豬流行性腹瀉病毒相關(guān)研究報告帶來的啟示

陳基萍，方奎，曹維維，趙松，張從林

（廣西揚翔養(yǎng)豬事業(yè)部，廣西貴港537100）

豬流行性腹瀉病毒相關(guān)研究報告帶來的啟示

陳基萍，方奎，曹維維，趙松，張從林

（廣西揚翔養(yǎng)豬事業(yè)部，廣西貴港537100）

隨著冬季的到來，天氣轉(zhuǎn)冷，晝夜溫差大，腹瀉疾病發(fā)生率越來越高。為了更好地預(yù)防仔豬腹瀉減少經(jīng)濟損失，筆者歸納整理了當(dāng)前有關(guān)豬流行性腹瀉研究進展，并結(jié)合多年來在腹瀉疾病防控方面的經(jīng)驗，撰寫此文，期望能夠在豬流行性腹瀉防控方面給大家提供借鑒和參考。

1 PED的流行病學(xué)研究

1.1 PED流行情況

豬流行性腹瀉（PED）是由甲型冠狀病毒屬的冠狀病毒（Alpha冠狀病毒）引起的，是豬的主要腸道疾病之一，可造成重大的經(jīng)濟損失。1971年，英國首次報道了豬流行性腹瀉病毒（PEDV），1978年該病在比利時和英國暴發(fā)期間得到病原鑒定[1]。此后，亞洲和歐洲都有該病發(fā)生的報道[2]。

在中國，PED的流行可能開始于20世紀(jì)70年代，但最終確定流行卻是在十年后的1984年[3]。到2011年，PED已經(jīng)在中國豬場流行了20多年。繼20世紀(jì)90年代初暴發(fā)仔豬腹瀉后，2011年春，中國暴發(fā)了嚴重的由TGEV和PEDV混合感染導(dǎo)致的新生仔豬腹瀉。然而，通過RT-PCR診斷證實，PEDV為2011年腹瀉暴發(fā)的優(yōu)勢病原體，PEDV感染導(dǎo)致7日齡內(nèi)仔豬的死亡率高達60%～100%[4]。

2013年5月17日，美國首次從豬中分離到PEDV，且該病迅速蔓延到美國大部分地區(qū)[5]。截至2014年4月底，美國已有30個州報告了PED的流行。PED的出現(xiàn)對美國養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了重大的經(jīng)濟損失，有證據(jù)顯示，PED出現(xiàn)后的一年內(nèi)美國損失了大約400萬～500萬頭仔豬[2]。

在秘魯，PED被認為是一種外來的疾病，因為沒有證據(jù)表明秘魯原先存在PEDV[6]。然而，2014年，利馬地區(qū)有5個豬場出現(xiàn)了21日齡以內(nèi)的仔豬水樣腹瀉、嘔吐和嚴重脫水，發(fā)病率和死亡率幾乎達100%，懷疑是由PEDV所致。至此，秘魯養(yǎng)豬場也出現(xiàn)了PEDV感染情況。

自2014年初，烏克蘭就已經(jīng)出現(xiàn)多例PEDV感染病例[7]。由于烏克蘭國內(nèi)政治經(jīng)濟局勢錯綜復(fù)雜，直到2014年12月，烏克蘭才正式宣布國內(nèi)存在PED。PED的流行使得烏克蘭2014年和2015年的豬肉產(chǎn)量減少。跟烏克蘭接壤的一些鄰國如波蘭、斯洛伐克、匈牙利和羅馬尼亞目前正密切關(guān)注PED疫情，防止疫情傳入國內(nèi)。烏克蘭目前并不是重要的豬肉生產(chǎn)和出口國。不過，專家預(yù)測PEDV在烏克蘭暴發(fā)之后有可能傳入歐盟，導(dǎo)致3 000萬～5 000萬頭豬只死亡，這對全球的生豬數(shù)量具有重要影響。

韓國農(nóng)村經(jīng)濟研究院（KREI）報道稱，2014年初，有19%的受訪韓國豬場存在PEDV感染[7]。PED的暴發(fā)導(dǎo)致受訪豬場的仔豬數(shù)量減少25%。KREI以此預(yù)計，2014年韓國全國有5.8%～7%的仔豬因感染PED而死亡。不過，KREI也指出，PEDV的影響略小于一些分析師的擔(dān)心。2015年，韓國的PED疫情嚴重程度將有所緩解。

