運動通過提高DNA甲基化水平改善阿爾茨海默病小鼠空間學習記憶能力

何　標，徐　波，張憲亮

●博士（生）論壇Doctor Forum

運動通過提高DNA甲基化水平改善阿爾茨海默病小鼠空間學習記憶能力

何標1，2，徐波1，2，張憲亮3

目的：探討DNA甲基化在運動緩解阿爾茨海默病中的作用。方法：選3月齡APP/PS1轉基因小鼠24只，隨機分為轉基因運動組（TE，n= 12）和轉基因對照組（TC，n=12），選同系野生型小鼠作為正常對照組（C，n=12）和運動對照組（E，n=12）。E組和TE組給予10周的跑臺運動，C組和TC組安靜飼養(yǎng)。運動結束后Morris水迷宮檢測小鼠學習記憶能力，水迷宮試驗后取海馬組織，RT-PCR法檢測小鼠海馬甲基化轉移酶DN?MT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達水平，Western Blot檢測小鼠海馬APP、PS1、Aβ42蛋白表達情況。結果：與C組相比，TC組小鼠海馬DN?MT1mRNA表達水平顯著降低（P＜0.01），DNMT3a mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），DNMT3b mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），APP蛋白表達水平顯著增加（P＜0.01），PS1蛋白表達水平顯著增加（P＜0.01），Aβ42蛋白表達水平顯著增加（P＜0.01），學習記憶能力顯著降低（P＜0.05）。與TC組相比，TE組小鼠海馬DNMT1mRNA表達水平顯著增加（P＜0.05），DNMT3a mRNA表達水平顯著增加（P＜0.05），DNMT3b mRNA表達水平顯著增加（P＜0.05），APP蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），PS1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），Aβ42蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），空間記憶能力顯著增強（P＜0.05）。結論：10周的跑臺運動通過增加AD小鼠海馬DNMT表達水平，提高海馬DNA甲基化水平，抑制APP、PS1蛋白表達，減少Aβ 42的生成，提高AD小鼠的學習記憶能力。

跑臺運動；阿爾茨海默??；表觀遺傳；DNA甲基化；學習記憶

1　材料及方法

1.1實驗動物及分組

從南京大學動物研究所選購3月齡雄性APP/PS1轉基因小鼠24只。將APP/PS1轉基因小鼠隨機分為轉基因運動組（TE，n= 12）和轉基因對照組（TC，n=12），選同系野生型小鼠作為正常對照組（C，n=12）和運動對照組（E，n=12）。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，實驗動物置于標準動物房，自由飲食進水，自然光照（鑒于該種系小鼠死亡率高，為防止實驗過程中小鼠死亡，實際購置的小鼠多于24只）。

1.2運動方案

小鼠置于標準動物房適應性喂養(yǎng)2周，然后進行一周的適應性跑臺訓練：先將E組TE組小鼠置于靜止的跑臺上適應2天，每天30 min，第3天開始進行15 min的跑臺訓練，第4天進行30 min的跑臺訓練，第5天進行45 min的跑臺訓練，第6、第7天休息，隨后，E組和TE組小鼠進行10周的跑臺運動，每周5次，每次訓練持續(xù)時間45 min，速度為9 m/min，每天下午4點進行跑臺訓練，訓練強度參照文獻[12]進行，運動強度為小鼠最大攝氧量的45%～55%。第11周進行水迷宮測試，水迷宮測試共6天：前5天為定位航行實驗，第6天進行空間探索實驗。水迷宮實驗儀器由上海吉量公司提供。

1.3取材

水迷宮實驗結束后，禁食12 h，將實驗小鼠麻醉、斷頸處死，取海馬組織，置-80℃冰箱，待測。所有操作均在冰上進行。

1.4實時熒光定量RT-PCR實驗

采用RT-PCR技術對實驗小鼠海馬DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達情況進行檢測，實驗操作步驟按照文獻[13]進行，具體如下：取適量的海馬組織，用Trizol法提取小鼠海馬內總的RNA，以20 μL逆轉錄反應體系，通過37℃，15 min，95℃，5 min進行PCR反應，經(jīng)逆轉錄得到穩(wěn)定的cDNA。按要求設計合成引物，引物序列見表1。根據(jù)RT-PCR試劑盒說明，進行如下操作：加入10 μL SYBR green PCR Master Mix，2 μLcDNA，上下游引物各0.04 μL，補充ddH2O至20 μL。按照RT-PCR擴增循環(huán)參數(shù)：預變性95℃，1 min；以95℃，15s；60℃，30 s；72℃，45 s，45個循環(huán)。為建立溶解曲線，擴增結束后，再通過95℃，60 s；60℃，60 s；95℃，15 s；從60℃到95℃，每升高1℃收集一次熒光，記錄Ct值。根據(jù)2-△△Ct法計算相對表達量。

