陸地棉PIP亞家族基因的克隆及表達特征分析

孫雨薇，李艷軍*，劉永昌，薛 飛，朱守鴻，王翔飛，孫 杰

(1 石河子大學 農(nóng)學院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，新疆石河子832003；2 石河子大學 藥學院，新疆石河子 832003)

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陸地棉PIP亞家族基因的克隆及表達特征分析

孫雨薇1，李艷軍1*，劉永昌1，薛 飛1，朱守鴻1，王翔飛2，孫 杰1

(1 石河子大學 農(nóng)學院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，新疆石河子832003；2 石河子大學 藥學院，新疆石河子 832003)

該研究以陸地棉苯基香豆?jié)M芐基醚還原酶( phenylcoumaran benzylic ether reductase，PCBER)氨基酸序列為探針，利用Blastp從陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了6個同源性較高的基因。根據(jù)6個基因序列設(shè)計引物，利用 RT-PCR技術(shù)從陸地棉纖維細胞中克隆出了這6個基因的全長cDNA序列，分別命名為GhPCBER1、GhPCBER2、GhPCBER3、GhIFR、GhPLR1和GhPLR2。多重序列比對和進化樹分析發(fā)現(xiàn)，6個蛋白均含有PIP類型蛋白的所有保守性基序和活性殘基，屬于PIP亞家族。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，除GhPLR1之外其他5個PIP亞家族基因均在纖維細胞中優(yōu)勢或特異表達；在纖維發(fā)育過程中，GhPCBER1、GhPCBER2、GhPCBER3和GhIFR的表達均表現(xiàn)為先上升后下降，GhPCBER1和GhPCBER2在花后21 d表達量達到最高，GhPCBER3和GhIFR在花后18 d達到最高，GhPLR1和GhPLR2在纖維中的表達量呈持續(xù)上升趨勢。根據(jù)基因的表達特征，推測PIP亞家族可能在棉纖維的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

棉花；纖維；PIP；表達分析

棉花是全球性的重要經(jīng)濟作物，是紡織工業(yè)最主要的天然纖維來源。成熟棉纖維含有90%以上的纖維素和少量的非纖維素碳水化合物，如木糖葡聚糖、葡聚糖和果膠多糖等[1-2]。纖維素的合成是棉纖維發(fā)育過程中主要的代謝途徑，近期的研究表明棉纖維中存在苯丙烷代謝途徑且在纖維次生壁增厚期優(yōu)勢表達[3-5]，是纖維發(fā)育過程中僅次于纖維素代謝的第二大代謝途徑[4]，該途徑產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物可能對棉纖維的發(fā)育與品質(zhì)形成具有重要影響[5-6]。苯丙烷代謝途徑是植物最重要的次生代謝途徑之一[7]，能夠產(chǎn)生木質(zhì)素、木脂素、黃酮、異黃酮、花青素、酚類化合物等次生代謝產(chǎn)物[8-9]。木質(zhì)素和木脂素是兩種不同的物質(zhì)，木質(zhì)素是植物體內(nèi)一種大分子有機物，是具有三維結(jié)構(gòu)的芳香族高聚物，與纖維素、半纖維素合稱為“三素”是形成植物骨架的主要成分。木脂素是由苯丙素雙分子聚合而成的天然化合物，是一種植物雌激素。在苯丙烷代謝過程中肉桂醛經(jīng)肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)還原為香豆醇(p-Coumaryl，alcohol)、松柏醇(coniferyl alcohol)和芥子醇(sinapyl alcohol)這3種肉桂醇即是合成木質(zhì)素的主要單體。其中松柏醇能進一步形成木脂素。棉纖維中苯丙烷類物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)為棉纖維的品質(zhì)改良提供了新的思路。利用基因工程手段從棉纖維中克隆苯丙烷物質(zhì)生物合成相關(guān)基因并研究其功能，有助于弄清棉纖維細胞中這類物質(zhì)的存在情況及其在棉纖維發(fā)育及纖維品質(zhì)形成中的作用，為利用基因工程手段改良棉纖維的品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

