豬肺炎支原體和豬鼻支原體在屠宰豬呼吸道與血液中的分布

王貴平，李君佩，王亞楠，羅廣，胡仕鳳，李曉云

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128）

豬肺炎支原體和豬鼻支原體在屠宰豬呼吸道與血液中的分布

王貴平，李君佩，王亞楠，羅廣，胡仕鳳，李曉云

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128）

用PCR方法對從湖南省長沙市515頭屠宰豬收集的1 204份樣品（120份豬鼻拭子、254份豬支氣管拭子、515份豬支氣管肺泡灌洗液和235份豬肺、80份血液）進行了豬肺炎支原體和豬鼻支原體檢測，并對部分PCR產(chǎn)物進行序列分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體在豬支氣管灌洗液中檢出率最高（23.3%，120/515），豬鼻拭子和血液中檢出率最低（0）；豬鼻支原體在豬鼻拭子中檢出率最高（24.3%，125/515），在豬支氣管拭子中檢出率最低（2.5%，3/120）。序列分析表明：試驗的PCR產(chǎn)物與國內(nèi)已出版的相關(guān)序列有97%～100%的同源性。試驗探明了豬肺炎支原體和豬鼻支原體在豬呼吸道與血液中的分布情況，為這兩種支原體的分離鑒定提供了依據(jù)。

豬肺炎支原體；豬鼻支原體；豬呼吸道；分布

豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）是豬喘氣病的主要病原。Mhp黏附于豬呼吸道纖毛上皮細胞，使纖毛的清除功能受損，繼而引起持續(xù)的炎癥反應(yīng)及高傳染性的慢性呼吸道疾病，對世界范圍的養(yǎng)豬生產(chǎn)造成重大的經(jīng)濟損失[1-2]。豬喘氣病之所以長期存在而難以防控，原因之一是Mhp在豬體內(nèi)一般呈慢性或隱性感染而臨床癥狀不明顯，豬長期帶菌成為傳染源[3-4]。豬肺炎支原體通常被認為是該病的病原，但是最新研究表明豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis,Mhr）也能引起典型的豬支原體肺炎病變[5]。Mhp和Mhr常從沒有感染其他微生物的豬肺中進行分離鑒定。但是隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；l(fā)展，符合要求的豬肺日益難以獲得。本試驗探明了Mhp和Mhr在豬體內(nèi)的分布情況，為探索新的分離鑒定方法（如從灌洗液中分離Mhp）奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品

2015年1月，從湖南省某屠宰場采集1 204份豬樣品。樣品采集收送湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院檢測。豬鼻拭子和豬支氣管拭子：用無菌的棉簽分別在屠宰豬鼻孔和氣管管壁中來回涂擦3次，然后在含有1.5 mL KM2液體培養(yǎng)基的EP管中劇烈攪動，棄去棉簽；豬支氣管肺泡灌洗液：將50 mL無菌的PBS（pH 7.8）灌入豬支氣管中，來回顛倒3次后收集液體（約10～30 mL）。豬肺樣品：在豬肺尖葉切割一小塊肺臟；豬血液樣品：在豬屠宰放血時用無菌離心管收集20～30 mL。

1.2 試劑

KM2液體培養(yǎng)基：購自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所。PCR引物：根據(jù)相關(guān)文獻[5]，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成（表1）。

表1 本試驗所用的引物

1.3 PCR模板制備和PCR擴增

按相關(guān)文獻[6]制備和進行。

1.4 序列分析和呈送GenBank

將2份Mhp 16S rRNA基因擴增的產(chǎn)物和1份Mhr P37基因擴增的產(chǎn)物送華大基因武漢中心測序，并用BLAST軟件（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi PAGETYPE）和國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表的序列進行同源性比較。將測得的序列用Bankit方法呈送至NCBI基因庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

從陽性樣品中分別擴增出大小約649 bp和346 bp特異性條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 PCR鑒定結(jié)果