表1　引物序列一覽表Tab.1　Primer sequence of gene

1.5Western Blot檢測實驗小鼠海馬APP、PS1和Aβ42蛋白表達情況

取20～30 mg海馬組織，按照1∶7的比例加入混有PMSF的裂解液，重復均漿3～4次，12 000g低溫離心5 min，取上清，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，置于-80℃冰箱待測。用SDS-PAGE進行凝膠電泳，并進行PVDF轉膜，然后孵一抗，4℃搖床過夜，次日孵二抗，室溫孵育2 h，TBST搖床洗3次，于暗室用ECL顯影，用AIpha成像系統(tǒng)曝光，ImageJ1.46進行灰密度值分析，將目的蛋白與內參平均密度的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計

運用SPSS17.0軟件對所獲數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有實驗數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差（M±SD）表示，采用單因素分析法（One-Way ANOVA），事后檢驗采用LSD法。以P<0.05為顯著性差異，以P<0.01為極顯著性。

2　結　果

2.1跑臺運動對Tg APP/PS1小鼠海馬DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示，TC組小鼠海馬DNMT1 mRNA表達水平顯著低于C組和E組，差異均具有極顯著性（P<0.01），TE組小鼠海馬DNMT1 mRNA表達水平顯著高于TC組，差異具有顯著性（P<0.05），E組小鼠海馬DNMT1 mRNA表達水平稍高于C組，但差異不具顯著性（P>0.05）。TC組小鼠海馬DNMT3a mRNA表達水平顯著低于C組和E組，差異均具有顯著性（P< 0.05），TE組小鼠海馬DNMT3a mRNA表達水平顯著高于TC組，差異具有顯著性（P<0.05），E組小鼠海馬DNMT3a mRNA表達水平稍高于C組，但差異不具顯著性（P>0.05）。TC組小鼠海馬DNMT3b mRNA表達水平顯著低于C組，差異具有顯著性（P<0.05），TC組小鼠海馬DNMT3b mRNA表達顯著低于E組，差異具有極顯著性（P<0.01），TE組小鼠海馬DNMT3b mRNA表達顯著高于TC組，差異具有顯著性（P<0.05），E組小鼠海馬DNMT3b mRNA表達水平稍高于C組，但差異不具顯著性（P> 0.05）。結果提示，10周的跑臺運動顯著提高Tg APP/PS1小鼠海馬DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達水平，提高AD小鼠海馬DNA甲基化水平（見圖1）。

圖1　DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達情況（n=12）Figure.1　mRNA expression of DNMT1、DNMT3a、DNMT3b gene

2.2跑臺運動對Tg APP/PS1小鼠海馬APP、PS1、Aβ42蛋白表達的影響

Western Blot實驗結果顯示，與C組（0.91±0.49）相比，TC組小鼠海馬APP蛋白表達水平（2.10±0.84）顯著增加，差異具有極顯著性（P<0.01），TE組小鼠海馬APP蛋白表達水平（1.45±0.59）顯著低于TC組，差異具有顯著性（P<0.05）。與C組相比，E組小鼠海馬APP蛋白表達水平（0.85±0.38）呈下降趨勢，但差異不具顯著性（P>0.05）。與C組（0.73±0.38）相比，TC組小鼠海馬PS1蛋白表達水平（1.76±0.94）顯著增加，差異具有極顯著性（P< 0.01），TE組小鼠海馬PS1蛋白表達水平（1.14±0.48）顯著低于TC組，差異具有顯著性（P<0.05）。與C組相比，E組小鼠海馬PS1蛋白表達水平（0.65±0.28）呈下降趨勢，但差異不具顯著性（P>0.05）。與C組（0.59±0.80）相比，TC組小鼠海馬Aβ42蛋白表達水平（1.50±0.74）顯著增加，差異具有極顯著性（P<0.01），TE組小鼠海馬Aβ42蛋白表達水平（0.93±0.66）顯著低于TC組，差異具有顯著性（P<0.05）。與C組相比，E組小鼠海馬Aβ42蛋白表達水平（0.42±0.17）呈下降趨勢，但差異不具顯著性（P> 0.05）（見圖2）。

圖2　APP、PS1、Aβ42蛋白表達（n=12）Figure.2　protein expression of APP、PS1、Aβ42

2.3跑臺運動對Tg APP/PS1小鼠學習記憶能力的影響

Morris水迷宮實驗結果顯示，第1天各組小鼠潛伏期雖然沒有顯著性差異，但其運動組潛伏期呈現(xiàn)減少的趨勢。除第1天外，第2、3、4和5天運動組潛伏期均顯著少于同天對照組。與C組相比，TC組小鼠第2、3、4和5天潛伏期顯著大于C組，差異具有顯著性（P<0.05）；與C組相比，E組小鼠第2天潛伏期著性少于C組，差異具有顯著性（P<0.05）；與TC組小鼠相比，TE組小鼠第2、3、4和5天潛伏期均顯著小于TC組，差異具有顯著性（P<0.05）（見圖3-1）。