PIP亞家族是同源性較高的SDR(short-chain dehydrogenase/reductase)家族成員[10]，是木脂素和異黃酮等植物次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶。包括苯基香豆?jié)M芐基醚還原酶(phenylcoumaran benzylic ether reductase，PCBER)，異黃酮還原酶(isoflavone reductase，IFR)和松脂醇-落葉松脂醇還原酶(pinoresinol-lariciresinol reductases，PLR)[11]，3種蛋白不僅有很高的氨基酸序列相似性并且都具有一個連續(xù)的α/β NADPH結(jié)合結(jié)構(gòu)域和較小的底物結(jié)合域[12-13]。PCBER是苯丙烷代謝產(chǎn)物木脂素合成過程中的關(guān)鍵酶，在棉花的子葉、莖、葉片、根和發(fā)育的纖維中均發(fā)現(xiàn)了PCBER的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[14-17]，研究發(fā)現(xiàn)陸地棉種皮中有高水平的PCBER轉(zhuǎn)錄[12]，棉花無絮突變體和野生型發(fā)育起始期的棉纖維比較蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)PCBER相應(yīng)的蛋白點僅存在于野生型棉纖維中[12,18]。PLR是松脂醇-落葉松酯醇還原酶，在8-8’連接結(jié)構(gòu)的木脂素合成途徑中，它可以催化松脂醇和落葉松脂醇還原為開環(huán)異落葉松樹脂酚。近期的研究中發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的PCBER具有弱PLR酶活性，可催化相同的底物松脂醇和落葉松脂醇還原為開環(huán)異落葉松樹脂酚[10]。IFR是異黃酮類化合物生物合成途徑中的重要酶，參與抵御各種生物和非生物脅迫，銀杏中的IFR具有PCBER酶活性[19-20]。目前已經(jīng)從多種維管植物種中分離出PCBER、PLR和IFR，PIP亞家族基因轉(zhuǎn)化植物后，對于植物中多種代謝產(chǎn)物的含量產(chǎn)生影響[19-23]。目前棉花中尚未見PIP亞家族基因的報道，本研究利用陸地棉PCBER蛋白序列為探針序列同源比對出多個相似性序列，其中包括PCBER、IFR和PLR，為進一步研究PIP亞家族基因在棉纖維發(fā)育及品質(zhì)形成中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

植物材料為新疆陸地棉(GossypiumhirsutumL.)品種‘新陸早33號’,由石河子大學棉花研究所提供。將‘新陸早33號’播種于石河子大學實驗場。在棉田盛花期對當日花掛牌標記，以3 d為一時間節(jié)點，摘取3～24 DPA(day post anthesis，開花后天數(shù))棉鈴，室內(nèi)剝?nèi)∨咧榧袄w維；將‘新陸早33號’種子用濃硫酸脫絨后種于花盆中(營養(yǎng)土︰蛭石=2︰1)，置于人工氣候室，待長至2片真葉時將其小心拔出，水培3 d，取其根、莖、葉，從田間摘取當日花。將上述植物材料液氮速凍后保存于-80℃，用于提取RNA。

1.2 方 法

1.2.1 不同組織RNA提取及cDNA第一鏈合成 利用CTAB/酸酚法提取棉花組織總RNA[24]。使用ND1000紫外分光光度計定量，根據(jù)A260/280和A260/230比值對樣品純度進行鑒定，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性。對質(zhì)量合格的RNA按照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)說明書完成cDNA第一鏈的合成。

表1 PIP亞家族基因ORF擴增及qPCR引物序列

1.2.2 棉花PIP亞家族基因的克隆 以陸地棉PCBER蛋白序列(GenBank登錄號ABN12322.1)作為查找序列，在陸地棉的基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.cottongen.org)中進行Blastp比對，獲得6個具有較高同源性的基因，利用Blastp比對和進化樹分析，發(fā)現(xiàn)6個基因包含3個PCBER，1個IFR和2個PLR基因，分別對6個基因進行命名(表1)。每個基因在陸地棉基因組中均具有2個拷貝，分別位于A染色體組和D染色體組上，一一對應(yīng)(表1)。設(shè)計擴增6個基因ORF的引物(表1)，以棉纖維cDNA為模板對6個基因進行PCR擴增，反應(yīng)體系為：10×buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL、5 U/ μLEX-taqDNA 聚合酶0.25 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL，補 ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s, 52～57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；重復(fù)31個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產(chǎn)物回收后連接至pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞，挑取單菌落，提取質(zhì)粒進行PCR和酶切鑒定，正確的質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3 棉花PIP亞家族基因生物信息學分析 利用Expasy中的Protparam軟件進行氨基酸基本理化性質(zhì)分析；用SOPMA軟件對蛋白序列進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；用TMHMM2.0在線工具對氨基酸序列跨膜結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析，用SignalP 4.1和TargetP 1.1 Server軟件進行信號肽預(yù)測和亞細胞定位分析；氨基酸序列的同源比對及多序列比對采用Clustal W和DNAMAN進行分析。利用MAGE 6.06軟件采用鄰近相接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap參數(shù)設(shè)為重復(fù)檢測1 000次。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析 利用qPCR技術(shù)分析棉花PIP亞家族基因在棉花不同組織及不同發(fā)育時期纖維中的時空表達模式，根據(jù)6個基因的cDNA序列，分別設(shè)計特異性qPCR引物(表1)，以陸地棉His3為內(nèi)參基因，以棉花幼苗的根、莖、葉、花和不同發(fā)育時期(花后3、6、9、12、15、18、21和24 d)的棉纖維cDNA為模板進行qPCR擴增。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，56～57 ℃ 退火20 s，72 ℃延伸30 s，45個循環(huán)。每個樣設(shè)置3個實驗重復(fù)，將數(shù)據(jù)輸入Excel中按照2-ΔΔCt法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PIP亞家族基因全長cDNA序列克隆

