低鹽脅迫下紅鰭東方鲀幼魚鰓、腎和腸組織結(jié)構(gòu)的變化

孫夢蕾,蔣潔蘭,王莉蘋,陳 飛,韓雨哲,姜志強,暴 寧,司 濱

（大連海洋大學(xué) 遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點實驗室，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023）

低鹽脅迫下紅鰭東方鲀幼魚鰓、腎和腸組織結(jié)構(gòu)的變化

孫夢蕾,蔣潔蘭,王莉蘋,陳 飛,韓雨哲,姜志強,暴 寧,司 濱

（大連海洋大學(xué) 遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點實驗室，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023）

對低鹽脅迫下體質(zhì)量（11.34±2.13）g紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）的鰓、腎和腸組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行顯微觀察，探討組織結(jié)構(gòu)變化與滲透壓的關(guān)系。結(jié)果表明，低鹽脅迫下，鰓絲和鰓小片寬度增大，鰓小片間距縮小，與對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），鰓小片細(xì)胞更為圓潤飽滿，低鹽度組每100μm泌氯細(xì)胞數(shù)為0.91±0.78，低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；低鹽度組的腎小球膨大，飽滿充盈，與腎小囊內(nèi)壁間隙小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），近曲小管和集合管管徑增大，近曲小管游離面刷狀緣較對照組發(fā)達(dá)；低鹽度組腸絨毛單層柱狀上皮厚度為（51.54±2.53）μm，大于對照組（P＜0.05），柱狀上皮細(xì)胞間每100μm杯狀細(xì)胞數(shù)為5.05±0.91，小于對照組（P＜0.05），而兩組間的杯狀細(xì)胞大小差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。水體鹽度變化導(dǎo)致紅鰭東方鲀鰓、腎和腸發(fā)生適應(yīng)性變化。

紅鰭東方鲀；鰓；腎；腸；結(jié)構(gòu)；低鹽脅迫

對廣鹽性魚類來說，其體內(nèi)滲透壓隨水體鹽度的變化而發(fā)生變化，須通過滲透調(diào)節(jié)維持體內(nèi)相對穩(wěn)定的滲透濃度。魚類對水環(huán)境鹽度變化的耐受能力取決于滲透調(diào)節(jié)能力[1]。鰓和腎是硬骨魚類滲透壓調(diào)節(jié)的重要器官，主要功能是調(diào)節(jié)機體滲透壓、體液pH、離子濃度的穩(wěn)定以及排泄氨氮等，以維持機體內(nèi)、外環(huán)境之間的平衡[2-5]。已有研究表明，廣鹽性魚類在對水環(huán)境鹽度變化的適應(yīng)過程中，鰓絲上皮細(xì)胞中泌氯細(xì)胞的數(shù)量、分布以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)會發(fā)生明顯變化[6-7]，腎變化主要體現(xiàn)在腎小球及各級腎小管的結(jié)構(gòu)上，鹽度降低會導(dǎo)致腎小球膨大，各級腎小管管徑增大[8-10]。劉修業(yè)[10]、Jeong等[11]研究表明，魚類腸組織通過對Na+、K+等離子的主動吸收來吸收大量水分，以防止魚體水分過量丟失，從而維持魚類體內(nèi)外的滲透壓平衡[11]。

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）屬鲀形目（Tetraodontiformers）鲀亞目（Tetraodontoidei）鲀科（Tetraodontidae）東方鲀屬（Takifugu），因其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值高，深受人們喜愛。紅鰭東方鲀?yōu)榕瘻匦?、廣鹽性底棲魚類，適鹽范圍為5～45，最適鹽度為15～35[12-13]，已成為眾多學(xué)者研究魚類滲透壓調(diào)節(jié)機制的重要材料。本研究通過組織切片技術(shù)，研究紅鰭東方鲀在低鹽環(huán)境下鰓、腎、腸組織顯微結(jié)構(gòu)的變化，為紅鰭東方鲀養(yǎng)殖條件的優(yōu)化及其滲透壓調(diào)節(jié)機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用紅鰭東方鲀幼魚購自大連天正實業(yè)有限公司，于大連海洋大學(xué)北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室暫養(yǎng)，鹽度32，水溫（25.03±0.42）℃，24 h連續(xù)充氣，每天8:00、16:30飽食投喂2次，投喂1 h后吸出底部殘餌及其他廢物，換水。暫養(yǎng)7 d后，選取規(guī)格相近[體長（7.18±0.34）cm，體質(zhì)量（11.34±2.13）g]、體格健康的個體進(jìn)行實驗。實驗用水為凈化處理的天然海水（鹽度32）和與曝氣后自來水配制成的低鹽度海水，容器為200 L的方形水槽。