空間探索實驗發(fā)現(xiàn)，E組小鼠穿越平臺次數(shù)顯著多于C組，差異具有顯著性（P<0.05），TC組小鼠穿越平臺次數(shù)顯著少于C組，差異具有顯著性（P<0.05），與TC組相比，TE組小鼠穿越平臺次數(shù)顯著增加，差異具有顯著性（P<0.05）（見圖3-2）。

圖3-1　小鼠水迷宮潛伏期Figure.3-1　escape latency in water maze test

圖3-2　小鼠穿越平臺次數(shù)Figure.3-2　times across platform in water maze test

3　分析討論

3.1DNA甲基化與AD

AD是一種多發(fā)于老年期的神經(jīng)退行性疾病，發(fā)病機制尚未明確，普遍認為是遺傳和環(huán)境等因素共同作用的結果，是因機體衰老而導致的神經(jīng)退行性病變。有研究證實，AD可能源于生命的早期[14]。表觀遺傳修飾和表觀調節(jié)作用可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及認知功能下降等疾病過程中起到重要作用[15]。有研究[16]證實，AD腦區(qū)存在表觀遺傳修飾的改變，與正常大腦相比較，AD腦內甲基化模式發(fā)生了顯著變化，DNA甲基化對突觸可塑性、精神行為及學習記憶均產(chǎn)生一定的影響。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG雙核苷酸序列的胞嘧啶上，成簇的CpG形成CpG島，CpG島與基因啟動子有著密切的聯(lián)系，在哺乳動物體內，DNMTs家族的成員主要包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b4種亞型。在成體細胞中，DNA甲基化主要是在DNMT1的作用下實現(xiàn)的，DNMT1對維持基因組甲基化水平至關重要，DNMT2僅能使天冬氨酸t(yī)RNA進行甲基化，而DNMT3a和DNMT3b則主要是在細胞分化發(fā)育的早期發(fā)揮作用，使細胞發(fā)育、分化得以正常進行[17]。

Tg APP/PS1小鼠過表達突變的人類早老素（Ps1）和人淀粉樣前體蛋白（APPswe）融合體，6~7月齡Tg APP/PS1小鼠腦內形成明顯的Aβ沉積，海馬神經(jīng)元丟失增多，學習記憶能力下降，是研究AD較為理想的轉基因動物模型[18]。本實驗結果顯示，7月齡Tg APP/PS1小鼠空間記憶能力和海馬DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表達水平顯著低于正常對照組，而APP、PS1和Aβ42蛋白表達水平顯著增加，提示Tg APP/PS1小鼠海馬總DNA甲基化水平降低，腦內Aβ42含量增加，學習記憶能力下降。DNA甲基化可以直接影響基因的表達并調控細胞的生長和分化[19]。海馬神經(jīng)元DNMT1的表達高于其他組織[20]。

AD常伴有高同源型HCY和低維生素B12和低葉酸癥狀，老年人DNA甲基化水平普遍低于青年人，老年人總基因組甲基化程度降低，但是局部的CpG島出現(xiàn)異常的高甲基化，這個現(xiàn)象為AD發(fā)生的重要特征之一，提示AD腦內甲基化模式發(fā)生顯著性變化[21]。SIEGMUND等人[22]對AD患者大腦尸檢也發(fā)現(xiàn)，AD患者大腦皮層DNA甲基化程度顯著降低，同時還發(fā)現(xiàn)AD患者大腦皮層PS1基因表達也顯著增加，提示大腦皮層DNA甲基化水平的降低可能是誘導AD發(fā)生的主要病因。MASTROENI等人[16]檢測了AD患者大腦皮層DNA甲基化標記物和DNA甲基化相關酶的表達水平發(fā)現(xiàn)，AD大腦神經(jīng)元DNMT1和多種表觀遺傳學標記物顯著降低，而且這種降低伴有神經(jīng)原纖維纏結尤其顯著。而在AD細胞（（N2a-APP）實驗中發(fā)現(xiàn)DNMT1表達顯著降低，而葉酸可以通過提高N2a-APP細胞DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表達水平，減少Aβ的生成[23]。

