雌激素受體基因多態(tài)性在海南地方豬中的分布

葉玉秀，孫瑞萍，劉海隆，晁哲

（1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，海南?？?71100；2.海南省家畜家禽工程技術(shù)研究中心，海口571100）

雌激素受體基因多態(tài)性在海南地方豬中的分布

葉玉秀1，2，孫瑞萍1，2，劉海隆1，2，晁哲1，2

（1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，海南?？?71100；2.海南省家畜家禽工程技術(shù)研究中心，?？?71100）

通過PCR-RFLP方法對90頭海南五指山豬和70頭臨高豬進(jìn)行ESR基因型檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ESR基因的PvuⅡ-RFLP位點(diǎn)上，五指山豬以BB和AB基因型為主，在臨高豬中該位點(diǎn)A等位基因和B等位基因頻率分別是0.12和0.88。該結(jié)果為海南地方豬的雜交選育提供理論依據(jù)。

ESR；PCR-RFLP；五指山豬；臨高豬

繁殖力是影響?zhàn)B豬業(yè)生產(chǎn)效率的最重要因素之一，產(chǎn)仔數(shù)的提高將大幅增加肉豬的產(chǎn)量，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，雌激素受體基因（ESR）是已發(fā)現(xiàn)的控制豬產(chǎn)仔數(shù)的主效基因[1]。雌激素受體主要存在于卵巢、睪丸、胎盤等組織器官中，它是一種與特定激素應(yīng)答DNA元件相結(jié)合的激活轉(zhuǎn)錄因子家族中的一種核酸受體，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)的功能，參與雌性脊椎動物性腺基因的表達(dá)與調(diào)控。結(jié)合了配體的ESR與雌激素應(yīng)答元件相互作用可以改變受雌激素調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步影響雌性第二性征、生殖力、繁殖周期、妊娠維持等，從而影響胚胎發(fā)育和系統(tǒng)分化[2]。20世紀(jì)90年代，Rothschild等[3]發(fā)現(xiàn)ESR基因中存在一個變異位點(diǎn)，該位點(diǎn)可以被限制性內(nèi)切酶PvuⅡ識別，產(chǎn)生3種基因型分別命名為AA、AB和BB。此后的大量研究證實，ESR基因存在PvuⅡ酶切位點(diǎn)，且該位點(diǎn)多態(tài)性與豬產(chǎn)仔數(shù)密切相關(guān)。優(yōu)良等位基因在不同的豬群中有較大差異，有的群體A等位基因占優(yōu)勢，有的則是B等位基因占優(yōu)勢，這可能與豬的品種、樣本數(shù)量及環(huán)境差異有關(guān)。五指山豬原產(chǎn)于海南省五指山區(qū)，由于其體小、靈活、頭尖長、體形似鼠，俗稱“老鼠豬”、“五腳豬”，是我國著名的小型豬種之一。臨高豬是海南豬中的一個重要類群，主要分布在海南臨高縣、儋州市以及澄邁縣、東方市和昌江縣的部分地區(qū)，屬于中偏小型地方豬[4]。五指山豬和臨高豬作為海南地方豬的代表，具有耐熱、耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)，適于放牧飼養(yǎng)。本研究檢測了ESR基因中PvuⅡ酶切位點(diǎn)多態(tài)性在五指山豬和臨高豬中的分布情況，為這兩個海南地方豬種的選育與雜交利用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點(diǎn)

試驗于2016年4月15日至6月8日在海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所進(jìn)行。

1.2 試驗材料

90頭五指山豬來自海南國家級五指山豬保種場，70頭臨高豬來自海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所永發(fā)科研基地。2015年采集血液和耳組織后利用基因組提取試劑盒提取基因組DNA，-20℃保存。

1.3 引物合成

擴(kuò)增ESR基因的引物序列信息如表1所示，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 擴(kuò)增引物序列信息

1.4 PCR-RFLP

PCR反應(yīng)總體系為25 μL，其中模板DNA 1 μL（50 ng），引物0.5 μL（5 μmol/L），dNTP 0.5 μL（10 mmol/L），10×PCR buffer 2.5 μL，Mg2+2.0 μL（25 mmol/L），Taq DNA聚合酶1 μL（1 U/μL），加滅菌后的去離子水補(bǔ)足25 μL。PCR程序為：94℃預(yù)熱4 min；94℃變性40 s，61℃退火40 s，72℃延伸40 s，共34個循環(huán)；72℃延伸7 min。

