蔡冬元,林繼華,鄧建平
(湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 410127)
戊炔草胺(propyzamide)作用于刺葡萄的倍性誘變研究
蔡冬元,林繼華,鄧建平
(湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 410127)
對照刺葡萄染色體數(shù)目為2n=2x=38[1-7],變異類型的染色體數(shù)目大多為2n→4x=76,少量為2n→2x=38+4、2n→2x=38+6;0.004%戊炔草胺處理對已萌發(fā)的刺葡萄種子浸漬24h有最佳倍性誘變效果,誘變率達41.7%;0.006%戊炔草胺處理套罩正處于生長狀態(tài)的芽,倍性誘變效果最佳,誘變率達42.8%。不同濃度的戊炔草胺分別作用于刺葡萄已萌發(fā)種子與正處于生長狀態(tài)的芽都有較好的倍性誘變效應(yīng)。用戊炔草胺為倍性誘變試劑,誘導(dǎo)染色體發(fā)生倍性變異,為選育無籽或少籽、大粒、優(yōu)質(zhì)的刺葡萄新品系提供育種材料。
戊炔草胺;秋水仙素;刺葡萄;多倍體;誘變
刺葡萄V.davidii屬東亞種群,2n=2x=38[1-7],是我國南方主要野生葡萄之一,主要分布在長江以南亞熱帶溫濕雨林叢山中,能較好適應(yīng)高溫多濕氣候條件,對葡萄?;疾『Π赘 ⑻烤也?、黑痘病等具有很好抗性,適應(yīng)性強[1-6],這一獨特表現(xiàn)為南方葡萄無公害化種植描繪了廣闊前景,也為葡萄耐濕性砧木及新品種選育等提供了優(yōu)秀資源與材料。刺葡萄的新蔓、嫩葉與果實色彩非常豐富,觀賞效果與價值比普通葡萄更高,是公園、庭院等處優(yōu)良垂直觀賞綠化植物。大多數(shù)刺葡萄果粒的皮色為蘭黑色或蘭紫色,藥用效果與價值比一般葡萄更顯著,更利于人們身體健康[2-5]。與栽培于長江以南的其它葡萄相比,刺葡萄更適于葡萄的加工與釀酒,其附加產(chǎn)品更豐富,附加值更高[1-5]。因刺葡萄具有上述幾方面獨特表現(xiàn),長江以南許多地方的農(nóng)民已把野生刺葡萄家植化并獲得了極大成功。
刺葡萄果粒較小,果內(nèi)含較多種子。已有利用秋水仙素處理刺葡萄已萌動種子[6]和生長芽[7],誘導(dǎo)染色體加倍而成功獲得刺葡萄多倍體(2n→4x=76)的研究報道[6-7]。但秋水仙素是一劇毒植物堿,操作過程中稍有不慎,即對處理對象和操作者帶來極大危害。戊炔草胺(propyzamide;CAS:23950-58-5,分子式:C12H11Cl2NO;分子量256.13)又叫快敵蜱;拿草特;戊炔草胺;炔苯酰草胺;戊炔草胺標準品;戊炔草胺標準溶液等,當(dāng)前生產(chǎn)上主要用于雜草的芽前除草[8-13]。它和秋水仙素一樣,是一種抗微管物質(zhì),當(dāng)它們與正在分裂的植物細胞接觸后,能有效抑制微管的聚合過程,阻礙紡錘絲形成,從而誘使植物細胞核內(nèi)染色體成功加倍[8-16]。近年來,國外已有將戊炔草胺作用于蘋果、梨、獼猴桃等植物染色體,并成功使這些植物染色體加倍的報道,認為戊炔草胺是除秋水仙素外又一適合植物染色體加倍的化學(xué)試劑,與秋水仙素相比,戊炔草胺具有低毒性、低濃度、低成本、高效率誘導(dǎo)染色體加倍等特點[8-12],是一種新型的植物倍性誘變劑?,F(xiàn)在國內(nèi)外還沒有將戊炔草胺運用于刺葡萄染色體并成功使其加倍的報道,本研究的意義是首次利用戊炔草胺(propyzamide)作用于已萌動的刺葡萄種子和即將萌動的刺葡萄芽,對其進行倍性誘導(dǎo),為得到粒大優(yōu)質(zhì),少籽或無籽的刺葡萄多倍體新類型與新品系提供倍性育種資源與材料。
試驗于2013年9月至2015年10月在湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院藤本植物園、湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)中心進行。