2014年12月中旬，日本宮崎縣的9家豬場被確診有PEDV感染[7]。當(dāng)?shù)孬F醫(yī)衛(wèi)生部門要求豬場做好車輛進出豬場時的消毒工作，同時對飼料倉庫、養(yǎng)豬人員的工作服和鞋靴等也要做好徹底的消毒工作。而就在2015年1月初，宮崎縣又有3家豬場確診PEDV感染。PEDV目前已經(jīng)進一步傳到北部的秋田縣。此外，2014年12月，千葉縣的2家豬場也被確診有PEDV感染。

2015年1月初，荷蘭和德國的豬場出現(xiàn)了溫和型PEDV感染病例[7]。不過，目前尚無該PEDV毒株引起死亡的病例，僅部分肥育豬有腹瀉癥狀。

1.2 PEDV的傳播模式

Hesse等[8]給4周齡豬口鼻接種PEDV后，研究PEDV的組織定位、排毒方式、攜帶、抗體應(yīng)答和氣溶膠傳播等。結(jié)果顯示，接種后2天豬出現(xiàn)輕微的臨床癥狀，8天后癥狀消失；接種組在接種48小時后，糞便拭子和鼻拭子的PCR檢測為陽性，糞便排毒高峰期出現(xiàn)在攻毒后的5～6天，并且顯著高于鼻內(nèi)排毒量；接種14天后，采集欄舍內(nèi)環(huán)境樣品，結(jié)果顯示，接種組和氣溶膠組的墻壁、豬欄、食槽中均有大量的病毒核酸；接種21天后，大部分豬的糞便拭子和鼻拭子檢測都為陰性，有些豬的排毒時間可持續(xù)到接種后35天；盡管可以在一些豬的鼻腔和唾液中檢測到PEDV核酸，但是氣溶膠組并沒有出現(xiàn)大量的傳染，說明沒有發(fā)生氣溶膠傳播。經(jīng)免疫組化（IHC）檢測，鼻甲、氣管、肺、支氣管淋巴結(jié)、脾臟和其他內(nèi)臟組織均為PEDV陰性。

Greiner等[9]對12個農(nóng)場進行為期30天的環(huán)境樣品采集，采樣區(qū)包括：換鞋區(qū)、午餐袋更換桌和紫外線窗戶、淋浴室骯臟的區(qū)域、午餐桌和冰箱把手以及冰箱內(nèi)部。結(jié)果顯示，在感染PEDV的5個農(nóng)場中，有4個農(nóng)場在出現(xiàn)臨床癥狀之前的3天或更早的時間就有疑似陽性或者陽性反應(yīng)，另一個豬場直到臨床發(fā)病才有陽性結(jié)果出現(xiàn)，表明在臨床癥狀出現(xiàn)之前48小時病毒就以較低水平存在于采樣區(qū)，而且在出現(xiàn)臨床癥狀之前通過各種設(shè)施傳播擴散到整個區(qū)域（表1）。

表1 臨床癥狀出現(xiàn)之前環(huán)境標(biāo)本的一些發(fā)現(xiàn)

這些研究證明了在病毒傳入農(nóng)場之后，農(nóng)場飼養(yǎng)員根據(jù)臨床癥狀做出診斷時已延遲了24～48小時。

Thomas等[5]調(diào)查手動清除類似家畜拖車金屬表面的糞便等有機物后，使PEDV滅活所需的時間和溫度的組合。當(dāng)貨車不能進行清洗和消毒時，時間和溫度的組合可以成為替代選項。對8組不同時間和溫度的組合進行評價發(fā)現(xiàn)，71C-10M和20C-7D組與陽性對照組相比有顯著不同（P=0.028 6）。當(dāng)使用P＜0.05作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)時，其他處理組和陽性對照組之間無顯著差異。結(jié)果表明，通過加熱拖車到71℃10分鐘或?qū)⑼宪囋谑覝兀?0℃）放置至少7天，能夠使糞便中PEDV失活。而其他時間和溫度的組合被證明不能有效滅活PEDV（表2）。

表2 不同處理組PEDV活性檢測結(jié)果

這個調(diào)查并不建議將其作為取代徹底清洗、消毒并干燥拖車的方案。相反，這個研究是想強調(diào)當(dāng)沒有條件進行沖洗、消毒時，這個方法是用來降低PEDV在豬群之間傳播的替代方法。

1.3 PEDV的遺傳變異

2012—2014年，Li等[4]在中國東部沿海收集所有疑似PED腹瀉豬場的糞便和腸道樣品。使用RT-PCR方法檢測病毒基因，包括PEDV M基因、TGEV M基因和PRoV vp7基因。從杭州β獸醫(yī)診斷實驗室（β VDL）數(shù)據(jù)庫提取疫情流行數(shù)據(jù)并進行進一步分析。