ESR基因酶切反應(yīng)體系：總體系為10 μL，其中PCR產(chǎn)物6 μL，10×buffer 1 μL，限制性內(nèi)切酶PvuⅡ0.5 μL（10 U/μL），滅菌的去離子水2.5 μL。反應(yīng)條件為37℃酶切過夜，經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳檢測并記錄酶切結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

根據(jù)群體遺傳學(xué)理論直接計算得到基因型和等位基因頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-RFLP分析結(jié)果

ESR基因擴(kuò)增的目的片段長度為120 bp，經(jīng)檢測與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。ESR基因擴(kuò)增片段包含1個突變位點(diǎn)，該突變引起PvuⅡ酶切位點(diǎn)的改變，酶切產(chǎn)物中只含有120 bp一個條帶的是AA基因型，含有65 bp和55 bp兩個條帶（這兩個條帶長度接近，在瓊脂糖凝膠電泳中分辨不出來）的是BB基因型，產(chǎn)物中含有120 bp、65 bp和55 bp三個條帶的是AB基因型。詳見圖1。

圖1 豬ESR基因電泳檢測結(jié)果

2.2 ESR基因在海南地方豬中的基因型分布

在海南五指山豬和臨高豬中檢測了ESR基因PvuⅡ酶切位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率。由表2可知，在試驗檢測的五指山豬中，A等位基因頻率為0.17，B等位基因頻率為0.83；在臨高豬中，A等位基因和B等位基因頻率分別是0.12和0.88。

表2 ESR基因在海南地方豬中的分布

3 討論

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇在家畜育種上得以應(yīng)用，并取得一定進(jìn)展，特別是對于產(chǎn)仔數(shù)等遺傳力低的數(shù)量性狀，往往是受多基因控制的，通過常規(guī)表型選擇進(jìn)展緩慢。已發(fā)現(xiàn)的控制豬產(chǎn)仔數(shù)的基因或標(biāo)記有雌激素受體基因（ESR）、促卵泡素β亞基基因（FSHβ）、催乳素受體基因（PRLP）和表皮生長因子基因（EGF）等[6]，其中ESR基因是最受關(guān)注的。研究顯示，ESR基因中的PvuⅡ酶切位點(diǎn)在中外豬種中均表現(xiàn)出多態(tài)性，不同豬種的基因頻率和基因型頻率各有差異，有些群體甚至缺失某種基因型。在國外豬種（杜洛克豬、長白豬、約克夏豬、皮特蘭豬等）中，A等位基因頻率高于B等位基因頻率；在中國地方豬種（二花臉豬、梅山豬、淮豬、藏豬等）中，B等位基因頻率高于A等位基因頻率[7]。本研究在海南五指山豬和臨高豬中檢測發(fā)現(xiàn)，B等位基因為優(yōu)勢等位基因，進(jìn)一步證明中國地方豬B等位基因頻率高于國外豬品種。

Rothschild等[3]最先發(fā)現(xiàn)不同豬種中ESR基因存在PvuⅡ酶切多態(tài)性，并且有利基因型使豬每胎的產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)提高1.5頭和1頭。隨后，國內(nèi)許多學(xué)者以ESR基因的PvuⅡ酶切位點(diǎn)為研究對象，在不同地方豬種中進(jìn)行檢測分析。丁家桐等[8]對90頭姜曲海豬、梅山豬、二花臉豬ESR基因多態(tài)性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型間總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)差異極顯著，BB基因型母豬一胎總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均高于AA基因型母豬。與此相反，在淮豬、萊蕪豬等豬種中研究發(fā)現(xiàn)，AA基因型是有利基因型，其產(chǎn)仔數(shù)高于BB基因型[9]。不同的研究結(jié)果一方面是由于不同品種、不同樣本量及不同環(huán)境造成的，另一方面說明ESR基因中的PvuⅡ酶切位點(diǎn)并不是功能突變。根據(jù)遺傳標(biāo)記與功能突變之間的關(guān)系，可以把已發(fā)現(xiàn)的遺傳標(biāo)記分為以下3種類型：1）直接標(biāo)記（direct markers），是導(dǎo)致基因功能突變的位點(diǎn)；2）連鎖不平衡標(biāo)記（LD markers），是在整個群體范圍內(nèi)與功能突變處于連鎖不平衡狀態(tài)的標(biāo)記；3）連鎖平衡標(biāo)記（LE markers），是指在家系與功能突變處于連鎖不平衡狀態(tài)，但在群體范圍內(nèi)卻仍處于連鎖平衡狀態(tài)的標(biāo)記[10]。只有找到直接標(biāo)記或連鎖不平衡標(biāo)記，才能真正應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇，提高選種效率。海南地方豬中五指山豬產(chǎn)仔數(shù)較低，平均每胎8頭左右，如何通過標(biāo)記輔助選擇提高海南五指山豬的繁殖性能是我們今后重點(diǎn)研究的方向。

