白藜蘆醇對卵泡顆粒細胞線粒體的調(diào)節(jié)作用及人工輔助生殖效果的影響

陳 蘭，胡 沙 ，李素萍△

(1.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院婦科，湖北恩施 445000；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢 430022)

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白藜蘆醇對卵泡顆粒細胞線粒體的調(diào)節(jié)作用及人工輔助生殖效果的影響

陳 蘭1，胡 沙2，李素萍1△

(1.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院婦科，湖北恩施 445000；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢 430022)

目的 探討口服白藜蘆醇對卵泡顆粒細胞線粒體功能及人工輔助生殖技術(shù)(ART)效果的影響。方法 研究入組受試對象109例，其中，對照組59例，白藜蘆醇組50例。分析其顆粒細胞氧化應(yīng)激水平和線粒體功能，檢測胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局相關(guān)指標及不良反應(yīng)。結(jié)果 白藜蘆醇使顆粒細胞的還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化活性下降了28.57%(P<0.05)，同時也降低了丙二醛(MDA)水平(0.653±0.084)nmol/mL vs. (0.382±0.052)nmol/mL，(P<0.05)。白藜蘆醇增加了線粒體DNA(mtDNA)拷貝數(shù)(4.62±0.24)×105vs. (5.77±0.38)×105，(P<0.05)和ATP生成(2.516±0.160)pmol vs. (4.484±0.180)pmol，(P<0.05)。白藜蘆醇組較之對照組其卵成熟率(87.75% vs. 94.15%，P<0.05)、受精率(86.69% vs. 91.49%，P<0.05)和優(yōu)質(zhì)胚胎率(44.30% vs. 51.22%，P<0.05)均顯著提高，且尚未發(fā)現(xiàn)有明顯的不良反應(yīng)。結(jié)論 白藜蘆醇可能對提高ART的成功率具有一定的輔助作用。

人工輔助生殖技術(shù)；白藜蘆醇；顆粒細胞

人工輔助生殖技術(shù) (assisted reproductive technology,ART) 是目前治療不孕不育的重要方法之一。目前，全球1.1%～2.0%的新生兒依靠輔助生殖技術(shù)出生，這一技術(shù)的發(fā)展還在不斷的進展中[1]。在ART的開展過程中，顆粒細胞 (granulosa cells,GCs) 對胚胎著床率和妊娠率具有重要的作用。顆粒細胞是組成卵泡的主要細胞成分，調(diào)節(jié)了卵母細胞的成熟及其胞核和胞質(zhì)的正常分裂。而顆粒細胞線粒體的功能與卵母細胞的質(zhì)量，以及女性生育能力具有密切的關(guān)系[2-3]。因此，調(diào)節(jié)線粒體功能可能是改善卵母細胞活性和提高ART成功率的有效途徑之一。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種富含于桑葚、花生和葡萄等植物果實內(nèi)的天然小分子多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、調(diào)節(jié)線粒體功能的作用[4]。有研究顯示，Res對于體外培養(yǎng)的卵泡及受精卵均有正向的調(diào)節(jié)作用[5-6]，而口服Res對于顆粒細胞的作用及對ART成功率的影響尚鮮有報道。因此，本研究將就口服Res對志愿者卵泡顆粒細胞線粒體功能及ART的效果進行探討，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究選擇2010年9月至2012年4月來武漢協(xié)和醫(yī)院輔助生殖中心接受ART的患者120名，分為對照組和Res組各60名，均采用常規(guī)體外受精-胚胎移植術(shù)(IVF-ET)。所有入組對象均經(jīng)過腹腔鏡、子宮輸卵管造影術(shù)、生殖內(nèi)分泌檢查、精液檢查、遺傳學(xué)檢查及B超等相關(guān)檢查，證實不育原因主要為輸卵管盆腔因素、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征，符合IVF-ET術(shù)的適應(yīng)證，并排除泌尿生殖系統(tǒng)感染、性傳播疾病、遺傳疾病、子宮疾患等禁忌證，排除男性少弱精癥或無精癥等對研究結(jié)果有影響的男方因素。患者均有意愿接受IVF-ET術(shù)，并告知藥物可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)，簽署知情同意書，告知受試對象在該項研究中具有自主權(quán)。Res組給予Res膠囊(GNC,美國)，500mg/d，連續(xù)服用6周，于取卵前停服。本研究入組受試對象120名，研究結(jié)束時保留受試對象109名，其中，對照組59名，Res組50名：對照組失訪1例，Res組不能耐受治療6例，失訪4例。兩組間患者年齡、不孕時間、基礎(chǔ)卵泡數(shù)目、激素基礎(chǔ)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組一般情況比較