以陸地棉PCBER蛋白序列作為查詢序列，在陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫中進行Blastp比對，發(fā)現(xiàn)了6個同源基因。根據(jù)Blastp比對結(jié)果，將6個基因分別命名為GhPCBER1、GhPCBER2、GhPCBER3、GhIFR、GhPLR1和GhPLR2。陸地棉基因組中6個PIP亞家族基因的基因組序列全長為3 756～4 779 bp，CDS(coding sequence)長度為921～942 bp，編碼306～313個氨基酸(表2)。根據(jù)基因的序列設(shè)計擴增ORF的引物，以陸地棉纖維cDNA為模板對6個基因進行PCR擴增，結(jié)果如圖1所示，擴增條帶與預(yù)期結(jié)果相一致。

2.2 PIP亞家族基因編碼蛋白的生物信息學分析

根據(jù)6個基因的測序結(jié)果，運用ProtParam軟件預(yù)測相應(yīng)蛋白的基本理化性質(zhì)(表3)，6個蛋白分子量為33 854.9～35 199.6 Da，理論等電點為5.52～7.77，負電荷的氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)是35～41，正電荷的氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)是32～36；脂肪系數(shù)為91.75～101.96，氨基酸殘基總的親疏水性平均系數(shù)均為負值，分布在-0.131～ -0.056之間，說明蛋白的親水性較強。不穩(wěn)定系數(shù)是22.55～43.71，其中GhPLR1和GhPLR2不穩(wěn)定系數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白，其余為穩(wěn)定蛋白。利用SOPMA在線預(yù)測分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)(表4)，結(jié)果表明該蛋白主要由α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸直鏈和無規(guī)則卷曲4種結(jié)構(gòu)形式構(gòu)成。其中，GhPCBER1和GhPCBER2蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲組成，GhPCBER3、GhPLR2主要由α螺旋組成，GhIFR和GhPLR1以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主要組成結(jié)構(gòu)。TMHMM2.0預(yù)測表明6個蛋白均未形成跨膜結(jié)構(gòu)域。用SignalP 4.1和TargetP 1.1軟件對氨基酸序列跨膜預(yù)測結(jié)果顯示PIP亞家族的6個蛋白均無信號肽，是非分泌蛋白。對6個蛋白的信號肽及亞細胞定位預(yù)測顯示PIP亞家族蛋白均定位于細胞質(zhì)中。

表2 PIP亞家族基因在陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫中的序列信息

2.3 PIP蛋白多重序列比對和蛋白進化樹分析

為了進一步明確棉花PIP亞家族6個基因的典型結(jié)構(gòu)域及與其他植物PIP亞家族基因的同源性，選取已報道的部分植物PIP亞家族基因，利用Clustal X和DNAMAN軟件對不同植物中PIP亞家族基因進行多重序列比對，發(fā)現(xiàn)均有與NADPH結(jié)合的“GXXGXXG”保守結(jié)合域(圖2)。利用MEGA6.06軟件對不同植物PIP亞家族序列進行進化樹分析，結(jié)果顯示所有基因聚為三大類，大致可分為PCBER、PLR和IFR，而PCBER與IFR的親緣關(guān)系比PLR近。GhPCBER1、GhPCBER2和GhPCBER3與連翹和火炬松的PCBER聚為一類，GhPLR1、GhPLR2與北美紅崖柏和亞麻的PLR聚為一類，GhIFR與楊樹和琴葉擬南芥的IFR聚為一類(圖3)。