總的來說，PEDV仍然是導(dǎo)致新生仔豬病毒性腹瀉的主要病原體。然而，RT-PCR檢測結(jié)果表明，PEDV和PRoV的陽性率每年均有所提高（圖1）。值得注意的是，豬輪狀病毒檢出率越來越高，這一趨勢可能與過度使用返飼來阻止PED暴發(fā)存在一定的聯(lián)系。

圖1 2012—2014年中國豬場病毒性腹瀉的感染情況

2015年，馮力[10]對來自8個省份30個豬場的86份臨床樣品進行檢測，結(jié)果顯示，有17個豬場檢測出了PEDV，占總數(shù)的56.67%。86份被檢測的病料中，有57份病料感染了PEDV，占病料總數(shù)的66.27%；有22份病料感染了TGEV，占病料總數(shù)的25.58%；有10份病料感染了PRoV，占病料總數(shù)的11.63%。PEDV在我國的豬腹瀉病病原中依然占主導(dǎo)地位。此外，還檢測到了一種新型冠狀病毒—德爾塔冠狀病毒（SDCV），檢出率為13.99%，它的序列與香港或美國的毒株相近。

在國外，Chen等[11]從2013年10月至2014年2月，對通過實時RT-PCR確診為PEDV陽性的120例樣品PEDV S1基因（保護性抗原的第1個2.2 kb基因序列）進行測序，并將這些序列與GenBank中2013年5月和6月收錄的10株P(guān)EDV美國毒株和216株P(guān)EDV非美國毒株進行比對。結(jié)果顯示，其中106例的核酸序列相似度達99.0%～100%。相反，僅有14例與美國原始毒株的核酸序列相似度達92.4%～93.8%，這14株彼此之間的相似度達99.6%～100%（被命名為美國變異毒株）。將S基因的全長序列或部分序列進行遺傳進化分析，結(jié)果表明，美國變異株與中國報道的某些PEDV毒株是同一個群的，而與美國原始株之間的親緣關(guān)系較遠。當(dāng)用全基因組序列時，變異株與美國原始株之間的距離仍然較遠，但是其與美國原始株之間的親緣關(guān)系要比單純比較S1基因或S基因時的親緣關(guān)系近。

秘魯自報道出現(xiàn)PEDV感染后，對PEDV陽性樣品進行測序，以便確定病毒的起源及其遺傳特性。初期的研究結(jié)果顯示，秘魯和北美的毒株之間有較強的遺傳關(guān)系[6]。

2 PEDV的抗體動力學(xué)研究

Giménez-Lirola等[12]選取56頭PED、TGE和PRRS均為陰性的3周齡仔豬，灌喂分離的PEDV（USA/Iowa/18984/2013）。這些豬在接種后觀察76天，在此期間，定期觀察其臨床癥狀，檢測糞便中的病毒情況用于組織學(xué)評價。在第0天及以后每隔7天收集血清樣品，通過ELISA方法測定PEDV抗體。

結(jié)果顯示，在接種后的3～4天出現(xiàn)腹瀉癥狀，10天后腹瀉癥狀消失。糞便中的PEDV在接種后7天、14天、21天和28天的檢出率分別為100%、88%、42%和0。試驗接種后抗PEDV的IgM、IgA和IgG抗體水平隨時間變化如圖2所示。首先檢測到的是一個短期的、低水平的IgM，緊接著是高水平的IgA和中等水平的IgG。接種3～4周后，IgA和IgG抗體含量會逐漸減少。

圖2 斷奶仔豬口服接種PEDV后IgM、IgA和IgG抗體的消長規(guī)律

人工感染PEDV后，用全病毒ELISA檢測到了所有主要的抗體類型，這表明血清學(xué)檢測可以用于監(jiān)測豬PEDV的暴發(fā)。IgA抗體是一個用于監(jiān)測體液免疫應(yīng)答的比較好的成分。但應(yīng)當(dāng)注意的是，抗PEDV抗體可能不能在病毒感染后持續(xù)存在很久。

3 PEDV的監(jiān)控

PEDV是很難通過細胞培養(yǎng)來鑒定的，一般用基于核酸的PCR技術(shù)或者基于抗原的抗原捕獲ELISA來檢測PEDV[2]。PCR檢測比抗原捕獲ELISA檢測更敏感。所以，一般不建議用抗原捕獲ELISA來檢測。同時，我們應(yīng)該謹慎處理高Ct值的PCR結(jié)果，直到確認PCR結(jié)果和PEDV最小感染量的關(guān)系。