Aβ是APP在β-分泌酶和γ-分泌酶的作用下生成的，正常情況下，β-分泌酶和γ-分泌酶啟動子區(qū)受DNA甲基化的調節(jié)，機體通過DNA甲基化作用對ɑ-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶實現(xiàn)精確的調控，而在AD海馬，這種調控作用出現(xiàn)異常，導致Aβ細胞外聚集增多[24]。AD患者大腦皮層APP啟動子區(qū)低甲基化導致Aβ的生成顯著增加[25]。SCARPA等人[26]的研究也證實，β-分泌酶和γ-分泌酶表達水平受DNA甲基化的調節(jié)，DNA低甲基化導致海馬PS1和BACE基因過表達，并最終使Aβ的生成增多。但也有截然不同的研究結果，研究[27]證實，AD患者大腦APP啟動子區(qū)甲基化水平與正常對照組沒有顯著性差異，并認為APP啟動子區(qū)DNA甲基化水平對調節(jié)APP基因的表達沒有產(chǎn)生影響。COPPIETERS等人[28]對13名AD患者大腦額中回和29名AD患者顳中回DNA甲基化水平檢測后發(fā)現(xiàn)，AD患者顳中回DNA甲基化水平顯著上升，AD患者顳中回DNA甲基化水平與Aβ和Tau蛋白水平存在正相關。導致上述研究結果不一致的原因可能是個體差異及AD發(fā)病程度的不同導致的，而不同的測試區(qū)域，所得實驗結果可能也會存在差異。而DNA甲基化水平存在顯著的個體差異，AD患者大腦PS1、載脂蛋白E、亞甲基四氫葉酸還原酶啟動子區(qū)甲基化程度發(fā)生顯著變化[29]。葉酸缺乏誘導的DNA低甲基化提高BACE和PS1的基因表達水平，導致海馬神經(jīng)元Aβ的生成顯著增多，而補充SAM可以降低BACE和PS1基因表達水平，減少Aβ的生成[30]。動物實驗[31]證實，葉酸缺乏提高APP轉基因小鼠PS1和BACE蛋白表達水平，導致Aβ生成增加，加速了Aβ細胞外聚集速度。參與成人海馬突觸可塑性的reelin和腦源性生長因子啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)在DNMT的活性被抑制后，呈現(xiàn)快速老化的狀態(tài)，抑制DNMT活性阻斷了突觸誘發(fā)的長時程增強[32]。敲除DNMT1和DNMT3a基因導致小鼠海馬長時程可塑性出現(xiàn)異常，導致小鼠出現(xiàn)學習和空間記憶障礙，推測DNMT1和DNMT3a是突觸可塑性和學習記憶形成過程中所必須的[33]。

3.2運動對AD空間學習記憶的影響

體育鍛煉對成年和衰老大腦的神經(jīng)發(fā)生具有重要的調節(jié)作用，體育活動和持續(xù)的身體鍛煉可以代償性的延緩增齡性神經(jīng)疾病的發(fā)生[34]。本實驗結果顯示，10周的跑臺運動顯著降低Tg APP/PS1小鼠海馬APP、PS1和Aβ42蛋白表達水平，水迷宮實驗結果顯示，TE組小鼠在第3、第4和第5天的潛伏期顯著低于同天TC組，穿越平臺次數(shù)顯著多于TC組，提示運動通過降低Aβ42蛋白表達水平，提高Tg APP/PS1小鼠學習記憶能力。ADLARD等人[35]的研究發(fā)現(xiàn)，5個月的自主跑輪運動使Tg CRND8小鼠大腦額葉皮層、皮層及海馬區(qū)Aβ的含量分別下降了38%、53%和40%，酶聯(lián)免疫實驗結果顯示，5個月的自主跑輪運動使TgCRND8小鼠大腦皮層Aβ1-40和Aβ1-42含量分別降低了35%和22%，水迷宮實驗結果顯示，運動組在第1天、第2天和第3天的逃避潛伏期顯著低于安靜組，提示自主跑輪運動通過降低Tg CRND8小鼠大腦額葉皮層、皮層及海馬區(qū)Aβ的含量，提高Tg CRND8小鼠學習記憶能力。CHO等人[36]的研究也證實，與安靜組相比，16周的跑臺運動顯著降低13月齡NSE/ APPsw小鼠大腦Aβ42的含量，降低NSE/APPsw小鼠潛伏期，提示16周的跑臺運動通過降低大腦Aβ42的含量，提高AD小鼠的學習記憶能力。LIU等人[37]的研究發(fā)現(xiàn)，5個月的跑臺運動顯著降低Tg APP/PS1小鼠海馬Aβ的沉積速度，提高Tg APP/PS1小鼠學習記憶能力。但也有學者認為運動對AD腦內Aβ含量作用不明顯，KEHC等人[38]的研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)3周的中小強度的跑臺運動對7~8月齡和24月齡Tg APP/PS1小鼠海馬Aβ斑塊沒有產(chǎn)生顯著的影響。導致上述研究結果不一致的原因可能是實驗動物的模型、運動持續(xù)的時間以及運動強度不同等因素造成的。