1.2 實驗設(shè)計

設(shè)置32和4兩個鹽度組，以鹽度為32的天然海水為對照組，每個鹽度組設(shè)置 3個平行組。每個水槽中隨機放入紅鰭東方鲀幼魚10尾，低鹽度組由鹽度32每天降低4至鹽度4。水溫、充氣和投喂同暫養(yǎng)期，投喂1 h后，對照組換取儲存的鹽度為32的天然海水，低鹽度組則換取鹽度為4的低鹽度海水。實驗時間30 d[14]。

1.3 樣品采集與制備

養(yǎng)殖實驗結(jié)束后，每水槽隨機取幼魚 2尾，用MS-222麻醉，剖取鰓、腎、腸，用Bouin液固定24 h，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇洗滌至溶液呈無色，于體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇中保存。用石蠟包埋，橫向切片，厚度為6μm，經(jīng)HE染色、中性樹膠封片后，用Nikon eslipse 50i顯微鏡觀察，Nikon coolpix 5400數(shù)碼相機照相。

1.4 組織形態(tài)學(xué)觀察與測量

對于鰓、腎和腸3個組織，在每個鹽度組每槽幼魚的切片中，每個組織選取 7張。每張鰓切片中，隨機測 5組鰓絲寬度、鰓小片間距、鰓小片寬度和軟骨組織寬度（n=35），然后在每張切片中隨機選取5根鰓絲，測量其上每100μm鰓絲中泌氯細(xì)胞數(shù)量（n=35）；每張腎切片中則隨機選取 5個腎小球與腎小囊，測量腎小球的長徑、短徑及腎小球與腎小囊內(nèi)壁的間距大?。╪=35）；每張腸切片隨機選取 5根完整的絨毛，測量單層柱狀上皮厚度、杯狀細(xì)胞胞體直徑和杯狀細(xì)胞數(shù)量（n=35），而杯狀細(xì)胞數(shù)量用每100μm絨毛中的細(xì)胞數(shù)量表示[15]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOⅤA），用Tukey法進(jìn)行多重比較分析，當(dāng)P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 紅鰭東方鲀幼魚鰓的顯微結(jié)構(gòu)

觀察對照組紅鰭東方鲀幼魚鰓的顯微結(jié)構(gòu)，可見鰓結(jié)構(gòu)與魚類組織學(xué)的鰓結(jié)構(gòu)相一致（圖1：1）。經(jīng)測量，對照組的軟骨組織、鰓絲和鰓小片的寬度為46.79±2.07、91.46±2.02、4.51±0.42μm，相鄰鰓小片間距為50.84±2.08μm，泌氯細(xì)胞數(shù)量較多，每100μm平均4.77±1.19 個（表1）。鰓小片表面的柱細(xì)胞較小，鰓小片細(xì)窄。幼魚在低鹽度水中馴化30 d后，鰓絲軟骨組織橫向拉長，長度大于對照組（P＜0.05）；鰓絲和鰓小片寬度增大，鰓小片間距縮小，與對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），鰓小片細(xì)胞圓潤飽滿（圖1：2），HE著色較深；低鹽度組每100μm泌氯細(xì)胞數(shù)為0.91±0.78，與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表1 低鹽度處理對紅鰭東方鲀鰓組織的影響Table 1 Effect of low-salt treatment on gill of Takifugu rubripes

2.2 紅鰭東方鲀幼魚腎的顯微結(jié)構(gòu)

對照組近曲小管內(nèi)腔游離面刷狀緣發(fā)達(dá)（圖1：3～4），腎小球長、短徑分別為（47.80±2.87）μm和（32.95±3.09）μm，腎小球與腎小囊內(nèi)壁間距（15.26±2.18）μm（表 2）。馴化后，低鹽度組幼魚腎小球膨大，各級腎小管管徑增大，近曲小管內(nèi)壁游離面的刷狀緣更為發(fā)達(dá)（圖1：5～6）。低鹽度組的腎小球發(fā)達(dá)，飽滿充盈，長、短徑大于對照組，與腎小囊內(nèi)壁的間隙小于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 低鹽度處理對紅鰭東方鲀腎組織腎小球與腎小囊的影響Table 2 Effect of low-salt treatment on glomerulus and inner wall of Bowman’s capsule of Takifugu rubripes