1.2 方法

1.2.1 促排卵方案及顆粒細胞獲取 所有入組對象均采用長方案控制性促排卵。(1)于黃體中期使用短效促性腺激素釋放激素激動劑皮下注射(GnRH-a,triptorelin，德國輝凌)，劑量0.05mg/d。在此過程中，通過B超監(jiān)測雙側(cè)卵泡數(shù)量及大小，使卵泡直徑均小于8mm，如出現(xiàn)卵泡囊腫則B超引導(dǎo)下穿刺引流。(2)根據(jù)患者情況注射促性腺激素(Gn,珠海麗珠)，直至出現(xiàn)1個以上直徑大于18mm的卵泡，予以肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(hCG,珠海麗珠) 10000U。注射hCG后36h，在異丙酚麻醉下經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)穿刺取卵。取卵后1h使用透明質(zhì)酸酶脫顆粒細胞，并將脫落顆粒細胞，2500r/min，離心10min，收集細胞團用于后續(xù)實驗。卵泡行IVF，并于72h后移植卵裂期胚胎。移植4周后，行B超檢查，以宮內(nèi)見孕囊確定臨床妊娠。

1.2.2 實驗室檢測 氧化應(yīng)激水平由丙二醛(MDA)和還原型輔酶Ⅱ(NAPDH)活性反映。提取顆粒細胞團的蛋白，利用MDA試劑盒(南京建成，中國)測定MDA水平，使用NADPH氧化活性試劑盒(Genmed Scientifics,美國)。線粒體的ATP生成采用ATP檢測試劑盒(碧云天，中國)分析。線粒體DNA(mtDNA)拷貝數(shù)比較采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)的方法，以MT-ND1基因反映mtDNA的拷貝數(shù)，以HGB基因作為內(nèi)參。ND1基因的引物如下。上游：5′-CCC TAA AAC CCG CCA CAT CT-3′，下游：5′-GAG CGA TGG TGA GAG CTA AGG T-3′；HGB基因的引物為：上游：5′-GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG A-3′，下游：5′-CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG-3。MT-ND1擴增條件為：95℃ 10min，95℃ 15s 40個循環(huán)，60℃ 1min；HGB的擴增條件為：95℃ 10min，95℃ 15s 40個循環(huán)，56℃ 1min。

1.2.3 胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的評價指標 本研究利用卵成熟率、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率對胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局進行評價。卵成熟率=MⅡ卵數(shù)/獲卵總數(shù)×100%；受精率= 2PN數(shù)/ MⅡ卵數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=Ⅰ～Ⅱ級胚胎數(shù)/獲卵總數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 Res對顆粒細胞氧化應(yīng)激水平的影響 口服Res使卵泡顆粒細胞的NADPH氧化活性下降了28.57%，并顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外，Res組顆粒細胞的MDA水平(0.382±0.052)μmol/mL顯著的低于對照組(0.653±0.084)nmol/mL，(P<0.05)，見圖1。

2.2 Res對顆粒細胞線粒體功能的影響 Res顯著的提高了卵泡顆粒細胞mtDNA的拷貝數(shù)，從對照組的(4.62±0.24)×105上升為(5.77±0.38)×105(P<0.05)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Res組線粒體ATP的合成(4.484±0.180)pmol顯著高于對照組(2.516±0.160)pmol，其能量代謝水平較高(P<0.05)，見圖2。

A：Res對顆粒細胞NADPH氧化活性的作用；B：Res對顆粒細胞MDA水平的作用。*:P<0.05，與對照組比較。

A：Res對顆粒細胞mtDNA的作用；B：Res對顆粒細胞ATP生成的作用。*:P<0.05，與對照組比較。

2.3 口服Res對胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的作用 對照組移植59周期，Res組移植50周期，后者的卵成熟率由87.75%上升為94.15%，受精率由86.69%上升為91.49%，優(yōu)質(zhì)胚胎率由44.30%上升為51.22%，3項指標均顯著高于對照組(P<0.05)。Res組的臨床妊娠率為48.0%，高于對照組的44.1%，但二者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 Res對胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的影響

