǎng)液,分別加入900 μL新鮮培養(yǎng)液和100 μL濃度梯度的PEP-2樣品溶液,使終濃度為50、100、200 μg/mL(陽性對照為5-Fu 100 μg/mL,陰性對照為10 μL的生理鹽,分別加10 μL)。緩慢晃動培養(yǎng)板,使樣品溶液與培養(yǎng)液充分混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后吸取細胞培養(yǎng)液,使用乳酸脫氫酶(LDH)檢測[26]試劑盒進行實驗。并按照以下公式計算PEP-2的細胞毒性:

細胞毒性計算公式:LDH活性(U/L)=(測定孔A450-對照孔A450)/(標準孔A450-空白孔A450)×標準濃度×樣品測試前稀釋倍數(shù)×1000。

1.2.9 DAPI染色觀察細胞形態(tài) 取對數(shù)生長期的HepG2細胞,使用胰酶消化細胞之后,用培養(yǎng)液將細胞重懸。于每孔1×105/mL個細胞,將細胞懸浮液加入有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)細胞24 h。帶細胞貼壁之后,加入100 μg/mL的PEP-2(細胞存活實驗以及細胞毒性實驗中篩選出的抗腫瘤作用較強的多糖組分)進行藥物處理,作用的時間分別為0、6、12、24 h。倒掉上清液,用PBS緩沖液清洗3次。用4%的多聚甲醛固定30 min,PBS緩沖液洗滌細胞之后,再加入DAPI染色避光孵育30 min,最后再用PBS緩沖液洗滌。將細胞培養(yǎng)板放置于倒置熒光顯微鏡下檢測,紫外激發(fā)。

2 結果與分析

2.1 PEP的DEAE-52純化結果

如圖1所示,圖1所示為杏鮑菇多糖經(jīng)DEAE-52柱層析純化的結果。洗脫液分別采用0、0.05、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl 溶液梯度洗脫,圖中所示,得到三個單一的洗脫峰。0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl 溶液洗脫得到的組分極少,幾乎沒有洗脫峰。其中蒸餾水和0.05 mol/L NaCl 濃度溶液洗脫峰面積最大,為主要洗脫峰。本研究僅對0.05 mol/L NaCl洗脫液洗脫所得組分進一步純化,做深入研究。收集0.05 mol/L NaCl洗脫液洗脫部位,減壓蒸餾,透析(分子截留量10000 u)3 d,每天換水4次,冷凍干燥,得組分P-2。

圖1 PEP的DEAE-52柱層析圖Fig.1 Eluting curve of PEP on DEAE-52 column

2.2 G-100葡聚糖凝膠純化結果

杏鮑菇多糖經(jīng)過DEAE-52柱層析純化后得到較多的一個組分P-2,進一步進行G-100葡聚糖凝膠層析柱層析,結果如圖2。由圖2可知,P-2的G-100葡聚糖凝膠柱層析得到的兩個洗脫峰,收集較大的洗脫峰,命名為PEP-2,以便于后續(xù)實驗中區(qū)分。

圖2 PEP-2的葡聚糖凝膠柱層析圖Fig.2 Elution curve of PEP-2 on Sephadex G-100 column

2.3 PEP-2的單糖組成分析

如圖3,A圖為標品的洗脫曲線,B圖為多糖組分PEP-2的洗脫曲線。由圖中分析可得出結果:

結果顯示,組成PEP-2的單糖為甘露糖(mannose)、葡萄糖(glucose)以及半乳糖(galactose)三種,他們的摩爾百分比為10.92%:78.60%:10.48%。

圖3 PMP衍生化的HPLC-UV色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms based on percolumn derivatization with PMP注：A:PMP標記的10種單糖標品的HPLC色譜圖；B:PMP標記的PEP-2的HPLC色譜圖；1.D-甘露糖(Man)；2.D-核糖 (Rib)；3.L-鼠李糖(Rha)；4.D-葡萄糖醛酸(GlcUA)；5.D-半乳糖醛酸(GalUA)；6.D-葡萄糖(Glc)；7.D-木糖(Xyl)；8.D-半乳糖(Gal)；9.L-阿拉伯糖(Ara)；10.D-巖藻糖(Fuc)。