2.2 測序與同源性分析

測序結(jié)果已經(jīng)成功呈送至GenBank，序列號分別是GU569848、GU569849（Mhp 16S rRNA基因）和GU722587（Mhr P37基因）。同源性分析表明與國內(nèi)外相關(guān)序列有97%～100%的同源性。

2.3 Mhp在豬呼吸道和血液中的分布

從表2可以看出，Mhp總陽性率是24.6%（127/ 515）。冬季陽性率最高（79.2%，95/120），夏季最低（0）。在不同的樣品中，支氣管肺泡灌洗液檢出率最高（23.3%，120/515），鼻拭子和血液檢出率最低（0）。

2.4 Mhr在豬呼吸道和血液中的分布

從表3可以看出，Mhr總陽性率是25.8%（133/ 515）。冬季陽性率最高（82.5%，99/120），秋季最低（0）。在不同的樣品中，鼻拭子檢出率最高（24.3%，125/515），支氣管拭子檢出率最低（2.5%，3/120）。

表2 豬肺炎支原體在豬呼道和血液中的檢出率

表3 豬鼻支原體在豬呼吸道和血液中的檢出率

3 討論

（1）本試驗首次就Mhp和Mhr在屠宰豬呼吸道與血液中的分布進行了探究。豬肺炎支原體在豬上呼吸道（鼻拭子）檢出率為0。隨著呼吸道深入，Mhp的檢出率逐漸升高（支氣管拭子，7.1%），在支氣管處檢出率升至最高（支氣管肺泡灌洗液，23.3%），然后逐步降低（肺，18.7%）。Mhr在上呼吸道檢出率最高（鼻拭子，24.3%），而在中呼吸道逐漸降低（支氣管拭子，2.5%），然后逐步升高（支氣管肺泡灌洗液，6.7%；肺，17.8%）。

（2）從季節(jié)分布看Mhp和Mhr在冬季的檢出率明顯高出其他季節(jié)，這和豬喘氣病的流行病學是一致的。建議從冬季的鼻拭子中檢測和分離Mhr，從冬季的支氣管肺泡灌洗液和豬肺中檢測和分離Mhp。

（3）Mhr是豬喘氣病最常見的繼發(fā)菌，可以伴發(fā)豬的多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎。本試驗首次從血液中檢出了Mhr，為證實Mhr從血液中循環(huán)到關(guān)節(jié)提供了堅實的依據(jù)。

[1]李彥偉，劉茂軍，武昱孜，等.豬肺炎支原體致病機理研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2013，34（8）：84-88.

[2]Moitinho-Silva L,Heineck B L,Reolon L A,et al.Mycoplasma hyopneumoniae typeⅠsignal peptidase：expression and evaluation of its diagnosetic potential[J].Vet Microbiol,2012,154(3/4)：282-291.

[3]Vangroenweghe F A,Labarque G G,Piepers S,et al.Mycoplasma hyopneumoniae infections in peri-weaned and postweaned pigs in belgium and the netherlands：prevalence and associations with climatic conditions[J].Vet J,2015,205(1)：93-97.

[4]Caron J,Ouardani M,Dea S.Diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis Infections in pigs by PCR amplification of the p36 and p46 genes[J].J Clin Microbiol,2000,38(4)：1390-1396.

[5]Lin J H,Chen S P,Yeh K S,et al.Mycoplasma hyorhinis in Taiwan：diagnosis and isolation of swine pneumonia pathogen[J].Vet Microbiol,2006,115(1-3)：111-116.

[6]王貴平，胡仕鳳，鄧治邦.豬胸膜肺炎放線桿菌和豬肺炎支原體混合感染的診治[J].養(yǎng)豬，2009（6）：57-59.

（編輯：郭玉翠）

S858.28

A

1002-1957(2016)01-0119-02

2015-12-31

湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金資助科研項目（13B050）

王貴平（1973-），男，湖北咸寧人，副教授，博士，研究方向為豬細菌性傳染病.E-mail：wanggp003@163.com