4 結(jié)論

ESR基因中的PvuⅡ酶切位點(diǎn)在海南五指山豬和臨高豬中的優(yōu)勢等位基因是B。

[1]Rempel L A,Nonneman D J,Wise T H,et al.Association analyses of candidate single nucleotide polymorphisms on Reproductive traits in swine[J].J Anim Sci,2010,88(1):1-15.

[2]唐現(xiàn)文，韓大勇，周春寶，等.蘇姜豬四至六世代雌激素受體（ESR）基因PvuⅡ多態(tài)性分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，25（5）：965-970.

[3]Rothschild M F,Larson R G,Jacobson C,et al.Pvu II polymorphisms at the porcine oestrogen receptor locus(ESR)[J]. Anim Genet,1991,22(5):448.

[4]晁哲，孫瑞萍，劉海隆，等.FSHβ和FUT1基因多態(tài)性在海南臨高豬中的分布[J].養(yǎng)豬，2015（6）：60-62.

[5]Linville R C,Pomp D,Johnson R K,et al.Candidate gene analysis for loci affecting litter size and ovulation rate in swine[J]. J Anim Sci,2001,79(1):60-67.

[6]徐小波，馮宇，陸志強(qiáng)，等.二花臉豬繁殖性狀候選基因的多態(tài)性分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，27（9）：1519-1523.

[7]胡建偉，楊曉瓊，余永華.中外豬種ESR基因多態(tài)性與繁殖性狀相關(guān)研究[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2014（2）：20-23.

[8]丁家桐，葛紅山，姜勛平，等.豬雌激素受體基因與產(chǎn)仔數(shù)和乳頭數(shù)的關(guān)系研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，25（2）：79-81.

[9]李慶崗，吳義景，楊勇，等.美系大白豬雌激素受體基因多態(tài)性與繁殖性狀的相關(guān)分析[J].養(yǎng)豬，2015（4）：65-68.

[10]晁哲，鄭心力，孫瑞萍，等.豬Lbx2基因的克隆、序列分析及表達(dá)[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（8）：26-30.

（編輯：郭玉翠）

吃植物油并不比動物脂肪健康

【法新社巴黎4月12日電】據(jù)今天發(fā)表的一項對基本飲食建議構(gòu)成挑戰(zhàn)的研究稱，用植物油取代人類飲食中的動物脂肪似乎并不能降低發(fā)生心臟病的危險，甚至反而可能增加這種危險。

該研究稱，在一項由近1萬人參加的實驗中，把飽和的歐米伽6脂肪改為不飽和的歐米伽6脂肪確實使血液中膽固醇含量降低，但并未達(dá)到使心臟病死亡率下降的預(yù)期。

事實上，根據(jù)這項發(fā)表在醫(yī)學(xué)期刊《英國醫(yī)學(xué)雜志》上的研究稱，那些膽固醇含量降低較多的人“死亡的風(fēng)險更高，而不是更低”。

50多年來，肉類、黃油、奶酪及奶油中的動物脂肪一直被視為飲食中的洪水猛獸—它們被認(rèn)為會增加動脈阻塞性膽固醇的風(fēng)險，后者可能導(dǎo)致心臟病和中風(fēng)。

