RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定石榴皮和石榴汁中鞣花酸的含量

范高福，付恩桃，湯 潔，劉修樹，王 瑋

(1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物應(yīng)用技術(shù)系，安徽 合肥 238000；2.合肥市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽 合肥 238000)

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RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定石榴皮和石榴汁中鞣花酸的含量

范高福1，付恩桃1，湯 潔1，劉修樹1，王 瑋2

(1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物應(yīng)用技術(shù)系，安徽 合肥 238000；2.合肥市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽 合肥 238000)

目的：建立同時(shí)檢測(cè)石榴皮、汁中鞣花酸的含量測(cè)定方法。方法：采用反相高效液相色譜法，Hypersil C18 (250 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱，以乙腈-0.3% TFA(20 ∶80)為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。結(jié)果:鞣花酸0.1048～20.96 μg/mL之間線性關(guān)系良好(r=0.9999)，平均加樣回收率為99.55%(RSD=1.44%，n=9)。結(jié)論:此方法靈敏快速、準(zhǔn)確易行，可用于石榴皮、汁中鞣花酸含量的同時(shí)檢測(cè)。

鞣花酸;石榴皮;石榴汁;反相高效液相色譜法;含量測(cè)定

石榴(PunicagranatumL.)，別名安石榴，為石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木，具有藥食同源價(jià)值，可以離體種植培養(yǎng)[1]，主要分布于安徽懷遠(yuǎn)、山東棗莊、陜西臨潼、四川會(huì)理、云南蒙自、新疆葉城等地區(qū)。石榴皮和石榴汁分別為石榴的干燥果皮和新鮮果汁，均含有豐富的多酚類、類黃酮、花色素等生物活性物質(zhì)[2]，其中多酚類鞣花酸(ellagic acid, EA)成分研究較多，呈多酚二內(nèi)酯結(jié)構(gòu)特征，是沒食子酸的二聚衍生物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎及抗菌等多種藥理作用[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道以石榴皮提取物測(cè)定鞣花酸含量方法較多，而以石榴汁為原料測(cè)定少見，未見對(duì)安徽地區(qū)石榴皮、汁中鞣花酸含量同時(shí)測(cè)定方法具體報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，建立石榴皮、汁提取物中鞣花酸含量同時(shí)測(cè)定方法，為安徽本地石榴提取物的深加工研究與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴：安徽懷遠(yuǎn)(購(gòu)自蚌埠市石榴水果批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院彭華勝教授鑒定為石榴科石榴屬石榴)；甲醇、乙腈為色譜純；鞣花酸對(duì)照品：純度≥95%(美國(guó)Sigma，批號(hào)：2075083)；Milli-Q超純水，其他試劑均為分析純；石榴汁、皮提取物，本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo-U3000 UHPLC系統(tǒng)：配有TCC-3000RS紫外檢測(cè)器及DAD-3000二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)賽默飛公司；Milli-Q Biocel超純水系統(tǒng)；KQ-2200E型超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)；FA1004型電子天平(天津天馬)，HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)，SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科教儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) ；流動(dòng)相：乙腈：0.3%三氟乙酸(Trifluoroacetic acid ，TFA)(20 ∶80)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。在此色譜條件下，鞣花酸特征峰峰型良好，其色譜圖如圖1所示。

圖1 HPLC色譜圖

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定鞣花酸對(duì)照品10.48 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成濃度為0.1048 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液[4]。

1.3.3 供試品石榴汁溶液的制備[5]稱取新鮮石榴，剝皮去籽榨汁，4000 r/min離心除去懸浮物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮體積約至原來1/10，取10 g濃縮物，再用酸化甲醇(含鹽酸1.2 mol/L和0.2 g維生素C)50 mL超聲1 h，溶解后10000 r/min離心5 min后再取上清液，備用。酸化甲醇加入量=W/2*10(W為濃縮物質(zhì)量)。