3.3運動與DNA甲基化

表觀遺傳和基因是控制成年細胞增值和神經(jīng)發(fā)生的2個主要因素，有研究證實[39-41]，體育鍛煉能夠促進海馬神經(jīng)發(fā)生，增加海馬樹突BDNF的表達水平。積極的身體運動通過改變生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子（如VEGF、IGF-1、BDNF）的轉錄模式，發(fā)揮神經(jīng)生理學功能，提高大腦血管功能和神經(jīng)可塑性[42]。GOMEZ等人[43]的研究證實，7天的自主跑輪運動使3月齡SD大鼠海馬BDNF啟動子區(qū)DNA去甲基化作用增強，提高小鼠海馬BDNF mRNA的表達水平，提示運動可以通過調節(jié)小鼠海馬DNA甲基化水平，促進海馬神經(jīng)發(fā)生。目前關于運動調節(jié)AD海馬DNA甲基化的研究成果較少，本實驗結果顯示，10周的跑臺運動顯著提高Tg APP/PS1小鼠海馬DNMT1、DNMT3a和DNMT3b mRNA表達水平，提高Tg APP/PS1小鼠海馬DNA甲基化水平，降低Tg APP/PS1小鼠海馬APP、PS1和Aβ42蛋白表達水平，提高Tg APP/PS1小鼠學習記憶能力。DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在DNA甲基化過程中的作用不同，在DNA甲基化過程中，DNMT3a和DNMT3b首先建立DNA甲基化模式，隨后，DNMT1保持DNA甲基化模式，在衰老及增齡性疾病過程中，表現(xiàn)出明顯的全基因組低甲基化和部分基因啟動子區(qū)的高甲基化特征[44]。ABEL等人[8]的研究發(fā)現(xiàn)，1周的自主跑輪運動顯著改變8周齡C57小鼠海馬DNA甲基化水平，跑輪運動顯著降低C57小鼠海馬和皮層DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白表達水平，運動誘導的海馬DNA甲基轉移酶表達減少的同時伴隨著BDNF蛋白表達的顯著增加。衰老的過程伴隨著DNA甲基化的變化，而不同的運動形式對DNA甲基化修飾可能產(chǎn)生不一致的結果，運動誘導的DNA甲基化的改變受運動形式和動物年齡等因素的影響，VIVIANE等人[45]研究了單次跑臺運動對3月齡和20月齡Wistar大鼠海馬DNMT1和DNMT3b表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)，20月齡大鼠海馬DNMT1表達顯著低于3月齡組，而單次跑臺運動后1 h，3月齡大鼠DNMT1和DNMT3b的表達顯著低于安靜對照組，運動后18 h，3月齡大鼠DNMT1和DNMT3b水平均有下降，但差異不顯著，而20月齡大鼠海馬DNMT1和 DNMT3b水平在運動后1 h和18 h有所增加，但差異不顯著，提示，運動對不同月齡小鼠海馬DNA甲基化的影響是不一樣的。行為學實驗和生物化學實驗證實，針對同一運動刺激，不同年齡的小鼠其產(chǎn)生的生理反應也是不同的[46]。本實驗結果與上述結果不一致，可能的原因是選擇的實驗動物模型不同導致的，前者的實驗動物為8周齡C57小鼠，而本實驗為Tg APP/PS1轉基因小鼠，該小鼠在6-7月齡即表現(xiàn)出明顯的空間記憶障礙和腦內Aβ含量顯著增加，出現(xiàn)較為明顯的AD病理特征和行為學特征。

4　結論

10周的跑臺運動提高TgAPP/PS1小鼠空間學習記憶能力，推測可能是運動增加了Tg APP/PS1小鼠海馬DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表達水平，提高了AD小鼠海馬DNA甲基化水平，抑制了APP和PS1蛋白表達水平，減少了Aβ42生成，從而提高了AD小鼠空間記憶能力。

[1]GOLDBERG A D，ALLIS C D，BERNSTEIN E.Epigenetics：a land?scape takes shape[J].Cell，2007，128（4）：635-638.

[2]AKBARIAN S，BEERI M S，HAROUTUNIAN V.Epigenetic determi?nants of healthy and diseased brain aging and cognition[J].JAMA Neu?rol，2013，70（6）：711-718.

[3]STEEN E，TERRY B M，RIVERA E J，et al.Impaired insulin and in?sulin-like growth factor expression and signaling mechanisms in Al?zheimer's disease--is this type 3 diabetes?[J].J Alzheimers Dis，2005，7（1）：63-80.

[4]CHEN Y，DENG Y，ZHANG B，et al.Deregulation of brain insulin sig?naling in Alzheimer's disease[J].Neurosci Bull，2014，30（2）：282-294.

[5]CHOW V W，MATTSON M P，WONG P C，et al.An overview of APP processing enzymes and products[J].Neuromolecular Med，2010，12（1）：1-12.

[6]LISTA S，GARACI F G，TOSCHI N，et al.Imaging epigenetics in Al?zheimer's disease[J].Curr Pharm Des，2013，19（36）：6393-6415.