2013年9月15日從湖南生物機電職院藤本園刺葡萄植株已成熟果穗上收集種子,清洗晾干后用潔凈河沙層積貯藏。2014年3月5日,取5×300粒刺葡萄種子分別置于種子發(fā)芽盒,將發(fā)芽盒置于25℃恒溫箱中催芽至露白。
配制戊炔草胺溶液:將戊炔草胺充分溶于二甲基亞砜(DMSO),用蒸餾水定容配制成濃度為0.05%的母液,后分別稀釋配成濃度為0.003%、0.004%、0.005%戊炔草胺溶液各1 500 mL。后將已露白的刺葡萄種子浸漬其中。
戊炔草胺作用于已萌發(fā)的刺葡萄種子的倍性誘變試驗設(shè)計方案見表1:該試驗以浸漬法進行。清水浸漬為對照,設(shè)3次重復(fù),共12個處理;每發(fā)芽盒中盛裝不同濃度的處理溶液500 mL,浸漬催芽效果相同或基本的已萌發(fā)露白刺葡萄種子100粒,浸漬時間分別為12、24、36 h。
種子浸漬試驗在25 ℃恒溫搖床(旋轉(zhuǎn)頻率:40~400 r/min;擺振幅度:Φ25 mm)中進行。
刺葡萄種子浸漬處理完成后,用清水洗凈種子,分別播種于大棚內(nèi)“0.618側(cè)腰開孔”“黃金”營養(yǎng)缽中,統(tǒng)計成活率,觀測刺葡萄生長發(fā)育情況與倍性誘變效果。
表1 戊炔草胺浸漬刺葡萄種子的倍性誘變試驗設(shè)計Table 1 Experiment design of immersion of propyzamide concentration on Vitis davidii foex seed
2014年3月21日,從刺葡萄植株上選取生長基本相同、有15個芽(多的側(cè)芽抹除)、且已處于活動狀態(tài)的枝蔓12條,為保證芽抽發(fā)后形成新梢的能力一致,需將選中的枝蔓拉平綁縛。
戊炔草胺瓊脂膏的制備:將戊炔草胺配制成濃度為0.05%的母液,后分別稀釋配成濃度為0.004%、0.005%、0.006%、0.007%、0.008%的戊炔草胺溶液。將瓊脂(10%)充分溶解至上述配制好的各戊炔草胺溶液與清水中,分別制成用防水膠囊盛裝的各濃度戊炔草胺瓊脂膏與清水對照瓊脂膏。
該試驗以套罩法進行。以清水瓊脂膏套罩為對照,5個處理;每處理套罩已選定、并已拉平綁縛的2條刺葡萄枝蔓上的芽2×15=30個,用黑色膠布固定防水膠囊。
套罩6 d后,去掉膠囊,用清水洗凈粘附于芽與枝蔓上的瓊脂,后隨新梢的抽發(fā),葉與枝蔓的形成,仔細觀測各處理對葉片、枝蔓、果等組織器官生長發(fā)育影響與倍性誘變效果。
采用去壁低滲法和Giemsa(吉姆薩)染色法展開鏡檢與染色體數(shù)目觀測試驗。晴天上午8∶30~10∶00→分別從對照與經(jīng)戊炔草胺藥劑浸漬法和套罩法處理的刺葡萄植株與新抽發(fā)的新蔓上→取長度為1 cm的幼嫩莖尖或莖段→浸入0.002 mol/L 8-羥基喹啉液2 h→吸出藥液→添入0.075 mol/L KCl溶液→置于20℃溫度條件下浸泡20 min→25℃溫度條件下,用25%等份纖維素酶和果膠酶(混合酶液)酶解2~3 h→用蒸餾水沖洗2~3次后,置入蒸餾水中浸泡20 min→于現(xiàn)配的3∶1甲醇冰醋酸固定液中固定→取出,將材料搗碎,去除肉眼所見雜質(zhì)→涂片于玻片上→用pH值為6.8的Giemsa染色液染色2~3 h→置于顯微鏡下鏡檢,觀測單元視野中染色體數(shù)目并拍照。
觀測于浸漬播種、套罩刺葡萄芽后,伴隨刺葡萄植株的生長與新梢的發(fā)生進行。浸漬刺葡萄種子后,種子死亡率統(tǒng)計方法:種子死亡率=播種種子數(shù)(100粒)-存活植株數(shù)/播種種子數(shù)(100粒)×100%。
套罩刺葡萄芽后,萌芽率統(tǒng)計方法:
萌芽率=萌芽數(shù)/處理芽數(shù)(30個)×100%。各處理誘變率統(tǒng)計方法:
誘變率=產(chǎn)生的變異植株(變異枝蔓)數(shù)/鏡檢植株(鏡檢枝蔓)數(shù)×100%。