1.3.4 供試品石榴皮溶液的制備 將石榴皮在30 ℃晾干，用粉碎機(jī)打成粉末，精密稱取1.005 g，加80%(φ)丙酮100 mL浸漬約6 h，超聲(功率500 W，頻率40kHz)處理1 h，濾過，殘?jiān)?0%(φ)丙酮30 mL洗脫，合并濾液和洗滌液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干燥物，加50%酸化甲醇溶液100 mL(含1. 2 mol /L的鹽酸和0. 2 g維生素C)，90 ℃回流，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干燥物，用甲醇溶解，定容100 mL 容量瓶中[6-7]。精密吸取10 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，0.45 μm的微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

1.3.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 對(duì)照品溶液采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行掃描，吸收?qǐng)D譜見圖2。結(jié)果表明在254 nm處鞣花酸有最大吸收，無(wú)干擾峰出現(xiàn)，且分離度較好。最終確定254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)[8-9]。

圖2 鞣花酸對(duì)照品溶液二極管陣列掃描圖

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

精密吸取鞣花酸對(duì)照品溶液適量，稀釋后得濃度為0.1048、0.524、1.048、2.096、5.240、10.48、20.96 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，照“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為橫坐標(biāo)(X)，系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為縱坐標(biāo)(Y)，繪制鞣花酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，鞣花酸的回歸方程為：Y=0.6285X+0.0468，r=0.9999(n=7)，線性范圍為0.1048～20.96 μg/mL。

2.2 精密度試驗(yàn)

取濃度為1.048 μg/mL的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量為10 μL，得鞣花酸的峰面積的RSD 0.28%，說明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取石榴汁樣品溶液按上述色譜條件分別在0、1、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，計(jì)算得鞣花酸的峰面積的RSD 0.41%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取石榴汁樣品平行制取供試品溶液6份并分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，鞣花酸峰面積的RSD 1.02%，重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知質(zhì)量濃度(1.048 μg/mL)的石榴汁10 mL，共9份，按照低、中、高三個(gè)濃度分別加入適量鞣花酸對(duì)照品溶液，按1.3.3項(xiàng)下方法制備。并進(jìn)樣分析，計(jì)算鞣花酸的平均回收率為99.55%(見表1)，RSD 1.44%。

表1 鞣花酸加樣回收率(n=9)

2.6 樣品含量測(cè)定

取安徽懷遠(yuǎn)產(chǎn)地石榴2種，分別為白石榴(A品種)和紅石榴(B品種)，按照“1.3.3和1.3.4”項(xiàng)下制備供試品石榴汁、皮溶液，按外標(biāo)法測(cè)定鞣花酸的含量，結(jié)果見表2。

表2 石榴汁、皮中鞣花酸的含量(n=3)

3 結(jié)論與討論

采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定安徽石榴皮、汁中鞣花酸含量時(shí)，考察了樣品提取過程及樣品不同部位對(duì)提取物含量的影響。通過酸化提取液可加速提取物石榴鞣花酸的浸出，因提取物石榴鞣花酸具有多酚結(jié)構(gòu)，易氧化，加入維生素C可阻礙提取過程中石榴鞣花酸的氧化變質(zhì)。通過對(duì)石榴汁、皮的相同處理方法，結(jié)果表明石榴皮部位鞣花酸含量是石榴汁部位約3.5～6倍，白石榴品種鞣花酸含量是紅石榴品種約1倍。另外，在乙醇、丙酮、甲醇不同溶劑對(duì)石榴皮、汁中石榴鞣花酸提取物溶解度對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇中的溶解度較好，且干擾峰較少，可以滿足樣品制備的需要，因此選擇甲醇作為樣品制備的溶劑。