1961年，美國心臟病協(xié)會曾建議用植物油代替飽和脂肪—這種觀點(diǎn)仍然流行，盡管有一些研究開始對這種理論提出質(zhì)疑。

世界衛(wèi)生組織也建議，飽和脂肪應(yīng)該低于總攝入能量的10%。在迄今為止的幾十年里，世人一直以疑慮的眼光看待全脂牛奶和咸豬肉，并用雞肉替代豬肉，用源于植物的人造黃油和烹飪油替代黃油。但在過去幾年里，研究人員開始動手戳破有關(guān)“脂肪有害”的理論。

這項由國家衛(wèi)生研究院的克里斯托弗·拉姆斯登領(lǐng)導(dǎo)的新研究，對45年前一項隨機(jī)對照組的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行了重新分析。該實驗的對象是明尼蘇達(dá)州州立精神病院和養(yǎng)老院中的9 423名住院者。這是一類通常被認(rèn)為具有高度可靠性的實驗，在實驗中，實驗對象被隨機(jī)分組。

在這項明尼蘇達(dá)州的研究中，有一部分實驗對象攝入的飽和脂肪被玉米油替代，而其他人的飲食則含有大量動物脂肪。《英國醫(yī)學(xué)雜志》在一篇說明文章中稱：“不出所料，富含亞油酸（一種存在于植物油中的脂肪酸）的飲食降低了膽固醇的水平?！钡斑@并沒有帶來存活率的上升。實際上，膽固醇下降更多的實驗對象，死亡風(fēng)險更高?！?/p>

（轉(zhuǎn)自參考消息[N]，2016-04-14）

山靜日長

唐子西詩云：“山靜似太古，日長如小年?！庇嗉疑钌街?，每春夏之交，蒼蘚盈階，落花滿徑，門無剝啄，松影參差，禽聲上下。午睡初足，旋汲山泉，拾松枝，煮苦茗啜之。隨意讀《周易》《國風(fēng)》《左氏傳》《離騷》《太史公書》及陶杜詩、韓蘇文數(shù)篇。從容步山徑，撫松竹，與麛犢共偃息于長林豐草間。坐弄流泉，漱齒濯足。既歸竹窗下，則山妻稚子，作筍蕨，供麥飯，欣然一飽。弄筆窗前，隨大小作數(shù)十字，展所藏法帖、墨跡、畫卷縱觀之。興到則吟小詩，或草《玉露》一兩段，再烹苦茗一杯。出步溪邊，邂逅園翁溪叟，問桑麻，說粳稻，量晴校雨，探節(jié)數(shù)時，相與劇談一晌。歸而倚杖柴門之下，則夕陽在山，紫綠萬狀，變幻頃刻，恍可入目。牛背笛聲，兩兩來歸，而月印前溪矣。

（轉(zhuǎn)自《視野》2015年第5期，[宋]羅大經(jīng)/文）

Distribution of Polymorphism of ESR Gene in Hainan Native Pig Breeds

YE Yuxiu1,2,SUN Ruiping1,2,LIU Hailong1,2,CHAO Zhe1,2
(1.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Hainan Academy of Agricultural Sciences,Haikou 571100,China;2.Hainan Provincial Engineering Research Center for Livestock and Poultry Cultivation,Haikou 571100,China)

PCR-RFLP was used to analyze the polymorphism of ESR gene in 90 Wuzhishan pigs and 70 Lingao pigs.The main results were as follows:At the PvuⅡ-RFLP locus of ESR gene,BB and AB genetype were major in Wuzhishan pig.The frequencies of allele A and B in Lingao pigs were 0.12 and 0.88,respectively.This study could be provided some useful genetic basis principles for growth and development,system selection of Hainan native pig breeds.

ESR;PCR-RFLP;Wuzhishan pig;Lingao pig

S828

A

1002-1957(2016)04-0079-03

2016-07-03

國家自然科學(xué)基金項目（31560628）；海南省省屬科研院所技術(shù)開發(fā)研究專項（KYYS-2015-02）；海南省工程技術(shù)研究中心建設(shè)專項（SQ2016JSZX0022）

葉玉秀（1985-），女，湖北武漢人，畜牧師，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究.E-mail：yuxiuye12@126.com

晁哲（1984-），男，河南許昌人，副研究員，博士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究.E-mail：chaozhe.cn@126.com