分別采集已停止生長,具有明顯變異特征葉片(2n→4x=76)與對照葉片(2n→2x=38)各50片,用電子數(shù)顯卡尺測量各處理葉片厚度,求平均值;用有機玻璃直尺測量各處理葉片的長度與寬度,分別求平均值;用電子天平稱取各處理葉片鮮重(W鮮);利用烘干法在烘箱里先70℃、后105℃將各處理葉片烘至恒重(W干),利用數(shù)學(xué)方法計算變異體葉片(4n)與對照葉片(2n)含水量:葉片含水量=(W鮮-W干)/W鮮×100%。
晴天上午8∶30~10∶00,分別取已停止生長、具有明顯變異特征的葉片(4n)與對照葉片(2n)各10片。用毛筆醮火膠棉溶液于葉背主脈兩側(cè)涂一薄層,2~4 min后用鑷子揭下溶膠,去掉葉背絨毛。后再于去掉絨毛的葉背主脈兩側(cè)涂抹一層,取下凝膠印膜,置于顯微鏡下觀察葉片氣孔大小、密度等并拍照。
分別選取已停止生長或進入緩慢生長,具有明顯變異特征的枝蔓(4n)與對照枝蔓(2n)各5條,用電子數(shù)顯卡尺分別測量第3~12節(jié)(5×10=50節(jié))節(jié)間粗度,求平均值;用有機玻璃直尺分別測量第3~12節(jié)(5×10=50節(jié))節(jié)間長度,求平均值。
2015年9月15日,從具有明顯變異特征的刺葡萄枝蔓與對照枝蔓上剪取果穗各15穗,用電子天平分別稱取果穗重量,計算4n與2n果穗與果粒平均重量;用便攜式手持數(shù)顯糖度計分別測量處理與對照的可溶性固形物含量,求平均值。
本研究采用去壁低滲法對選取的莖尖與莖段進行鏡檢的同時,觀測了單元視野中染色體數(shù)目(見圖1~2)。單元視野中觀察到對照刺葡萄染色體數(shù)目為2n→2x=38,而刺葡萄變異類型的染色體數(shù)目大多為2n→4x=76,有少量的染色體數(shù)目為2n→2x=38+4、2n→2x=38+6。
圖1 刺葡萄二倍體染色體(2n→2x=38) (×5 500)Fig.1 Choro some of diploid on Vitis davidii foex
圖2 刺葡萄四倍體染色體(2n→4x=76)(×5500)Fig.2 Choro some of tetraploid on Vitis davidii foex
經(jīng)過浸漬處理的刺葡萄種子播于“0.618側(cè)腰開孔”“黃金”營養(yǎng)缽中25 d后,對它們形成植株能力強弱等方面進行了觀測與統(tǒng)計。從表2可看出,不論是對照還是不同濃度的戊炔草胺處理,隨處理時間的延長,形成植株能力呈下降趨勢,種子死亡率呈上升趨勢。其中,以第12處理即被0.005%戊炔草胺處理36 h的處理,死亡率最高,達92%,這樣的統(tǒng)計結(jié)果應(yīng)與戊炔草胺藥劑濃度較高、作用時間較長有關(guān)。
從圖1、圖2結(jié)合表2看出,不同戊炔草胺濃度和時間浸漬已萌發(fā)刺葡萄種子后,除對照以外的各處理均產(chǎn)生了倍性變異植株,且變異植株體內(nèi)染色體大多由2n=2x=38變成了2n→4x=76。其中,以第8處理即被0.004%戊炔草胺浸漬萌動種子24 h的處理,倍性誘變效果最佳,倍性誘變率達41.7%。
表2 不同浸漬濃度與時間的戊炔草胺對刺葡萄種子倍性誘變效果?Table 2 Different impregnation concentration and time of propyzamide on Vitis dacidii foex seed mutagenic effect
從表3可以看出,用不同濃度的戊炔草胺膠囊套罩相應(yīng)芽后,芽的萌芽率隨戊炔草胺濃度的升高而降低,而變異率在濃度為0.004%~0.006%范圍內(nèi)呈上升趨勢,超過0.006%,盲芽率(芽的死亡率)升高,變異率因此受抑制而降低。據(jù)此,0.006%濃度的戊炔草胺對處于生長狀態(tài)的刺葡萄芽套罩6 d有最好的倍性誘變效果,其倍性誘導(dǎo)率達42.8%,且染色體數(shù)量大多由(2n=2x=38)變成了(2n→4x=76)(見圖1~2)。
表3 不同套罩濃度的戊炔草胺對刺葡萄生長芽倍性誘變效果?Table 3 Different cover concentration of propyzamide onVitis davidii foex growth bud mutation effect