2.4 PEP-2分子量測定結果

如圖4所示,PEP-2在HPLC中呈現(xiàn)單一對稱尖峰,表明其為均一多糖。根據(jù)標準葡聚糖系列Dextran T-2000、T-500、T-70、T-40、T-10制作標準曲線:lgMw=-0.3812tR+8.4449，R2=0.9914。其中Mw為重均相對分子質量,tR為保留時間(min)。根據(jù)HPLC的保留時間tR7.200 min。代入回歸方程中,計算得多糖PEP-2的相對分子質量為463396 u。

圖4 PEP-2的高效液相色譜圖Fig.4 The HPLC spectrogram of PEP-2

2.5 紫外掃描(UV analysis)結果

PEP-2的紫外光譜全波長掃描如圖5所示,在200 nm和204 nm處有多糖的特征吸收峰;在260 nm和280 nm處并無吸收,則說明PEP-2均不含核酸和蛋白質。

圖5 PEP-2紫外掃描圖譜Fig.5 The UV scanning spectrum of PEP-2

2.6 紅外波譜掃描(IR analysis)

PEP-2的紅外光譜從400～4000 cm-1,如圖6所示,PEP-2含有典型的多糖的特征吸收峰,在3424、2937、2788、2704、1627、1384、1352、1074、760、618 cm-1等處呈現(xiàn)吸收帶,在3424 cm-1處有較強的羥基O-H振動[27],在2788等處有較弱的CH3,CH2,CH的伸縮振動[25],在波數(shù)1627 cm-1處有C=O非對稱的伸縮振動峰,在波數(shù)1074、760、618 cm-1處有吸收帶的情況,可推測是吡喃環(huán)型的多糖[28],其中1074處的吸收峰是吡喃環(huán)內酯與羥基的吸收產(chǎn)生的[25]。

圖6 PEP-2紅外掃描圖譜Fig.6 IR of PEP-2

2.7 細胞存活率測定結果

如圖7所示為杏鮑菇一種多糖組分PEP-2作用于人體肝癌細胞HepG2細胞24 h后細胞存活率的變化情況。由圖中可以看出,在作用于HepG2細胞24 h之后,在PEP-2濃度為50 μg/mL時,HepG2細胞存活率為78%(p<0.05),相較于較陰性對照下降了22%,當濃度上升到100 μg/mL時,細胞存活率下降至58%(p<0.05),當濃度超過100 μg/mL時,細胞存活率為46%(p<0.05),對比陰性細胞下降了44%,由此可得,樣品PEP-2對HepG2細胞的抑制作用隨著濃度的增加有顯著的變化,結果表明,PEP-2對人體肝癌細胞HepG2存活率有明顯的抑制,作用顯著(p<0.05),存在明顯的量效關系。

圖7 PEP-2對HepG2細胞的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of PEP-2 on HepG2 cell proliferation注：“**”表示與對照組比有顯著差異(p<0.05),圖8同。

2.8 細胞毒性分析結果

圖8所示為杏鮑菇一種多糖組分PEP-2作用于人體肝癌細胞HepG2細胞24 h后,細胞外乳酸脫氫酶LDH釋放量的檢測結果。如圖所示,多糖PEP-2的濃度為50 μg/mL濃度范圍內時,胞外LDH的活性隨著多糖組分濃度的增大而增大,PEP-2增加的趨勢明顯,但當濃度逐漸增大時,PEP-2的細胞毒性作用依然隨著濃度的上升而增大,PEP-2濃度為100 μg/mL時,HepG2細胞產(chǎn)生了256 U/L的釋放量(p<0.05),當繼續(xù)增大PEP-2濃度為200 μg/mL時,HepG2細胞產(chǎn)生了425 U/L的釋放量(p<0.05)。結果顯示,PEP-2對人體肝癌細胞HepG2有較強的細胞毒性作用,并呈現(xiàn)量效依賴的關系。這與2.7中MTT的結果是吻合的。

