藏豬和杜洛克豬CAPN3基因表達(dá)差異及其與肉質(zhì)性狀相關(guān)性分析

陶璇，顧以韌，梁艷，楊雪梅，鐘志君，陳曉暉，楊躍奎，曾凱，呂學(xué)斌

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610066）

藏豬和杜洛克豬CAPN3基因表達(dá)差異及其與肉質(zhì)性狀相關(guān)性分析

陶璇1，2，顧以韌1，2，梁艷1，2，楊雪梅1，2，鐘志君1，2，陳曉暉1，2，楊躍奎1，2，曾凱1，2，呂學(xué)斌1，2

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610066）

為了揭示脂肪型的藏豬和瘦肉型的杜洛克豬肌肉生長(zhǎng)及嫩度相關(guān)基因的表達(dá)差異，采用QRT-PCR方法檢測(cè)了兩豬種背最長(zhǎng)肌中鈣蛋白酶3（CAPN3）基因在180日齡的表達(dá)差異，分析其表達(dá)與肌纖維面積（CSA）、肌肉剪切力的相關(guān)性。結(jié)果表明，180日齡藏豬CAPN3 mRNA表達(dá)量顯著高于杜洛克豬（P＜0.05）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CAPN3 mRNA表達(dá)量與肌纖維面積、剪切力均呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。以上結(jié)果初步揭示了兩豬種在180日齡CAPN3基因表達(dá)的品種差異，為深入研究豬肌肉生長(zhǎng)及剪切力的調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

豬；背最長(zhǎng)?。粺晒舛縋CR；CAPN3基因；肌纖維面積；剪切力

鈣蛋白酶（Calpain,CAPN）是一種存在于細(xì)胞內(nèi)的非溶酶體性的限制性蛋白水解酶，與肉的嫩度和風(fēng)味等食用品質(zhì)密切相關(guān)[1]，是理想的肉質(zhì)嫩度分子標(biāo)記[2]。Calpain3（CAPN3或P94）基因作為影響肉嫩度的候選基因，其分子生物學(xué)特性和生理調(diào)控功能是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一。CAPN3是最典型的組織特異性鈣蛋白酶，只在骨骼肌中特異表達(dá)，且在骨骼肌細(xì)胞中其mRNA表達(dá)量是經(jīng)典鈣蛋白酶的10倍，呈現(xiàn)高度表達(dá)[3]，與肌肉發(fā)育之間存在著密切關(guān)系[4]。目前關(guān)于CAPN3基因的研究，主要集中在CAPN3基因的克隆、多態(tài)性分析以及與雞、鴨、豬、牛及羊等物種肉質(zhì)及胴體重相關(guān)性的探討上。Ilian等的研究揭示了CAPN3的mRNA水平[5]和蛋白質(zhì)水平[6]與肉嫩度之間存在著強(qiáng)相關(guān)。侯冠彧等[7]對(duì)CAPN3基因的5'區(qū)域進(jìn)行SNP檢測(cè)和基因型分析，初步斷定該基因本座位有影響肉牛生長(zhǎng)及牛肉嫩度的傾向。Felicio等[8]進(jìn)一步證實(shí)該基因多態(tài)性與雞腿肌重、烹飪損失及剪切力密切相關(guān)。鴨骨骼肌發(fā)育過(guò)程中，CAPN3基因與肌纖維類型和肌纖維的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，其變異影響肉的品質(zhì)[9]。對(duì)豬CAPN3的研究包括CAPN3基因的克隆及多態(tài)性檢測(cè)，但沒(méi)有與肉質(zhì)性狀相關(guān)的報(bào)道[10-11]。本研究以選育程度低、瘦肉率低的藏豬和選育程度高、瘦肉率高的杜洛克豬為研究對(duì)象，采用熒光定量PCR（QRTPCR）方法研究?jī)韶i種180日齡時(shí)背最長(zhǎng)肌中CAPN3 mRNA的表達(dá)差異及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)系，為研究CAPN3基因影響肌肉生長(zhǎng)及剪切力的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及采樣

試驗(yàn)采用的藏豬、杜洛克豬均由四川省畜牧科學(xué)研究院科研實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)提供。于2014年5月隨機(jī)挑選35日齡斷奶的藏豬、杜洛克豬各4頭，共計(jì)8頭組建群體，采用相同營(yíng)養(yǎng)水平和飼喂方式，到180日齡時(shí)進(jìn)行屠宰，屠宰前停食24 h，自由飲水。采集倒數(shù)3～4肋骨間對(duì)應(yīng)處的背最長(zhǎng)肌樣品及最后肋骨向后8～10 cm完整背最長(zhǎng)肌，一部分用于肌纖維面積、剪切力測(cè)定，另一部分浸泡于RNA later（Qiagen公司）中，隨后投入液氮中保存。