采集具有明顯變異特征的刺葡萄葉片(4n)50片、對照(2n) 葉片50片,從形態(tài)、大小、葉片厚度等方面進行了觀測與分析:從葉片形態(tài)方面觀察,對照刺葡萄葉片(2n)多為闊卵形,受戊炔草胺影響產(chǎn)生的倍性變異葉片(4n)多為心形;變異體葉片的葉色比對照的更濃綠,變異體葉片葉面較脆且更粗糙;已產(chǎn)生倍性變異的葉片比對照的更厚(見表4);對照葉片雖比已產(chǎn)生倍性變異的葉片長且寬,但從測得的刺葡萄葉片含水量分析,發(fā)生倍性變異的刺葡萄葉片含水量為68.3%,對照的為72.1%,由此推斷處理葉片比對照葉片的相對含水量低,干物質(zhì)含量相對較高(見表4)。這些觀測結(jié)果基本上與石雪暉等[14-15]、鄧建平等[7]利用秋水仙素作試劑,誘導(dǎo)刺葡萄倍性變異的研究結(jié)果基本一致。
表4 刺葡萄對照(2n)與倍性變異體(4n)葉片形態(tài)比較?Table 4 Comparison on Vitis davidii foex leaf morphological between contrast (2n) and times variants (4n)
把從刺葡萄變異體葉的葉背與對照葉的葉背取下的凝膠印膜置于顯微鏡下進行觀測(見圖3、4):變異體葉片氣孔(4n)的長度和寬度均大于對照(2n),說明變異體葉片的氣孔比對照大,變異體葉片的氣孔密度比對照的小[7,14-15]。
圖3 二倍體刺葡萄氣孔(×800)Fig.3 Pores of diploid on Vitis davidii
圖4 四倍體刺葡萄氣孔(×800)Fig.4 Pores of tetraploid on Vitis davidii
從表5可以看出,刺葡萄變異四倍體的節(jié)間長度與對照二倍體的相比,節(jié)間明顯變短,是對照的54.40%;枝蔓節(jié)間粗度也明顯變細,僅對照的50.10%。這與同源多倍體的生長速率一般低于二倍體有關(guān)[13]。這一觀測結(jié)果與石雪暉等[14-15]的研究趨于一致。
湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院藤本園中栽植的變異四倍體刺葡萄果實成熟期與對照二倍體的無明顯差異,兩者都于8月下旬~9月上中旬成熟。成熟后果粒顏色都為藍黑色,顏色深淺也無顯著區(qū)別。從表6可以看出,4n果穗與果粒雖比2n稍大,稍重,但都未達到顯著水平。變異四倍體的可溶性固形物含量達19.39%,比對照的11.15%明顯要高。這一觀測結(jié)果與石雪暉等[10]的相關(guān)研究有相似性。
表5 戊炔草胺對刺葡萄枝蔓粗度與節(jié)間長度的影響?Table 5 Effect of Propyzamide on Vitis davidii foex dendrite diameter and internode length
表6 戊炔草胺對果實外形與可溶性固形物的影響?Table 6 Effect of propyzamide on Vitis davidii foex fruit shape and the influence of soluble solids
本試驗用濃度為0.004%的戊炔草胺浸漬處于萌動狀態(tài)的刺葡萄種子24 h,倍性誘變效果最佳,倍性誘變率達41.7%;用0.006%濃度的戊炔草胺套罩處于生長狀態(tài)的刺葡萄芽6 d,倍性誘變效果最好,倍性誘變率達42.8%;在適宜時間段內(nèi)、用適宜濃度的戊炔草胺分別處理刺葡萄的種子與芽后,誘使刺葡萄發(fā)生了倍性誘變,成功使刺葡萄體內(nèi)的染色體數(shù)量大多由2n=2x=38變成了2n→ 4x=76。
