瓜蔞根抗氧化活性物質(zhì)的提取及其活性評(píng)價(jià)

李婉珍，楊 成，朱龍寶，魏勝華

(1.安徽工程大學(xué) 微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖 241000；2.皖南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,安徽 蕪湖 241000)

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瓜蔞根抗氧化活性物質(zhì)的提取及其活性評(píng)價(jià)

李婉珍1，楊 成2，朱龍寶1，魏勝華1

(1.安徽工程大學(xué) 微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖 241000；2.皖南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,安徽 蕪湖 241000)

以對(duì)1,1-苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)的清除率為指標(biāo)，研究了甲醇濃度、料液比、提取溫度及提取時(shí)間對(duì)瓜蔞根抗氧化活性成分提取效果的影響.結(jié)果表明，最佳提取條件為甲醇濃度65%、料液比1∶5、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間70 min；在此條件下，相對(duì)自由基清除率由58.6%升高到78.1%，提高了近20%；同時(shí)建立了D-半乳糖衰老模型，對(duì)模型小鼠血漿中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量進(jìn)行檢查，考察其體內(nèi)抗氧化效應(yīng).通過高劑量瓜蔞根提取物灌胃能夠顯著地提高衰老模型小鼠血漿中超氧化物歧化酶(SOD)活力，降低丙二醛(MDA)含量，相比模型對(duì)照組SOD活力提高了38.966 U/mL，MDA含量降低了2.853 nmol/mL，表明瓜蔞根提取物具有較好的抗氧化活性.

瓜蔞根；提取工藝；優(yōu)化；抗氧化活性

研究發(fā)現(xiàn)，作為機(jī)體正常代謝產(chǎn)物的自由基與人類很多疾病有關(guān)[1-2].自由基清除劑可以減少自由基，起到減緩因自由基過多造成的氧化損傷作用，對(duì)延緩機(jī)體衰老具有一定的積極效應(yīng)[3].目前發(fā)現(xiàn)多種中藥提取物具有抗氧化作用，從中藥中尋找高效、價(jià)廉、低毒甚至無毒的抗氧化劑倍受關(guān)注[3].

瓜蔞(TrichosanthesKirilowii Maxim)屬葫蘆科多年生草本植物，是常用的中草藥之一.瓜蔞根(又名天花粉)，其主要成分為蛋白質(zhì)、淀粉、多糖及皂苷等，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等功效.皂苷廣泛分布于多種陸生植物，可抑制過氧化脂質(zhì)生成，具有抗衰老作用，但對(duì)其抗氧化活性的研究較少[4-5].研究以體外抗氧化活性為指標(biāo)提取瓜蔞根抗氧化活性物質(zhì)，并采用與體內(nèi)抗氧化評(píng)價(jià)相結(jié)合的方法，研究瓜蔞根的抗氧化活性，以便為深入應(yīng)用瓜蔞提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓜蔞由安徽省金寨縣惠農(nóng)瓜蔞專業(yè)合作社提供，將其粉碎并過80目篩備用;DPPH自由基(Sigma公司)；高純D-半乳糖(合肥博美生物有限公司)；超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)試劑盒、丙二醛(Maleic Dialdehyde, MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；甲醇等均為國產(chǎn)分析純;實(shí)驗(yàn)小鼠18～25 g，雌雄各半，皖南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房提供.

1.2 主要儀器設(shè)備

低速離心機(jī)(TD5Z型，上海安亭科學(xué)儀器廠)；超聲波振蕩儀(DFS-200G型，海析生超聲儀器有限公司)；電子天平(FC104型，上海精密科學(xué)儀器公司)；高速粉碎機(jī)(FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9076A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52CS型，上海亞榮儀器設(shè)備有限公司)；酶標(biāo)儀(EPOCH型，美國Biotek公司).

1.3 瓜蔞根抗氧化活性物質(zhì)提取工藝優(yōu)化

(1)超聲波輔助提取工藝流程.瓜蔞根→干燥→粉碎→過80目篩→超聲波提取→離心→活性測(cè)定.

(2)單因素實(shí)驗(yàn).稱取瓜蔞根干粉1 g，按料液比1∶10(g/mL)，采用濃度為55%甲醇作為提取溶劑，提取溫度50 ℃，超聲波提取10 min，作為單因素篩選實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)條件.研究甲醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間中的某一因素時(shí)，其他條件保持不變，單因素實(shí)驗(yàn)水平設(shè)計(jì)如表1所示.