2.4 藥物不良反應(yīng)評價 對照組和Res組在畸胎率、死胎率及流產(chǎn)率上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。孕婦發(fā)生妊娠高血壓疾病和妊娠期糖尿病的比率在二組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 Res的不良反應(yīng)評價[n(%)]

3 討 論

Res作為一類天然小分子多酚類化合物，其抗氧化作用逐步受到民眾的關(guān)注。近年來，較多的研究表明，Res與女性健康密切相關(guān)。有研究顯示，Res具有類雌激素效應(yīng)，可顯著增加卵巢和子宮的濕質(zhì)量，這一作用依賴于Res與雌激素α和β受體的結(jié)合[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，口服Res(500mg/d，6周)可顯著的降低卵泡顆粒細胞的氧化應(yīng)激水平，增加顆粒細胞線粒體的合成和ATP生成。這一作用與前期的體外細胞實驗相類似。早期研究顯示，Res可通過抑制脂氧合酶和環(huán)加氧酶的活性，減少顆粒細胞的凋亡[9]。Sugiyama等[5]研究也指出Res通過增加顆粒細胞的線粒體生物合成和降解，從而對卵母細胞的生長發(fā)揮了積極的作用。而Res對顆粒細胞的抗氧化作用可能與抑制核因子κB(NF-κB)，抑制環(huán)加氧酶活性等作用有關(guān)[10]。

另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，Res增高了IVF-ET后的卵成熟率、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率；此外，Res組增高了臨床妊娠率，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這與Res對顆粒細胞的積極作用有關(guān)。顆粒細胞對卵母細胞的成熟具有重要的作用[11]。同時，Res對于卵泡細胞亦有直接的保護作用。Res可減緩卵泡閉鎖的過程，增加卵泡的儲備量，延長卵巢的功能期[12]。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，給予老年小鼠Res后，改善了其卵巢的端粒酶活性、端粒長度和年齡相關(guān)基因的表達水平。此外，也有研究者認為，Res對于多囊卵巢綜合征及IVF術(shù)后的卵巢過度刺激綜合征同樣具有預(yù)防作用，但仍需進一步證實[10]。

近期有報道指出，孕期使用Res可能對阻礙胎兒胰腺的發(fā)育，增加子代罹患糖尿病的風險[14]。本研究于ART前期給予患者口服Res，其不良反應(yīng)尚未見報道。因此，筆者對口服Res的不良反應(yīng)發(fā)生率進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組在畸胎率、死胎率、流產(chǎn)率及妊娠高血壓疾病和妊娠期糖尿病的發(fā)生率上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而前期的動物實驗同樣也沒有發(fā)現(xiàn)Res具有致畸等不良反應(yīng)[15]。

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Effect of resveratrol on the granulosa cell mitochondrial function and ART pregnancy outcome

Chen Lan1,Hu Sha2,Li Suping1△

(1.Department of Gynaecology and Obstetrics,University Hospital of Hubei University for Nationalities,Enshi,Hubei 445000，China;2.Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science andTechnology,Wuhan,Hubei 430022,China)

Objective To explore the effect of resvertrol supplement to the granulosa cell mitochondrial function and assisted reproductive technology (ART) outcome.Methods The study would analyze the level of oxidative stress and mitochondrial function in granulosa cell from 109cases with or without resvertrol supplement,including 50cases in resvertrol group and 59cases as control group.The embryo quality,IVF-ET outcome and adverse reactions would be observed.Results Resveratrol reduced the NADPH oxidation activity of granule cells by 28.57%(P<0.05),and also decreased the MDA content (0.653±0.084)nmol/mL vs. (0.382±0.052)nmol/mL,(P<0.05).Moreover,resvertrol supplement improved the mitochondrial DNA copy number (4.62±0.24)×105vs. (5.77±0.38)×105,(P<0.05) and ATP production (2.516±0.160)pmol vs. (4.484±0.180)pmol,(P<0.05) in granulosa cell.Compared with the control group,the oocyte maturation rate (87.75% vs. 94.15%,P<0.05),fertilization rate (86.69% vs. 91.49%,P<0.05) and high quality embryo rate (44.30% vs. 51.22%,P<0.05) in the resveratrol group were significantly increased.Meanwhile,the resvertrol supplement did not show any adverse effect.Conclusion Resvertrol might be a adjunctive therapy to the ART.

assisted reproductive technology；resvertrol；granulosa cell

陳蘭(1980-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用研究?！?/p>

論著·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.016

R71

A

1671-8348(2016)29-4080-03

2016-02-22

2016-04-11)