對已發(fā)生倍性誘變的刺葡萄葉、葉片氣孔、枝蔓粗度與節(jié)間長度、果實外觀與內(nèi)在品質(zhì)進行觀測后,發(fā)現(xiàn):第一,發(fā)生倍性變異的刺葡萄葉片表面更粗糙、葉片更厚、葉片內(nèi)干物質(zhì)的相對含量更高,這與楊小胡等[17]、研究結(jié)果大致相同。第二,刺葡萄變異體葉片氣孔(4n)的長度和寬度均大于對照(2n),說明變異體葉片的氣孔比對照大,氣孔密度比對照的小[7,17-18]。第三,刺葡萄變異四倍體的節(jié)間長度比對照二倍體的明顯變短,是對照的54.40%;枝蔓節(jié)間粗度也明顯變細,僅對照的50.10%。這與同源多倍體的生長速率一般低于二倍體有關(guān)[13,19]。第四,4n刺葡萄果穗與果粒雖比2n的稍大,稍重,但都未達到顯著水平[10,17,19]。變異四倍體的可溶性固形物含量達19.39%,比對照的 11.15% 明顯要高[10,17,19]。
以往在誘導(dǎo)植物的倍性誘變方面使用的藥劑大多是秋水仙素,但秋水仙素是一劇毒植物堿,且成本較高。戊炔草胺(propyzamide)于當(dāng)前生產(chǎn)上雖是除草劑的一種,但它和秋水仙素一樣,是一種抗微管物質(zhì),能誘使植物細胞核內(nèi)染色體成功加倍[8-16]。本試驗結(jié)果證實,低濃度、低劑量的戊炔草胺確能使刺葡萄發(fā)生倍性誘變,且倍性誘變效果比秋水仙素好。所以,戊炔草胺與秋水仙素相比,它確有低毒性、低濃度、低劑量、低成本、高誘導(dǎo)率等優(yōu)勢,所以,在今后的植物倍性誘導(dǎo)與新品種選育過程中,戊炔草胺完全可作為一種新型誘變試劑取代秋水仙素[4,6-12]。
作用于刺葡萄芽的最適戊炔草胺濃度為0.006%,比作用于刺葡萄種子的最適濃度0.004%高出0.002%,且作用于芽的時間比作用于種子的長120 h。試驗中表現(xiàn)出的這種最適濃度差異與時間差異,可從環(huán)境因子特別是溫度因子的角度作出合理解釋:戊炔草胺作誘導(dǎo)試劑的刺葡萄種子浸漬試驗是在25 ℃左右這一最適大多數(shù)植物種子與植物生長發(fā)育的溫度下進行的,而刺葡萄芽的套罩試驗是在3月下旬的室外進行的。據(jù)從中國科學(xué)氣象數(shù)據(jù)共享服務(wù)網(wǎng)查找的數(shù)據(jù),2014年3月,湖南長沙地區(qū)平均氣溫13.5 ℃,氣溫變化范圍6.1~23.5 ℃,很顯然,這并不是植物生長發(fā)育的最適溫度條件。由此說明,誘導(dǎo)試驗中使用的戊炔草胺濃度高低、作用時間長短與誘導(dǎo)效果好壞,與被作用器官的生長狀態(tài)有關(guān),更與當(dāng)時的溫度因子有很大相關(guān)性:溫度高,誘導(dǎo)變異的最適濃度須降低、作用時間短,反之濃度則高、作用時間需長。
石雪暉等[6]在2007年3月初利用秋水仙素浸漬刺葡萄種子的對照試驗中,清水浸漬24 h的種子死亡率為17%,浸漬36 h的死亡率為21%。在本次2014年3月初利用戊炔草胺浸漬刺葡萄種子的對照試驗中,清水浸漬種子24 h的死亡率僅為1%,浸漬36 h時僅為4%。兩對照試驗中種子死亡率差異顯著。造成此顯著差異的原因在避開試劑濃度高低、浸漬時間長短等因素外,主要應(yīng)與浸漬液中含氧量的高低有很大關(guān)系。在搖床的作用下,可使浸漬液中富含充足的氧,因而種子的死亡率顯著降低。當(dāng)然,本浸漬試驗中種子成活率與植株成活率的高低可能還與利用了“0.618側(cè)腰開孔”“黃金”營養(yǎng)缽有關(guān),因“黃金杯”能確保播種其中的種子與生長其中的植株對氧與水分的需求,因而植株成活率高。
戊炔草胺不能直接溶于水。試驗與生產(chǎn)中,一般先將戊炔草胺的晶狀體充分溶解于二甲基亞砜(DMSO),后用蒸餾水定容至刻度。二甲基亞砜可增強戊炔草胺對植物組織的穿透能力,同樣對皮膚組織也有較強穿透性,因此,操作者在配制二甲基亞砜與戊炔草胺溶液時,須帶手套操作。
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Studies of propyzamide on polyploidy mutation ofVitis davidii