表1 單因素實(shí)驗(yàn)水平設(shè)計(jì)

(3)瓜蔞根抗氧化活性物質(zhì)超聲提取工藝優(yōu)化.依據(jù)文獻(xiàn)[6-7]中2.1體外抗氧化單因素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，以自由基清除率為指標(biāo)、甲醇為提取劑，采用正交試驗(yàn)法對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，分別確定最佳提取劑濃度、料液比、溫度及時(shí)間4個(gè)因素，每個(gè)實(shí)驗(yàn)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平正交實(shí)驗(yàn)如表2所示.

表2 試驗(yàn)因子及水平L9(34)

(4)瓜蔞根抗氧化活性物質(zhì)體外自由基清除活性.體外自由基清除活性測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[8-9].計(jì)算方法可以表示為：

1.4 瓜蔞根提取物體內(nèi)抗氧化活性測(cè)定

(1)動(dòng)物造模.參照文獻(xiàn)[10]，將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為6組，每組6只，設(shè)陽性對(duì)照組(0.1% VC)、正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及藥物組.除正常組皮下注射生理鹽水外，其余5組每天125 mg/kg皮下注射D-半乳糖造模，同時(shí)對(duì)藥物組按劑量90 mg/kg、60 mg/kg、10 mg/kg進(jìn)行灌胃給藥，陽性對(duì)照給予等量的VC，正常、模型對(duì)照灌胃等量水，連續(xù)灌胃21 d.眼球取血，肝素抗凝離心，棄沉淀留血漿冷藏待用.

(2)小鼠血漿中SOD活力和MDA含量的測(cè)定.取上述冷藏血漿，按試劑盒內(nèi)說明書指示進(jìn)行SOD活力和MDA含量測(cè)試.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

(1)甲醇濃度對(duì)提取物抗氧化活性的影響.采用甲醇提取活性成分，研究不同濃度甲醇對(duì)清除自由基效果的影響，結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，自由基清除率與甲醇濃度關(guān)系呈類似正態(tài)分布效果，隨甲醇濃度增加自由基清除率上升，當(dāng)甲醇濃度達(dá)到65%時(shí)，清除率達(dá)到最高值即74.55%，而后反而下降.可能是由于瓜蔞根主要成分為蛋白質(zhì)，當(dāng)遇到醇時(shí)，隨醇濃度增加變性的蛋白質(zhì)可能阻礙了有效活性物質(zhì)的釋放，從而出現(xiàn)隨醇濃度增加，清除自由基活性呈現(xiàn)先高后低的結(jié)果[11].

(2)料液比對(duì)提取物抗氧化活性的影響.對(duì)料液比的選擇，溶劑不能太少，否則黏度大，過濾或離心困難；也不易太多，否則不利于后期濃縮.因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，隨著料液比的增加，自由基清除率逐漸降低，說明可能料液比大并不有利于自由基清除活性物質(zhì)滲出，因而實(shí)驗(yàn)采用1∶5的料液比為宜.

(3)提取溫度對(duì)提取物抗氧化活性的影響.實(shí)驗(yàn)溫度過高會(huì)影響目標(biāo)物的穩(wěn)定性，所以采用30～70 ℃進(jìn)行提取，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，隨著提取溫度的升高，瓜蔞根活性成分的自由基清除率也隨之升高.結(jié)果顯示活性物質(zhì)在30～70 ℃溫度范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，在70 ℃溫度條件下自由基清除率最高，可能是由于在此溫度條件下其他提取物如肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)變性而以沉積形式析出，減少了干擾，從而提高了清除率；也可能其中的皂苷活性組分進(jìn)一步被分解成其他中間活性產(chǎn)物[12]，因此選擇70 ℃作為瓜樓根活性成分中自由基清除劑的提取溫度.

(4)超聲波時(shí)間對(duì)提取物抗氧化活性的影響.超聲波輔助提取具有省時(shí)、節(jié)能、提高提取率等優(yōu)點(diǎn)，其對(duì)提取物抗氧化活性的影響如圖4所示.由圖4可知，當(dāng)樣品濃度一定時(shí)，隨著超聲波提取時(shí)間的延長(zhǎng)，自由基清除率呈現(xiàn)先高后低的趨勢(shì).這可能是因?yàn)闀r(shí)間越長(zhǎng)活性成分提取越完全，但同時(shí)雜質(zhì)滲出也在增加，且時(shí)間太長(zhǎng)提取物中抗氧化活性成分也可能被空氣氧化，因此，超聲提取時(shí)間以60 min為宜.