2.3 紅鰭東方鲀幼魚腸的顯微結(jié)構(gòu)

幼魚前腸腸壁黏膜上皮厚度為 37.20±2.46μm，每100μm上皮杯狀細(xì)胞數(shù)為9.74±1.77（表3），存在于柱狀上皮細(xì)胞之間（圖1：7～8）。馴化后，低鹽度組幼魚腸絨毛上的單層柱狀上皮厚度（51.54 ±2.53μm）增加，與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），固有層增大（圖1：9），每100μm柱狀上皮細(xì)胞的杯狀細(xì)胞數(shù)為 5.05±0.91，少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而兩組間杯狀細(xì)胞胞體大小差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

表3 低鹽度處理對紅鰭東方鲀腸絨毛的影響Table 3 Effect of low-salt treatment on intestinal villus of Takifugu rubripes

圖1 紅鰭東方鲀幼魚鰓、腎和腸組織結(jié)構(gòu)變化Fig.1 Structural changes in gill,kidney and intestine of juvenile Takifugu rubripes.

3 討 論

對于廣鹽性魚類來說，水環(huán)境鹽度變化會引起魚體鰓、腎、腸等組織結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性改變，以調(diào)節(jié)滲透壓。

魚類鰓與水環(huán)境直接接觸，可第一時間感知鹽度變化，并引起鰓各類細(xì)胞變化，鰓絲表皮細(xì)胞變化尤為明顯，對鰓生理功能的發(fā)揮至關(guān)重要。當(dāng)水環(huán)境鹽度變化時，魚類鰓上皮細(xì)胞數(shù)目和大小會發(fā)生適應(yīng)性改變[16]，鹽度降低，上皮細(xì)胞數(shù)減少，胞體變小。紅鰭東方鲀?yōu)榻５讓訌V鹽性魚類，可生存于海水及低鹽度水環(huán)境中，因此鹽度變化時，鰓結(jié)構(gòu)會發(fā)生一定改變以維持滲透壓調(diào)節(jié)平衡。本研究顯示，低鹽度組紅鰭東方鲀幼魚的鰓絲和鰓小片變寬、變長，鰓絲表面的表皮細(xì)胞變大，鰓絲和鰓小片更加圓潤、飽滿，該變化有利于鰓與水體充分接觸，以攝取水中無機離子而適應(yīng)低滲環(huán)境[1,17]。魚類鰓表皮以扁平細(xì)胞（90%）和泌氯細(xì)胞（10%）為主，扁平細(xì)胞分布于鰓絲表面大部分區(qū)域，通過被動運輸與外界進(jìn)行氣體交換的方式參與鰓的生理活動。與扁平細(xì)胞不同的是，泌氯細(xì)胞雖在鰓絲上皮細(xì)胞中所占區(qū)域較小，卻是廣鹽性魚類適應(yīng)不同鹽度的重要調(diào)節(jié)細(xì)胞，以主動運輸方式與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換，對鰓生理功能發(fā)揮重要作用[5,18-19]。泌氯細(xì)胞內(nèi)含大量線粒體，胞質(zhì)內(nèi)的微小管系統(tǒng)上具有豐富的 Na+/K+-ATP 酶，在鹽度變化時，泌氯細(xì)胞在低滲調(diào)節(jié)中分泌 Cl-，高滲調(diào)節(jié)中吸收Na+和Cl-，由此可見，泌氯細(xì)胞具調(diào)節(jié)滲透壓的功能[20-21]。本研究中，低鹽度組泌氯細(xì)胞數(shù)減少，胞體變小，與鯔(Mugil cephalus)[1]、納氏鱘(Acipenser naccarii)[16]、施氏鱘 (A.schrencki)[18]的研究結(jié)果相似，進(jìn)一步證實外界鹽度變化時廣鹽性魚類鰓細(xì)胞的適應(yīng)性變化。

腎臟是魚類滲透壓調(diào)節(jié)的另一重要器官，腎小球可過濾血液里的血細(xì)胞和大分子蛋白質(zhì)，腎小管可重吸收水分、葡萄糖、氨基酸等物質(zhì)。本研究中，低鹽度組腎小球更為發(fā)達(dá)，第1和第2近曲小管管徑增大，細(xì)胞游離面的刷狀緣更為發(fā)達(dá)，此結(jié)構(gòu)變化利于幼魚對血液中營養(yǎng)物質(zhì)的過濾和重吸收。