最近，唾液取樣被認可為監(jiān)測眾多病原的手段之一，具有節(jié)約成本的優(yōu)勢，已被應(yīng)用于檢測藍耳病病毒（PRRSV）和豬流感病毒（SIV）[2]。雖然沒有試驗證據(jù)可以說明PEDV可以分泌到口腔，但是通過PCR從試驗感染豬排毒期間的糞便和唾液中均能夠檢測到PEDV，糞便和唾液的病毒持續(xù)時間和病毒含量顯示了良好的相關(guān)性；對感染PEDV豬只的唾液樣本進行臨床觀察，觀察到和實驗室檢測一樣的結(jié)果。因此，唾液可以用來準(zhǔn)確監(jiān)測豬群中存在和（或）循環(huán)的PEDV。

血清學(xué)方法是另外一種有效監(jiān)測豬群中PEDV的手段[2]。目前間接免疫熒光試驗（IFA）和中和抗體試驗（SN）是常用的血清學(xué)方法。

基于PEDV S基因的S1部分，Gerber等[13]研發(fā)了酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。采集239個場的血清樣品，用S1-酶聯(lián)免疫吸附法（S1-ELISA）進行診斷，敏感性為100%，診斷的特異性為94%。Gerber等選用已知PEDV情況場的初乳樣品，監(jiān)測PEDV保護力，改進現(xiàn)有的以IgG為基礎(chǔ)的PEDV ELISA檢測方法，檢測初乳和奶水中的IgA。

在初乳樣品中，PEDV陽性場的樣品，抗-IgG PEDV抗體陽性率為90.3%（28/31），抗-IgA PEDV抗體陽性率為100%（31/31）；而PEDV陰性場的樣品，抗-IgG PEDV抗體陽性率為8.9%（9/102），抗-IgA PEDV抗體陽性率為0（0/102）。結(jié)果顯示，以IgA為基礎(chǔ)的測定方法特異性更高（圖3）。Gerber等建立的檢測初乳IgA抗體的S1-ELISA法為監(jiān)測PEDV被動免疫提供了特異和敏感的方法。

圖3 陽性場和陰性場初乳樣品PEDV IgA ELISA檢測結(jié)果分布（分析截止=黑線）

4 PEDV的免疫預(yù)防

當(dāng)前PEDV疫苗和免疫存在一些問題，具體如下：1）減毒活疫苗可能有用，但是經(jīng)細胞傳代喪失了產(chǎn)生保護性免疫的能力；2）滅活疫苗的保護性免疫較差，可在活病毒感染或弱毒疫苗接種后，利用最新毒株制備的疫苗重復(fù)接種增強其免疫保護效果；3）免疫目標(biāo)：母豬在產(chǎn)前產(chǎn)生分泌型IgA，可通過初乳傳遞給仔豬，IgG免疫是無效的；4）通過感染的小腸組織有計劃地進行返飼可以獲得長期持久的保護性免疫?？梢酝ㄟ^仔豬傳代獲得純的腸道培養(yǎng)物（接種后8～15小時收集腸道）。

鑒于PED病毒的特點和當(dāng)前疫苗免疫效果，建議可以用低代次的PEDV口服免疫的同時，結(jié)合變異株的自家疫苗（需由具有資質(zhì)的科研院所或大專院校制備）或滅活疫苗進行聯(lián)合免疫，可以達到較好的免疫效果。

5 緊急返飼措施

美國沒有PEDV疫苗，研究人員已經(jīng)開始用感染豬的腸道組織進行返飼來誘導(dǎo)免疫力[14]。然而，各種不同的返飼操作方法誘導(dǎo)免疫的效果，包括血清學(xué)反應(yīng)和黏膜抗體產(chǎn)生的持續(xù)時間，都不太清楚。

Murtaugh等給妊娠80天的母豬返飼1次，或3周后再次返飼，兩者均在3周后表現(xiàn)出統(tǒng)一的血清轉(zhuǎn)陽[14]。再次返飼并沒有產(chǎn)生顯著的效果。在母乳（未收集初乳）、母豬糞便和仔豬糞便中都沒有檢測到PEDV的IgG或IgA抗體。