M. DNA marker Ⅲ; 1～6. GhPCBER1、GhPCBER2、GhPCBER3、GhIFR、GhPLR1和GhPLR2的 PCR擴增結(jié)果圖1 陸地棉PIP亞家族基因 PCR 擴增電泳M. DNA marker Ⅲ; 1-6 represent the PCR results of GhPCBER1, GhPCBER2, GhPCBER3, GhIFR, GhPLR1 and GhPLR2, respectivelyFig.1 PCR results of PIP subfamily genes

基因名稱Nameα螺旋Alphahelixβ轉(zhuǎn)角Betaturn延伸直鏈Extendedstrand無規(guī)則卷曲RandomcoilGhPCBER127.929.4225.0037.66GhPCBER231.1710.3923.7034.74GhPCBER338.249.8021.5730.39GhIFR32.3511.1123.8632.68GhPLR130.4511.8625.9631.73GhPLR235.4610.5426.2027.80

表3 蛋白的基本理化性質(zhì)

黑色方框為PIP亞家族與NADPH結(jié)合的GXXGXXG保守結(jié)合域；Fi1PCBER.連翹(AF242491)；GhPCBER1、GhPCBER2、GhPCBER3、GhIFR、GhPLR1、GhPLR2.陸地棉(Gh_D01G0977、Gh_A03G0704、Gh_D12G0604、Gh_D02G2151、Gh_A08G1368、Gh_D08G1661)；PtIFR.楊樹(XP_002313789.1)；LuPLR.亞麻(CAH60858)圖2 陸地棉PIP與其它PIP蛋白的多重序列比對The black box is a conserved NADPH binding domain of GXXGXXG which is combined with PIP subfamily；Fi1PCBER. Forsythia suspensa(AF242491); GhPCBER1，GhPCBER2，GhPCBER3，GhIFR，GhPLR1，GhPLR2. G. hirsutum L.(Gh_D01G0977，Gh_A03G0704，Gh_D12G0604，Gh_D02G2151，Gh_A08G1368，Gh_D08G1661)；PtIFR. Populus trichocarpa (XP_002313789.1); LuPLR. Linum usitatissimum (CAH60858)Fig.2 Multiple sequence alignment of PIP and other PIP proteins

系統(tǒng)樹各分支上數(shù)字是Bootstrap 1 000次循環(huán)檢驗的置信度；標尺代表遺傳距離圖3 陸地棉PIP與其他 PIP蛋白的進化樹分析The numbers on the tree branches represent bootstrap confidence values as bootstrap is 1 000；The scale bar represents genetic distanceFig.3 Phylogenic relationship of PIP and other PIP proteins

R.根；S.莖；L.葉；F.花；3～24. 花后3、6、9、12、15、18、21、24 d的纖維細胞圖4 陸地棉PIP亞家族基因的實時熒光定量 PCR 分析R. Root; S. Stem; L. Leaf; F. Flower; 3-24. Fiber cells at 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 and 24 day post anthesis, respectivelyFig.4 Relative expression of PIP subfamily genes

2.4 PIP亞家族基因在棉花不同組織中的表達特征分析

為研究棉花PIP亞家族6個基因在陸地棉中的表達模式，根據(jù)每個基因的cDNA序列設(shè)計特異性引物，對其在棉花不同組織和不同發(fā)育時期纖維中的表達模式進行實時熒光定量分析。結(jié)果(圖4)表明，在6個PIP亞家族基因中，GhPLR1在根和莖中表達量明顯較高，在纖維中表達無優(yōu)勢，其它5個基因均在纖維中特異或優(yōu)勢表達。GhPCBER3在纖維中特異表達，GhPCBER1、GhPCBER2、GhIFR和GhPLR2在纖維中優(yōu)勢表達，在根和莖中有少量表達，在葉和花中幾乎不表達。GhPLR1和GhPLR2在纖維中的表達量呈上升趨勢；GhPCBER1、GhPCBER2和GhIFR在纖維中的表達量均呈先升高后降低的趨勢。6個基因在纖維發(fā)育起始期的表達量均較低，在次生壁合成期表達量較高，推測它們在纖維次生壁合成期可能具有一定的功能。