魚類腸對滲透壓調(diào)節(jié)所起作用較小。但也有研究表明，腸上皮細(xì)胞膜具有Na+/K+/2Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白、Na+/K+-ATP酶、CFTR氯離子通道蛋白等離子通道轉(zhuǎn)運蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)外Na+、K+和Cl-的主動跨膜轉(zhuǎn)運，結(jié)合水分的被動運輸以維持體內(nèi)的滲透壓平衡[3,11,22]。Jeong等[11]認(rèn)為，腸的滲透壓調(diào)節(jié)功能體現(xiàn)在對離子的主動運輸和水的被動轉(zhuǎn)運上，通過對Na+、K+等離子的主動吸收來吸收大量的水分，以防止魚體水分的過量丟失。本研究中，低鹽脅迫對紅鰭東方鲀幼魚腸組織的影響主要體現(xiàn)在腸絨毛結(jié)構(gòu)的變化上，低鹽度組幼魚腸絨毛單層柱狀上皮厚度增加（P＜0.05），是否與通道中離子轉(zhuǎn)運蛋白有關(guān)尚需進(jìn)一步研究。杯狀細(xì)胞可分泌黏液以潤滑上皮表面和清除廢物[22]，本研究中杯狀細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），該變化與鹽度的關(guān)系亦有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，低鹽脅迫影響紅鰭東方鲀幼魚的鰓、腎和腸組織結(jié)構(gòu)，尤其對鰓影響最大。低鹽脅迫使幼魚鰓組織的鰓絲、鰓小片、鰓絲間距、上皮細(xì)胞和泌氯細(xì)胞數(shù)量均發(fā)生變化；腎小球膨大和各級腎小管管徑增大；腸絨毛上的單層柱狀上皮厚度增加，位于柱狀上皮細(xì)胞之間的杯狀細(xì)胞數(shù)減少。這些結(jié)果可為紅鰭東方鲀滲透壓調(diào)節(jié)機制的深入研究提供基礎(chǔ)資料，為其淡水化養(yǎng)殖提供參考。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Structural Changes in Gill,Kidney andⅠntestine of Juvenile Takifugu rubripes under Low Salinity Treatment

SUN Meng-lei,JⅠANG Jie-lan,WANG Li-ping,CHEN Fei,HAN Yu-zhe,JⅠANG Zhi-qiang,BAO Ning,SⅠ Bin
（Key laboratory of fish applied biology and aquaculture in North China,Liaoning Province; Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea,Ministry of Agriculture,China,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China）

Structural changes in gill,kidney and intestine of juvenile Takifugu rubripes with body weight of 11.34 ± 2.13 g were observed under low salinity treatment by using the histological photomicrography technique.The relationships between structural changes and osmotic regulation were discussed.The results showed that the width of gill filaments and gill lamellae increased and the space of adjacent gill filaments reduced under low salinity condition with the statistical difference from the control (P＜0.05).The gill lamellae cells became plumper in the experimental group.The number of chloride cells was 0.91±0.78 cells per 100μm,which was obviously lower than that of the control group (P＜0.05).Compared with the control group,the glomerular expanded and the gap between the glomerular and the inner wall of the renal capsule became significantly smaller (P＜0.05).Ⅰn the low salinity group,thickness of simple columnar epithelium was 51.54 ± 2.53μm,remarkably higher thanthat in the control group (P＜0.05).The number of goblet cells (5.05 ± 0.91 cells per 100μm) among columnar epithelial cells decreased significantly (P＜0.05) while the body size of goblet cell had no significant difference within two groups (P＞0.05).The findings indicated that the variety of salinity could lead to adaptive changes in gill,kidney and intestine of juvenile Takifugu rubripes.These changes were beneficial to enhance environmental adaptability of Takifugu rubripes.This research could provide a theoretical basis for further study in osmitic regulation mechanism of Takifugu rubripes.

Takifugu rubripes; gill; kidney; intestine; tissue structure; low salinity treatment

Q954.5; Q959.489

A

1673-9159（2016）06-0038-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.06.007

2016-03-31

遼寧省科技廳重大項目（2014203015）；遼寧省教育廳一般項目（L2015076）；大連海洋大學(xué)引進(jìn)人才啟動項目（HDYJ201501）；農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室開放課題（2015-MSENC-KF-04）

孫夢蕾（1992－），女，碩士生，研究方向為魚類生物學(xué)。E-mail:sunmenglei512@163.com

姜志強（1960－），男，教授，研究方向為魚類生物學(xué)、水產(chǎn)動物飼料學(xué)、水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖。E-mail:zhqjiang@dlou.edu.cn