[7]CREWS D.Epigenetics，brain，behavior，and the environment[J].Hor?mones（Athens），2010，9（1）：41-50.

[8]ABEL J L，RISSMAN E F.Running-induced epigenetic and gene ex?pression changes in the adolescent brain[J].Int J Dev Neurosci，2013，31（6）：382-390.

[9]BERCHTOLD N C，CASTELLO N，COTMAN C W.Exercise and timedependent benefits to learning and memory[J].Neuroscience，2010，167（3）：588-597.

[10]GARCIA-CAPDEVILA S，PORTELL-CORTES I，TORRAS-GAR?CIA M，et al.Effects of long-term voluntary exercise on learning and memory processes：dependency of the task and level of exercise[J].Be?hav Brain Res，2009，202（2）：162-170.

[11]HOVEIDA R，ALAEI H，ORYAN S，et al.Treadmill running im?proves spatial memory in an animal model of Alzheimer's disease[J].Behav Brain Res，2011，216（1）：270-274.

[12]BAKER E J，GLEESON T T.The effects of intensity on the energetics of brief locomotor activity[J].J Exp Biol，1999，202（Pt 22）：3081-3087.

[13]張憲亮，徐波，范慶磊.自主跑輪運動對小鼠空間記憶能力及海馬NCAM、SCF基因表達的影響[J].西安體育學院學報，2015（1）：82-88.

[14]LAHIRI D K，MALONEY B.The"LEARn"（Latent Early-life Associ?ated Regulation）model integrates environmental risk factors and the developmental basis of Alzheimer's disease，and proposes remedial steps[J].Exp Gerontol，2010，45（4）：291-296.

[15]PELEG S，SANANBENESi F，ZOVOILIS A，et al.Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in mice[J].Science，2010，328（5979）：753-756.

[16]MASTROENI D，GROVER A，DELVAUX E，et al.Epigenetic chang?es in Alzheimer's disease：decrements in DNA methylation[J].Neurobi?ol Aging，2010，31（12）：2025-2037.

[17]FENG J，ZHOU Y，CAMPBELL S L，et al.Dnmt1 and Dnmt3a main?tain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons[J].Nat Neurosci，2010，13（4）：423-430.

[18]KE H C，HUANG H J，LIANG K C，et al.Selective improvement of cognitive function in adult and aged APP/PS1 transgenic mice by con?tinuous non-shock treadmill exercise[J].Brain Res，2011，1403：1-11.

[19]LISTER R，PELIZZOLA M，DOWEN R H，et al.Human DNA methy?lomes at base resolution show widespread epigenomic differences[J]. Nature，2009，462（7271）：315-322.

[20]GOTO K，NUMATA M，KOMURA J I，et al.Expression of DNA methyltransferase gene in mature and immature neurons as well as pro?liferating cells in mice[J].Differentiation，1994，56（1-2）：39-44.

[21]ROSS M G，DESAI M，KHORRAM O，et al.Gestational program?ming of offspring obesity：a potential contributor to Alzheimer's dis?ease[C].2007：213-217.

[22]SIEGMUND K D，CONNOR C M，CAMPAN M，et al.DNA methyla?tion in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons[J].PLoS One，2007，2（9）：e895.

[23]LI W，JIANG M，ZHAO S，et al.Folic Acid Inhibits Amyloid beta-Peptide Production through Modulating DNA Methyltransferase Activi?ty in N2a-APP Cells[J].Int J Mol Sci，2015，16（10）：25002-25013.

[24]SCARPA S，F(xiàn)USO A，D'ANSELMI F，et al.Presenilin 1 gene silenc?ing by S-adenosylmethionine：a treatment for Alzheimer disease?[J]. FEBS Lett，2003，541（1-3）：145-148.

[25]TOHGI H，UTSUGISAWA K，NAGANE Y，et al.Reduction with age in methylcytosine in the promoter region-224 approximately-101 of the amyloid precursor protein gene in autopsy human cortex[J].Brain Res Mol Brain Res，1999，70（2）：288-292.

[26]SCARPA S，CAVALLARO R A，D'ANSELMI F，et al.Gene silenc?ing through methylation：an epigenetic intervention on Alzheimer dis?ease[J].J Alzheimers Dis，2006，9（4）：407-414.

[27]BROHEDE J，RINDE M，WINBLAD B，et al.A DNA methylation study of the amyloid precursor protein gene in several brain regions from patients with familial Alzheimer disease[J].J Neurogenet，2010，24（4）：179-181.

[28]COPPIETERS N，DIERIKS B V，LILL C，et al.Global changes in DNA methylation and hydroxymethylation in Alzheimer's disease hu?man brain[J].Neurobiol Aging，2013.