圖1 甲醇濃度對(duì)提取物抗氧化活性的影響 圖2 料液比對(duì)提取物抗氧化活性的影響

圖3 提取溫度對(duì)提取物抗氧化活性的影響 圖4 超聲波時(shí)間對(duì)提取物抗氧化活性的影響

2.2 超聲提取優(yōu)化工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)分析如表3所示.由表3可知，極差最大的為主要影響因素，較小的為次要因素，各因素對(duì)指標(biāo)的影響程度為D>B>A>C，即提取時(shí)間>料液比>甲醇濃度>提取溫度，超聲波時(shí)間的影響最大，其次是料液比和甲醇濃度，提取溫度影響最小.方差分析如表4所示.由表4可進(jìn)一步看出各因子對(duì)自由基清除劑生成的影響，在95%的置信度下，B、D對(duì)指標(biāo)的影響均為顯著.綜合分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)最佳組合為A2B1C2D3，即提取工藝為甲醇濃度65%、料液比1∶5、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間70 min.

表3 正交實(shí)驗(yàn)分析表

表4 方差分析表

2.3 瓜蔞根提取物對(duì)小鼠血漿SOD活性和MDA含量的影響

提取物對(duì)衰老小鼠血清SOD活性和MDA含量的影響如表5所示.由表5可知，小鼠血漿中SOD活性和MDA含量在組與組間有很顯著的差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).針對(duì)血漿SOD活性，與正常組比較，陽性對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，模型組差異極顯著(P<0.01)，說明模型可用；與模型組比較，陽性對(duì)照組和藥物高劑量組均存在顯著差異(P<0.05)，與陽性對(duì)照組比較，藥物高劑量給藥，在SOD活性方面差異不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明藥物高劑量供試提取物可顯著提高小鼠血漿SOD活性.針對(duì)MDA含量，與模型相比，正常組、陽性對(duì)照組和不同劑量藥物組均差異顯著(P<0.05)，表明在該濃度條件下，供試藥物都能降低MDA含量，藥物組間無差異(P>0.05).

表5 提取物對(duì)衰老小鼠血清SOD活性和MDA含量的影響±s，n=6)

3 結(jié)論

通過正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)可知，影響瓜蔞根抗氧化活性成分超聲輔助提取的主次因素為提取時(shí)間、料液比、甲醇濃度和提取溫度，且影響順序依次為提取時(shí)間>料液比>甲醇濃度>提取溫度；確定最佳提取工藝條件為甲醇濃度65%、料液比1∶5、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間70 min.此條件下活性提取物對(duì)體外DPPH相對(duì)清除率達(dá)到78.18%；體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，瓜蔞根提取物在較高劑量下具有抗氧化活性，提高血漿中SOD活力，降低MDA含量.實(shí)驗(yàn)只對(duì)瓜蔞根抗氧化活性在提取過程中的影響因素進(jìn)行了研究，其他方面還有待進(jìn)一步完善.

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Antioxidant Components Extraction from Trichosanthes Root and Activity Evaluation

LI Wan-zhen1,YANG Cheng2,ZHU Long-bao1,WEI Sheng-hua1

(1.Anhui Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000, China;2.College of Basic Medical Sciences,Wannan Medical College,Wuhu 241000, China)

Based on the capacity of scavenging DPPH free radical of bio-active ingredients fromtrichosanthesroot,the effect of methanol concentration,solid-liquid ratio,extraction temperature and extraction time on the extraction process were to be optimizd.The result showed that the free radical scavenging rate increased by 20%,rangin from 58.6% to 78.1% under the condition of 65% methanol,1∶5 ratio of material to solvent 70 min and 60 ℃. At the same time,the aging model of D-galactose was established to investigate the anti-oxidation activity through detecting the activity of SOD and the and contents of malondiadehyde (MDA) of mouse plasma.The result showed that the activity of SOD was enhanced by 38.966 U/mL,and the content of MDA was lowered 2.853 nmol/mL and thattrichosanthesroot extract has good antioxidant activity.

trichosanthesroot;extraction process;optimization;anti-oxidant activity

1672-2477(2016)05-0063-05

安徽省高校自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(KJ2013B027)

李婉珍(1979-)，女，安徽六安人，講師，博士研究生．

Q946

A