1.2 肉質(zhì)性狀測(cè)定

1.2.1 肌纖維面積測(cè)定采用KD-2508型切片機(jī)（Kedee公司）按照冰凍切片標(biāo)準(zhǔn)制作流程制作背最長(zhǎng)肌樣品的冰凍切片，蘇木精-伊紅（Hematoxylin&eosin,H&E）染色后用BK 5000型顯微成相系統(tǒng)（Optec公司）采集代表性區(qū)域圖像，通過(guò)Motic Images Advanced 3.2顯微圖像分析軟件計(jì)算每個(gè)樣品中100根肌纖維的面積。

1.2.2 剪切力測(cè)定屠宰后采集最后肋骨向后8～10 cm完整背最長(zhǎng)肌，4℃冷藏熟化，48 h后取出裝入自封袋中，放入已設(shè)置水浴終止溫度為70℃的恒溫水浴鍋，待加熱至肉樣中心溫度為70℃時(shí)取出，剔除肌肉表面的膜、筋、腱和脂肪等，用肉樣取樣器取出肉樣（直徑1 cm），在CT3質(zhì)構(gòu)儀（Brookfield，美國(guó)）上測(cè)定樣品的剪切力，每個(gè)樣品做5個(gè)重復(fù)，取剪切力曲線相近3個(gè)測(cè)定值的平均值。

1.3 QRT-PCR測(cè)定CAPN3 mRNA相對(duì)表達(dá)量

1.3.1 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄肌肉樣品的總RNA提取按照mirVana Kit（Life Technologies Corporation, USA）試劑盒的操作說(shuō)明書完成，并通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100對(duì)抽提的RNA進(jìn)行質(zhì)檢，然后使用SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit（TaKaRa公司）進(jìn)行cDNA的合成。

1.3.2 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成引物由Primer premier 5.0程序設(shè)計(jì)，深圳華大基因科技有限公司合成，信息見(jiàn)表1。

表1 熒光定量RT-PCR目的基因引物的相關(guān)信息

1.3.3 QRT-PCR在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）儀器上進(jìn)行mRNA熒光定量PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL SYBR Green q-PCR Super Mix，引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2 μL的cDNA模板，RNAase free水9.5 μL。采用兩步法進(jìn)行熒光定量PCR的擴(kuò)增。PCR循環(huán)參數(shù)為：95.0℃10 s；95.0℃5 s，60℃30 s，循環(huán)40次，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析，溫度以0.5℃/30 s的速率從55.0℃緩慢遞增到95.0℃。試驗(yàn)樣本和陰性對(duì)照每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

選用肌肉組織中穩(wěn)定表達(dá)的ACTB、TBP和TOP2B為看家基因，運(yùn)用GeNorm軟件計(jì)算出看家基因的歸一化因子NF值（Normalization factor），以目的基因mRNA的拷貝數(shù)（最大拷貝數(shù)設(shè)為1）與對(duì)應(yīng)樣品的NF值的比值表示基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量[12]。采用SigmaPlot 12.5軟件對(duì)性狀指標(biāo)和基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌纖維面積、剪切力測(cè)定

由表2可知，180日齡藏豬、杜洛克豬的肌纖維面積分別為2 221.52 μm2、6 351.41 μm2，剪切力分別為3 581.25 g、6 548.25 g。藏豬肌纖維面積、剪切力均極顯著小于杜洛克豬（P＜0.01）。

表2 180日齡藏豬、杜洛克豬的肌纖維面積、剪切力

2.2 CAPN3 mRNA表達(dá)量及其與肌纖維面積、剪切力相關(guān)性分析

由圖1可知，180日齡藏豬CAPN3 mRNA表達(dá)量顯著高于杜洛克豬（P＜0.05）。對(duì)CAPN3 mRNA表達(dá)量與肉質(zhì)性狀肌纖維面積、剪切力的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，CAPN3 mRNA表達(dá)量與肌纖維面積、剪切力均呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

圖1 180日齡藏豬與杜洛克豬CAPN3基因相對(duì)表達(dá)量

表3 CAPN3 mRNA表達(dá)量與肌纖維面積、剪切力相關(guān)性分析

3 討論

影響肉嫩度的因素有許多，包括肌纖維直徑、密度和類型，結(jié)締組織含量及組成，蛋白水解酶的含量及活性，肌糖原及肌內(nèi)脂肪的含量，游離鈣離子濃度等。在這些因素中，Calpain的含量及活性是影響動(dòng)物屠宰后肉嫩化的主要因素。在正常生理?xiàng)l件下，Calpain主要在細(xì)胞質(zhì)中以無(wú)活性的狀態(tài)存在，動(dòng)物屠宰后，肌細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的鈣離子（Ca2+）從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡中釋放出來(lái)，使得細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度升高，Calpain被激活，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜上，通過(guò)自溶降解肌聯(lián)蛋白和伴肌動(dòng)蛋白，促進(jìn)肉的嫩化[13]。