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該樣品以乙腈-0.2%TFA作為流動(dòng)相有可能實(shí)現(xiàn)預(yù)期的色譜峰分離，并在此流動(dòng)相系統(tǒng)基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行比例篩選，最終確定以乙腈-0.3%TFA(20 ∶80)為流動(dòng)相體系時(shí)，樣品峰和雜質(zhì)峰能夠?qū)崿F(xiàn)較好的分離，且分離度大于1.5。此外，考察了流動(dòng)相的不同pH對(duì)峰形的影響，分別選擇加入0.1%、0.2%、0.3%及0.4%的TFA的出峰情況，結(jié)合峰的分離和峰形，最終選擇加入0.3%的TFA作為流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定石榴皮、汁中鞣花酸含量的反相高效液相色譜(RP-HPLC)方法，經(jīng)方法學(xué)考察，該方法符合《中國(guó)藥典(2015年版)》中有關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的要求[10]，具有靈敏快速、準(zhǔn)確易行、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于準(zhǔn)確測(cè)定石榴皮、汁中鞣花酸的含量。

本課題組收集了安徽地區(qū)主產(chǎn)地懷遠(yuǎn)的石榴樣品，并對(duì)其石榴皮、汁中鞣花酸含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明石榴皮所含鞣花酸含量較石榴汁中明顯高，白石榴品種所含鞣花酸含量較紅石榴品種高，提示以石榴皮為藥材有一定的合理性，并可作為石榴中鞣花酸質(zhì)量控制提供參考。此外，目前石榴主要作為水果食用，加工主要是取石榴瓤榨汁為主，其石榴皮多作為廢物處理，為石榴皮變廢為寶，回收再利用提供依據(jù)。

[1]彭麗萍，郜海蓮．防止軟籽石榴外植體褐變的研究[J]．安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，25(2)：28-31．

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[3]馮立娟，陶吉寒，尹燕雷，等．石榴功能物質(zhì)鞣花酸研究進(jìn)展[J]．食品科學(xué)，2014，35(23)：325-330．[4]唐婧，鄭勝彪，張雪梅，等．超聲提取-高效液相色譜測(cè)定滁菊中的木犀草素[J]．安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，24(6)：48-51．

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[6]丁楠，高曉黎．HPLC法測(cè)定石榴皮提取物中鞣花酸的含量[J]．新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35(6)：770-772．

[7]周本宏，吳振華，劉春，等．高效液相色譜法測(cè)定石榴皮中鞣花酸的含量[J]．廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，21(6)：693-694．

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[9]陳孝娟，顧政一，徐芳，等．不同產(chǎn)地的石榴皮總多酚的含量測(cè)定[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22(3)：541-543．

[10]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典(四部)[S].2015年版,北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:59-61.

Content Simultaneous Determination of Ellagic Acid in Pomegranate Peel and Juice by RP-HPLC

FAN Gao-fu1, FU En-tao1, TANG Jie1, LIU Xiu-shu1,WANG Wei2

(1.Department of Biotechnology Applications, Hefei Vocational and Technical College, Hefei 238000, China;2. Hefei Institute for Food and Drug Control， Hefei 238000, China)

Objective: To estabish a method for the content determination of ellagic acid in pomegranate peel and juice. Methods: RP-HPLC method was used. The determination was carried out on Hypersil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)with mobile phase consisted of acetonitrile-0.3%TFA(20 ∶80)with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃. The detection wave length of ellagic acid was at 254 nm. Results: The line range was 0.1048～20.96 μg/mL for ellagic acid(r=0.9999). The average recoveries were 99.55%(RSD=1.44%, n=9). Conclusion: The method is sensitive and rapid, accurate and feasible for the content determination of ellagic acid in pomegranate peel and juice.

Ellagic acid;Pomegranate peel; Pomegranate juice; RP-HPLC; Content determination

(責(zé)任編輯：馬世堂)

2016-02-20

安徽省高校自然基金研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2015A440， KJ2016A616); 安徽省教育廳重點(diǎn)質(zhì)量工程項(xiàng)目(2014sxzx047)。

范高福(1982-), 男, 安徽省全椒縣人,碩士, 講師, 主要從事藥物制劑研究。

S132

A

1673-8772(2016)05-0067-04