CAI Dong-yuan, LIN Ji-hua, DENG Jian-ping
(Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic College, Changsha 410127, Hunan, China)
Processing and control stem section, stem tip under a microscope, the observed controlVitis davidiifoex chromosome number is 2n=2x=38[1-7], most variation types of chromosome number is 2n→4x=76, a small amount of chromosome number is 2n→2x=38+4, 2n→2x=38+6; 0.004% propyzamide spirit treatment on the germination ofVitis davidiifoex seed soaking for 24h has the best effect of ploidy mutagenesis, mutation rate was 41.7%; 0.006% propyzamide spirit processing set cover was under a state of growth of buds, ploidy mutagenic effect best, mutation rate was 42.8%.Different concentration of propyzamide respectively applied toVitis davidiifoex have germination of seeds and of bud, there were good times sex mutagenic effects.Vitis davidiifoex has the characteristics of small particles, more seeds, etc.This study used different concentrations of propyzamide for ploidy mutagenesis reagent, respectively applied toVitis davidiifoex has seed germination and growth status of bud, inducesVitis davidiifoex chromosome ploidy variation, for breeding seedless or less, big grain, high quality ofVitis davidiifoex new types and new ploidy breeding materials with more abundant resources.
propyzamide; colchicine;Vitis davidii; polyploidy; mutation
10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.07.018
http: //qks.csuft.edu.cn
S722.3
A
1673-923X(2016)07-0103-06
2015-06-03
湖南省科技計劃重點項目(2012FJ4565);湖南省農(nóng)業(yè)廳項目(2014NY03)
蔡冬元,副教授
鄧建平,教授;E-mail:caidongyuan911@126.com
蔡冬元,林繼華,鄧建平.戊炔草胺(propyzamide)作用于刺葡萄的倍性誘變研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2016,36(7): 103-108.
[本文編校:吳 毅]