[29]WANG S C，OELZE B，SCHUMACHER A.Age-specific epigenetic drift in late-onset Alzheimer's disease[J].PLoS One，2008，3（7）：e2698.

[30]FUSO A，SEMINARA L，CAVALLARO R A，et al.S-adenosylmethi?onine/homocysteine cycle alterations modify DNA methylation status with consequent deregulation of PS1 and BACE and beta-amyloid pro?duction[J].Mol Cell Neurosci，2005，28（1）：195-204.

[31]FUSO A，NICOLIA V，CAVALLARO R A，et al.B-vitamin depriva?tion induces hyperhomocysteinemia and brain S-adenosylhomocyste?ine，depletes brain S-adenosylmethionine，and enhances PS1 and BACE expression and amyloid-beta deposition in mice[J].Mol Cell Neurosci，2008，37（4）：731-746.

[32]LEVENSON J M，QIU S，WEEBER E J.The role of reelin in adult synaptic function and the genetic and epigenetic regulation of the ree?lin gene[J].Biochim Biophys Acta，2008，1779（8）：422-431.

[33]FENG J，ZHOU Y，CAMPBELL S L，et al.Dnmt1 and Dnmt3a main?tain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons[J].Nat Neurosci，2010，13（4）：423-430.

[34]VAN PRAAG H.Neurogenesis and exercise：past and future directions [J].Neuromolecular Med，2008，10（2）：128-140.

[35]ADLARD P A，PERREAU V M，POP V，et al.Voluntary exercise de?creases amyloid load in a transgenic model of Alzheimer's disease[J].J Neurosci，2005，25（17）：4217-4221.

[36]CHO J Y，UM H S，KANG E B，et al.The combination of exercise training and alpha-lipoic acid treatment has therapeutic effects on the pathogenic phenotypes of Alzheimer's disease in NSE/APPsw-trans?genic mice[J].Int J Mol Med，2010，25（3）：337-346.

[37]LIU H L，ZHAO G，ZHANG H，et al.Long-term treadmill exercise inhibits the progression of Alzheimer's disease-like neuropathology in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice[J].Behav Brain Res，2013，256：261-272.

[38]KE H C，HUANG H J，LIANG K C，et al.Selective improvement of cognitive function in adult and aged APP/PS1 transgenic mice by con?tinuous non-shock treadmill exercise[J].Brain Res，2011，1403：1-11.

[39]KEMPERMANN G.Why new neurons Possible functions for adult hip?pocampal neurogenesis[J].J Neurosci，2002，22（3）：635-638.

[40]PIETROPAOLO S，F(xiàn)ELDON J，ALLEVA E，et al.The role of volun?tary exercise in enriched rearing：a behavioral analysis[J].Behav Neu?rosci，2006，120（4）：787-803.

[41]VAN PRAAG H，SHUBERT T，ZHAO C，et al.Exercise enhances learning and hippocampal neurogenesis in aged mice[J].J Neurosci，2005，25（38）：8680-8685.

[42]TREJO J L，LLORENS-MARTIN M V，TORRES-ALEMAN I.The ef?fects of exercise on spatial learning and anxiety-like behavior are medi?ated by an IGF-I-dependent mechanism related to hippocampal neuro?genesis[J].Mol Cell Neurosci，2008，37（2）：402-411.

[43]GOMEZ-PINILLA F，ZHUANG Y，F(xiàn)ENG J，et al.Exercise impacts brain-derived neurotrophic factor plasticity by engaging mechanisms of epigenetic regulation[J].Eur J Neurosci，2011，33（3）：383-390.

[44]JOHNSON A A，AKMAN K，CALIMPORT S R，et al.The role of DNA methylation in aging，rejuvenation，and age-related disease[J]. Rejuvenation Res，2012，15（5）：483-494.

[45]ELSNER V R，LOVATEL G A，Moyses F，et al.Exercise induces age-dependent changes on epigenetic parameters in rat hippocampus：a preliminary study[J].Exp Gerontol，2013，48（2）：136-139.

[46]BUCHANAN J B，SPARKMAN N L，Chen J，et al.Cognitive and neu?roinflammatory consequences of mild repeated stress are exacerbated in aged mice[J].Psychoneuroendocrinology，2008，33（6）：755-765.