3 討 論

前期研究認為棉纖維次生壁中不存在木質(zhì)素[25]。Fan等[5]利用熒光觀察、傅里葉轉(zhuǎn)換紅外線光譜(FTER)分析及高效液相色譜(HPLC)分析發(fā)現(xiàn)成熟棉纖維中含有木質(zhì)素，還發(fā)現(xiàn)參與單體木質(zhì)醇生物合成的CAD基因在纖維次生壁合成時期高度表達。Han等[6]克隆了WLIM1轉(zhuǎn)錄因子，該基因可以調(diào)控苯丙烷代謝相關(guān)基因的表達，該基因在棉花中過量表達致使棉纖維木質(zhì)素含量增多，長度變長，強力增加，推測木脂素對棉纖維的品質(zhì)具有影響。植物中的次生代謝產(chǎn)物包括木脂素、黃酮、異黃酮、花青素、酚類化合物等[8-9]，關(guān)于它們在棉纖維中的存在情況及與棉纖維品質(zhì)的相關(guān)性未見報道。PCBER、IFR和PLR是PIP亞家族基因，是合成木脂素和異黃酮過程中重要的酶基因，本研究對陸地棉中PIP亞家族基因進行克隆與分析，對于明確棉纖維中次生代謝產(chǎn)物的存在情況及它們對纖維發(fā)育和品質(zhì)形成的影響具有重要意義。

本研究以陸地棉PCBER蛋白為探針序列，從陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了12個同源基因，根據(jù)cDNA序列相似性劃分為6對，每對中的兩個成員均分別位于A和D染色體組上，且具有較高的序列相似性。由于每對基因中的2個成員序列相似性高(大于97%)，難以進行區(qū)分，因此將它們視為基因的兩個拷貝。本研究共設(shè)計6個擴增ORF的引物和6個qPCR引物，克隆了6個基因。

由生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，6個蛋白的三級結(jié)構(gòu)均具有PIP的典型結(jié)構(gòu)域，即靠近N端區(qū)域都存在一段特異性的保守序列“GXXGXXG”即NADPH結(jié)合位點，說明6個基因?qū)儆赑IP亞家族基因。qPCR分析發(fā)現(xiàn)，6個PIP亞家族基因均在纖維發(fā)育次生壁合成期表達量較高，暗示PIP亞家族在纖維次生壁合成期具有一定的功能。6個基因中，其中GhPCBER3在棉纖維中呈現(xiàn)特異表達，GhPCBER1、GhPCBER2、GhIFR和GhPLR2呈優(yōu)勢表達，PIP亞家族基因編碼植物次生代謝產(chǎn)物合成過程中的關(guān)鍵酶，暗示次生代謝產(chǎn)物在棉纖維的發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis of PIP Subfamily Genes in Gossypium hirsutum

SUN Yuwei1, LI Yanjun1*, LIU Yongchang1, XUE Fei1, ZHU Shouhong1, WANG Xiangfei2, SUN Jie1

(1 College of Agronomy，Shihezi University，Key Oasis Eco-agriculture Laboratory of Production and Construction Group，Shihezi，Xinjiang 832003，China；2 College of Pharmacy，Shehezi University, Shihezi，Xinjiang 832003，China)

Using the protein sequence ofGhPCBERas a probe, six of genes showing high sequence homology were obtained from a genome database ofGossypiumhirsutumL.tetraploid cotton with Blastp search. These sequences were used to design primers, and then six genes were isolated from cotton fiber ofG.hirsutumL. by using RT-PCR technique and designated asGhPCBER1,GhPCBER2,GhPCBER3,GhIFR,GhPLR1 andGhPLR2, respectively. Multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis revealed that all of the 6 proteins belong to PIP subfamily since the conserved motifs and active residues in their sequences. Real time fluorescent quantitative PCR results showed that in addition toGhPLR1, all the other 5 PIP subfamily genes were specifically or preferentially expressed in fiber cells. Of 6 genes, the expression pattern ofGhPCBER1,GhPCBER2,GhPCBER3 andGhIFRshowed increasing firstly and then decreasing trend during cotton fiber developing stage. The expression level ofGhPCBER1 andGhPCBER2 reached a maximum at 21 day post anthesis, andGhIFRandGhPCBER3 reached a maximum at 18 day post anthesis. The expression pattern ofGhPLR1 andGhPLR2 showed an ascendant trend with cotton fiber developing. According to the characteristics of gene expression, it is speculated that the PIP subfamily may play an important role in cotton fiber development.

cotton; fiber; PIP; expression analysis

1000-4025(2016)10-1948-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.1948

2016-06-21;修改稿收到日期:2016-09-07

國家自然科學基金(31460360)

孫雨薇(1990-)，女，在讀碩士研究生，主要從事棉花分子育種研究。E-mail：sunyuwei2014@aliyun.com

*通信作者:李艷軍,博士，副教授，主要從事棉花分子育種研究。E-mail：lyj20022002@sina.com.cn

Q785;Q789

A