藏豬是國(guó)家級(jí)畜禽資源保護(hù)豬種，肌纖維細(xì)，肉質(zhì)優(yōu)良，而杜洛克豬肌纖維較粗，肉質(zhì)較差。本研究結(jié)果顯示，同月齡藏豬肌纖維面積、肌肉剪切力均極顯著低于杜洛克豬（P＜0.01），這與藏豬和杜洛克豬的種質(zhì)特性相一致。此外，180日齡藏豬CAPN3 mRNA表達(dá)量顯著高于杜洛克豬（P＜0.05），與肌纖維面積、剪切力均呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），這與Showalter等[4]及Ilian等[5]研究結(jié)果一致，說(shuō)明CAPN3基因會(huì)抑制肌纖維生長(zhǎng)，同時(shí)在豬屠宰后促進(jìn)肉的嫩化。

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（編輯：富春妮）

綠色環(huán)境有益女性長(zhǎng)壽

據(jù)美國(guó)《環(huán)境健康展望》雜志刊登哈佛大學(xué)一項(xiàng)新研究發(fā)現(xiàn)，居住環(huán)境綠植多可顯著降低女性死亡率。與生活在綠植最少環(huán)境的女性相比，生活在綠植最多環(huán)境的女性死亡率可降低12%。

新研究中，哈佛大學(xué)陳曾熙公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)專家彼得·詹姆斯博士和布萊根婦女醫(yī)院專家對(duì)美國(guó)護(hù)士健康研究（2000—2008）涉及的108 630名女性的相關(guān)數(shù)據(jù)展開(kāi)了梳理分析。研究人員對(duì)參試女性的死亡風(fēng)險(xiǎn)與其居住環(huán)境綠植水平進(jìn)行了對(duì)比分析。新研究還考慮了年齡、社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位、種族及抽煙等其他死亡風(fēng)險(xiǎn)因素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高綠植居住環(huán)境與低死亡率之間關(guān)聯(lián)性在呼吸道疾病和癌癥死亡率方面體現(xiàn)最明顯。與生活在低綠植居住環(huán)境的女性相比，生活在高綠植居住環(huán)境的女性呼吸道疾病死亡率降低34%，癌癥死亡率降低13%。

詹姆斯博士分析指出，最新研究結(jié)果與環(huán)保領(lǐng)域的一些建議是一致的。比如，綠色植物可減少空氣污染，降低噪音，改善環(huán)境，增加運(yùn)動(dòng)機(jī)會(huì)等等。這些都有益身體健康。

（轉(zhuǎn)自《中國(guó)中醫(yī)藥報(bào)》2016-04-28陳希/文）

Expression Differences of CAPN3 Gene and Its Correlation Analysis with Meat Quality Traits in Tibet and Duroc Pigs

TAO Xuan1，2,GU Yiren1，2,LIANG Yan1，2,YANG Xuemei1，2,ZHONG Zhijun1，2, CHEN Xiaohui1，2,YANG Yuekui1，2,ZENG Kai1，2,LV Xuebin1，2
(1.Sichuan Animal Science Academy,Chengdu 610066,China;2.Animal Breeding and Genetics Key Laboratory of Sichuan Province,Chengdu 610066,China)

To investigate the differential expression of Calpain3(CAPN3)gene between Tibet(a fatty, indigenous,Chinese breed)and Duroc(a leaner,Western breed)pigs.The expression differences of CAPN3 gene in longissimus dorsi muscle were measured in two pig breeds at the age of 180 days by using QRT-PCR approach,their correlations withcross sectional area of muscle fiber(CSA)and shear stress were also analyzed.The results showed that theexpression level of CAPN3 mRNA in Tibet pigs was significantlyhigher than that of Duroc pigs at the age of 180 days(P＜0.05).The correlation analysis results showed that theexpression level of CAPN3 mRNA had significant negative correlation with CSA and shear stress(P＜0.05).These results suggested that the mRNA level of CAPN3 gene in longissimus dorsi muscle are different in Tibet and Duroc pigs at the age of 180 days,which provided some data for further study on elucidating the molecular mechanism of growth of muscle fibers and shear stress.

pig;longissimus dorsi muscle;QRT-PCR;CAPN3 gene;cross sectional area of muscle fiber;shear stress

S828.8

A

1002-1957(2016)04-0076-03

2016-06-22

國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-綜合試驗(yàn)站（CARS-36）；四川省科技支撐計(jì)劃（2014NZ0092）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系四川創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（sccxtd-001）；四川省財(cái)政運(yùn)行專項(xiàng)（SASA2014 CZYX001）；四川省基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（SASA2014A04）；四川省基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（SASA2013B02）

陶璇（1982-），男，四川金堂人，助理研究員，碩士，主要從事豬遺傳育種與繁殖研究工作.E-mail:taoxuan0106＠163.com

呂學(xué)斌（1965-），男，研究員，博士，主要從事豬遺傳育種研究工作.E-mail:lvxuebin＠21cn.com