Exercise Improve Spatial Learning Memory Abilities in Alzheimer's Disease Mice by Increasing Methylation Level of DNA

HE Biao1，2，XU Bo1，2，ZHANG Xianliang3
（1.Key Laboratory of Adolescent Health Assessment and Exercise Intervention of Ministry of Education，East China Normal University，Shanghai 200241，China；2.School of PE and Health Care，East China Normal University，Shanghai 200241，China.3.School of PE，Shandong University，Jinan 251016，China）

This experiment is to investigate the effect and mechanism of DNA methylation on exercise which can alleviate Alzheimer's disease.Methods:3 months old APP/PS1 transgenic mice were divided into transgenic exercise group（TE，n=12）and transgenic control group（TC，n=12）randomly.Wild type mice were chose as normal control group（C，n=12）and exercise group（E，n=12）.Group E and group TE was given 10 weeks treadmill，group C and group TC were sec.Morris water maze test mice space memory ability after 10 weeks exercise，all mice were killed to obtain hippocampus，gene expression of DNMT1，DNMT3a and DNMT3b was detected by real time RT-PCR，protein expression levels of APP，PS1 and Aβ42 in mice hippocampus was detected by Western Blot.Results:Compared with group C，mRNA expression level of DNMT1 was significantly lower in TC group（P＜0.01），mRNA expression level of DNMT3a was significantly lower in TC group（P＜0.05），mRNA expression level of DNMT3b was significantly lower in TC group（P＜0.05），protein expression level of APP was significantly higher（P＜0.01），protein expression level of PS1 was significantly higher（P＜0.01），protein expression level of Aβ42was significantly higher（P＜0.01），spatial memory ability was significantly lower than normal control group（P＜0.05）.compared with group TC，mRNA expression level of DN?MT1 was significantly higher（P＜0.05），mRNA expression level of DNMT3a was significantly higher（P＜0.05），mRNA expression level of DNMT3b was signif?icantly higher（P＜0.05），protein expression level of APP was significantly lower in TE group（P＜0.05），protein expression level of PS1 was significantly lower in TE group（P＜0.05），protein expression level of Aβ42 was significantly lower in TE group（P＜0.05），spatial memory ability is significantly higher in TE group compare to TC group（P＜0.05）.Conclusions:10 weeks treadmill increased DNMT expression level and DNA methylation level in AD mice hippocampus. It also inhibited APP and PS1 protein expression level，reducing Aβ42 generation and finally improve AD mice spatial learning and memory ability.

treadmill；Alzheimer's disease；Epigenetic；DNA methylation；learning and memory

10.13297/j.cnki.issn1005-0000.2016.04.011

G 804.7

A

1005-0000（2016）04-333-07

2015-11-24；

2016-05-04；錄用日期：2016-05-06

國家自然科學基金項目（項目編號：31571225）

何標（1982-），男,安徽淮北人，講師，在讀博士研究生，研究方向為體育學習與身心健康；通信作者：徐波（1963-），男，山東煙臺人，教授，博士生導師，研究方向為體育運動與身心健康。

1.“青少年健康評價與運動干預”教育部重點實驗室華東師范大學，上海200241；2.華東師范大學體育與健康學院，上海200241；3.山東大學體育學院，山東濟南251016。

表觀遺傳學是指在DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下，由于受其他因素（環(huán)境、輻射、藥物）影響而導致的基因表型或基因表達發(fā)生變化，并能夠在親代與子代間發(fā)生遺傳傳遞現(xiàn)象的一門科學[1]。機體的衰老伴隨表觀遺傳修飾的改變，表觀遺傳的改變將導致許多增齡性疾病的發(fā)生[2]。阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種慢性、進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，伴有持續(xù)的記憶力減退和認知功能障礙[3]。AD主要以細胞外老年斑（senile plaques，SPs）、細胞內神經(jīng)纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）和以膽堿能神經(jīng)元的變性和突觸丟失為主要病理特征[4]。大量研究認為，淀粉樣前體蛋白（APP）在β-分泌酶和γ-分泌酶的作用下產(chǎn)生的Aβ在細胞外異常聚集是AD的主要病因[5]。AD是一種復雜的神經(jīng)退行性疾病，表觀遺傳機制可能在AD發(fā)生和發(fā)展過程中起著至關重要的作用[6]。DNA甲基化是表觀遺傳研究的一個重要方面，DNA甲基化是指磷酸胞苷酰雙核苷中的胞嘧啶在甲基化轉移酶（DNA methyltransferase，DNMTs）和甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的作用下，把一個甲基添加在DNA分子片段上形成5甲基胞嘧啶（5mC）。甲基化主要發(fā)生在真核生物轉錄起始區(qū)域一段富含GC序列的CpG島上，其作用是導致基因失活，一般情況下，DNA甲基化程度越高，相應的DNA被轉錄翻譯為功能蛋白質的可能性越小[7]。有研究[8]證實，運動通過調節(jié)小鼠海馬DNA甲基轉移酶的表達水平改變小鼠海馬DNA甲基化水平。大量研究[9-11]證實，體育鍛煉對學習記憶產(chǎn)生積極的促進作用，并對神經(jīng)退行性疾病具有一定的預防和緩解作用。目前，DNA甲基化在運動預防AD發(fā)病中的作用機制尚不清楚，為此，本研究探討運動誘導的小鼠海馬DNA甲基化的改變在預防AD發(fā)病中的作用及機制。