圖8 PEP-2對HepG2細胞乳酸脫氫酶釋放的影響Fig.8 Effect of PEP-2 on LDH release in HepG2 cells

2.9 細胞形態(tài)學變化

圖9為倒置熒光顯微鏡下觀察到的細胞形態(tài)變化。經(jīng)DAPI染色后,細胞核染成藍色。對照組細胞數(shù)量較多且形態(tài)規(guī)則,而PEP-2處理6 h細胞即出現(xiàn)了細胞皺縮或者不規(guī)則的形態(tài)。隨著時間的增長,可以明顯的從圖中看出,在經(jīng)過處理12 h之后,細胞出現(xiàn)了染色質凝集,核碎裂和凋亡小體等細胞凋亡的典型特征,PEP-2處理24 h之后,藥物處理時間更長,細胞死亡現(xiàn)象普遍,貼壁細胞數(shù)量越少。由此,細胞形態(tài)學結果顯示,PEP-2引起的HepG2細胞死亡屬于細胞凋亡。

圖9 DAPI染色觀察PEP-2對HepG2細胞形態(tài)影響Fig.9 Inverted microscope morphological characteristics of HepG2 cells treated with PEP-2

3 結論與討論

蘑菇是一種藥食兩用的真菌,大量的研究表明不同種類的蘑菇均具有良好的抗腫瘤活性[29]。多糖是蘑菇中最有效的活性成分,具有抗腫瘤及免疫調節(jié)活性[24]。長期以來,多糖的相對分子質量大小被公認為會影響多糖的抗腫瘤活性。人們普遍認識到,分子量和單糖組成是兩個影響天然多糖抗癌活性的重要因素[22]。事實上,一些蘑菇多糖已開始進入人類臨床評估階段[30-31]。1985年,分子量為5×105u的香菇多糖在日本被批準并產(chǎn)生作為輔助劑治療癌癥[31]。

在本研究中,用DEAE-52陰離子交換柱和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析分離,將杏鮑菇粗多糖進一步分離得到分子量為4.63×105u的高分子量組分PEP-2。單糖分析表明,PEP-2均主要由78.60%摩爾百分比的葡萄糖組成。在體外抗腫瘤活性實驗中我們發(fā)現(xiàn)高分子量的PEP-2對HepG-2細胞表現(xiàn)出顯著的高抗腫瘤活性,這表明分離純化可以篩選出杏鮑菇多糖的抗腫瘤活性高的組分。PEP-2良好的抗腫瘤活性使之有潛力成為新穎且有效的癌癥的預防劑。

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Chemical characterization ofPleurotuseryngiipolysaccharide PEP-2and its tumor-inhibitory effects against human hepatoblastoma HepG-2 cell

JIANG Yan-hong,ZHANG Ling-fan,LV Ying,TANG Xi,REN Dao-yuan*

(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi'an 710119,China)

Objective:ThisstudywasdesignedtoinvestigatethechemicalcharacterizationandantitumoreffectsofPleurotus eryngiipolysaccharides(PEP).Method:Anovelwater-solublePEPwaspurifiedfromP. eryngiibyCelluloseDEAE-52andSephadexG-100chromatographytogetonefractions,namelyPEP-2.ThemonosaccharidescompositionandmolecularweightofPEP-2wasanalyzedbyHPLC.ColorimetricMTTassaywasperformedtoassesscellviabilityofHepG-2cellstreatedwithPEP-2.ThechangeinHepG-2cellnormalmorphologywasobservedbyDAPIstaining.Result:HPLCanalysisshowedthatPEP-2washeteropolysaccharidesmainlycomposedofglucosewiththeaveragemolecularweightsof4.63×105u.TheantitumoractivitiesofthepolysaccharidesagainsthumanhepatoblastomaHepG-2cellswerestudiedin vitro,andPEP-2showedstronggrowthinhibitionagainstHepG-2cells.DAPIstainingshowedthatthenucleusofuntreatedcontrolcellswaslargeandroundwithoutcondensationorfragmentation,whereasthenucleusfromthePEP-2treatedcellswascondensedandfragmented.Conclusion:ItwasamajorbreakthroughbringingnewinsightofthepotentialuseoftheP. eryngiipolysaccharidesashealth-carefoodtoprovidesignificantnaturaldefenseagainsthumancancer.

Pleurotus eryngii;polysaccharide;purification;anti-proliferation;apoptosis

2016-03-21

姜艷紅 (1993-)，女，本科生，研究方向：食品功能與營養(yǎng)研究，E-mail：1273544966@qq.com。

*通訊作者:任道遠 (1988-)，男，博士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)化學研究，E-mail：dyren@snnu.edu.cn。

國家自然科學基金項目(C31171678)；大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510718020)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)19-0111-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.013