用已感染PEDV的腸道內(nèi)容物來進行返飼是一種有效誘導(dǎo)成年母豬產(chǎn)生PEDV抗體免疫反應(yīng)的方法[14]。然而，核衣殼抗體ELISA并沒有檢測到母源抗體向仔豬的轉(zhuǎn)移，不能證明仔豬可以獲得母源免疫力，同時在糞便中也沒有檢測到分泌型抗體。一般來說，分泌型的IgA抗體是抵抗腸道病原體感染的關(guān)鍵。因此，有可能是在母豬體內(nèi)難以產(chǎn)生有效的PEDV免疫反應(yīng)，或者很難將此免疫力轉(zhuǎn)移給仔豬，或者也有可能是核衣殼蛋白ELISA不能檢測到保護性免疫反應(yīng)。我們?nèi)匀徊恢滥姆N可能性是正確的，但是我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)糞便中含有大量的IgA，而且在糞便中還同時檢測到了血清抗體。因此，糞便ELISA的陰性結(jié)果意味著特異性抗體是不存在的?？偟膩碚f，PEDV感染誘導(dǎo)了免疫反應(yīng)，但其持續(xù)時間可能很短，也許不能給母豬和仔豬提供堅實的免疫保護。

筆者不建議進行返飼。在有必要進行返飼的時候，必須先檢測仔豬腹瀉腸容物是否有其它病毒性病原，在無其它病原感染的前提下方可進行返飼。

[1]Pensaert M B,de Bouck P.A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J].Arch Virol,1978,58(3):243-247.

[2]Yoon K J.The emergence of porcine epidemic diarrhea in US swine:Surprises on the road to prevention and control[C].Proceedings of the 23rd International Pig Veterinary Society(IPVS) Congress,2014:64-66.

[3]董世娟，朱于敏，于瑞嵩，等.我國PEDV分子流行病學(xué)研究進展[C].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病分會第八屆全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)研討會論文集，2013：96-101.

[4]Li L,Huang Y.Epidemiological survey of three diarrhea related viruses in China east coast from 2012 to 2013[C].Proceedings of the 23rd International Pig Veterinary Society(IPVS)Congress, 2014:246.

[5]Thomas P R,Karriker L,Ramirez A,et al.Evaluation of time and temperature sufficient to inactivate porcine epidemic diarrhea virus in swine feces on metal surfaces[C].Proceedings of the 23rd International Pig Veterinary Society(IPVS)Congress,2014:249.

[6]More-Bayona J,Ramírez-Velásquez M,Manchego-Sayán A,et al. Molecular detection of emerging strains of PEDV in Peru[C]. Proceedings of the 23rd International Pig Veterinary Society (IPVS)Congress,2014:247.

[7]翁善鋼.2014年豬流行性腹瀉在全球的流行與傳播[J].看世界，2015（4）：43.

[8]Hesse D,Suddith A,Breazeale B,et al.Oral/nasal inoculation of four-week-old pigs with PEDV:tissue tropism,shedding,carriage,antibody response and aerosol transmission[C].Proceedings of the 23rd International Pig Veterinary Society(IPVS)Congress, 2014:251.

[9]Greiner L,Classen D,Eddy N,et al.Understanding PEDV timeline of exposure based on clinical findings[C].Proceedings of the 23rd International Pig Veterinary Society(IPVS)Congress,2014: 252.

[10]馮力.中國最新疫情和豬腸道冠狀病毒疫苗開發(fā)現(xiàn)狀[R].第四屆李曼中國養(yǎng)豬大會暨2015世界豬產(chǎn)業(yè)博覽會會議演講資料和指南，2015：118-120.

[11]Chen Q,Li G,Chriswell A,et al.Genetic characterization of US PEDV and identification of a variant previously unrecognized in US swine[C].Proceedings of the 23rd International Pig Veterinary Society(IPVS)Congress,2014:339.

[12]Giménez-Lirola L G,Hoang H,Sun D,et al.Kinetics of humoral immune response(IgM,IgA,and IgG)to porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)in experimentally infected pigs[C].Proceedings of the 23rd International Pig Veterinary Society(IPVS) Congress,2014:253.

[13]Gerber P,Opriessnig T,Holtkampl D,et al.ELISA quantification of anti-PEDV IgA antibody in colostrum as a potential tool to monitor PEDV protection in breeding herds[C].Proceedings of the 23rd International Pig Veterinary Society(IPVS)Congress,2014:161.

[14]Murtaugh M,Dvorak C,Stone S,et al.PEDV:immunity following feedback[C].Proceedings of the 23rd International Pig Veterinary Society(IPVS)Congress,2014:254.

（編輯：富春妮）

S858.282.61+2

A

1002-1957(2016)02-0101-04

2016-01-16

陳基萍（1986-），女，廣西欽州人，碩士，研究方向為動物醫(yī)學(xué).E-mail:cjp0420515@163.com