一個(gè)受黃萎病菌誘導(dǎo)的海島棉功能基因GbVWR的克隆與表達(dá)

張力佳張 艷榮 偉 楊 君 張桂寅 吳立強(qiáng) 李志坤吳金華 馬峙英 王省芬

華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 河北省作物種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 河北保定 071001

一個(gè)受黃萎病菌誘導(dǎo)的海島棉功能基因GbVWR的克隆與表達(dá)

張力佳**張 艷**榮 偉 楊 君 張桂寅 吳立強(qiáng) 李志坤吳金華 馬峙英 王省芬*

華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 河北省作物種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 河北保定 071001

黃萎病是一種土傳真菌維管束病害, 嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)。挖掘抗黃萎病相關(guān)基因?qū)τ诿藁裹S萎病遺傳改良具有重要意義。本研究通過(guò)篩選黃萎病菌脅迫下的海島棉全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)和陸地棉SSH文庫(kù), 獲得一個(gè)與黃萎病菌脅迫相關(guān)的基因, 命名為GbVWR。生物信息學(xué)特征和基因表達(dá)分析表明, GbVWR基因全長(zhǎng)520 bp, 開(kāi)放讀碼框198 bp, 編碼65個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白, 理論等電點(diǎn)為5.32, 包含一個(gè)信號(hào)肽和一個(gè)跨膜區(qū), 是一種分泌蛋白。GbVWR基因可以誘導(dǎo)表達(dá)7 kD的蛋白。在GbVWR基因起始密碼子上游1500 bp的核苷酸序列區(qū)間預(yù)測(cè)到真菌激發(fā)子響應(yīng)、激素響應(yīng)、傷口響應(yīng)及黃酮生物合成基因調(diào)節(jié)等應(yīng)答元件。GbVWR基因在海島棉根中表達(dá)最高, 莖中其次, 葉中最低。受黃萎病菌誘導(dǎo)后, GbVWR基因在接菌后2 h可對(duì)黃萎病菌作出應(yīng)答反應(yīng)。此外SA、ET和GA均可顯著誘導(dǎo)GbVWR基因的表達(dá)。初步推斷GbVWR是海島棉抵御黃萎病菌過(guò)程中一個(gè)新的功能基因, 通過(guò)參與多種激素信號(hào)途徑發(fā)揮功能。

海島棉; 抗黃萎病; 未知基因(GbVWR); 克隆; 基因表達(dá)

陸地棉(Gossypium hirsutum)和海島棉(G. barbadense)是世界上兩大主要栽培棉種。陸地棉以產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)而成為第一大栽培棉種, 年產(chǎn)量超過(guò)總產(chǎn)量的 95%。黃萎病是棉花的重要病害之一[1], 常帶來(lái)較大產(chǎn)量損失和品質(zhì)下降, 是當(dāng)前影響棉花生產(chǎn)的重要因素[2-3]。黃萎病致病菌從棉花根部侵染, 通過(guò)維管束進(jìn)入植物體進(jìn)一步繁殖擴(kuò)散,最終引起棉株系統(tǒng)發(fā)病[4]。目前, 防治黃萎病尚無(wú)高效殺菌劑和有效栽培耕作方法[6-7], 種植抗病品種被認(rèn)為是一種最有效、最經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的策略[8-9]。

陸地棉和海島棉起源于共同的祖先, 但二者在農(nóng)藝性狀上具有顯著的差別[11]。陸地棉中缺乏免疫或高抗黃萎病的抗源材料, 而栽培海島棉具有免疫或高抗黃萎病、且品質(zhì)優(yōu)良的特點(diǎn)[7,11-12]。將海島棉的黃萎病抗性轉(zhuǎn)育到陸地棉或利用基因工程手段將海島棉的抗病基因轉(zhuǎn)化到陸地棉中來(lái)改良陸地棉的抗病性是現(xiàn)代棉花抗病育種的重要策略之一。因此研究海島棉抗黃萎病機(jī)制及分離鑒定抗病相關(guān)基因?qū)τ诿藁裹S萎病分子育種具有重要意義。

棉花的抗病分子機(jī)制極為復(fù)雜[3,10]。目前, 通過(guò)海陸雜交將海島棉的黃萎病抗性轉(zhuǎn)育到陸地棉存在很多困難, 雜交后代往往由于種間雜交不親和出現(xiàn)雜交衰敗[12-13]。因此, 更好地了解棉花抗黃萎病的分子機(jī)制尤為重要。關(guān)于棉花抗黃萎病相關(guān)基因的挖掘與克隆已取得一定進(jìn)展。例如, Zhang等[14]利用同源法克隆了海島棉GbVe基因, 該基因與番茄Ve1基因同源, 并進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)基因擬南芥增強(qiáng)了對(duì)黃萎病的抗病性。隨后, 有研究者也從海島棉中克隆了Gbve1基因, 且證明Gbve1對(duì)落葉型和非落葉型大麗輪枝菌具有抗性[15]。還有研究利用VIGS技術(shù)證明棉花抗黃萎病需要 GhNDR1和 GhMKK2的參與[16], GbSTK、GhPAO、GbHyPRP1等基因?qū)γ藁裹S萎病具有作用[17-19]。近年來(lái), 許多研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、蛋白質(zhì)組學(xué)及芯片技術(shù)鑒定了大量的參與棉花與大麗輪枝菌互作過(guò)程的差異表達(dá)基因[20-21], 然而這些基因與抗病遺傳的關(guān)系及對(duì)抗性的貢獻(xiàn)仍不清楚, 因此需要開(kāi)展深入研究, 以明確基因的功能,為進(jìn)一步解析棉花抗黃萎病的分子機(jī)制及抗病分子育種奠定重要基礎(chǔ)。

隨著二倍體、四倍體棉種基因組測(cè)序的完成,基因組序列信息為深入挖掘與利用棉花重要功能基因奠定基礎(chǔ)[22-26]。棉花抗黃萎病基因的研究已有許多報(bào)道, 然而, 仍有部分序列信息在基因組對(duì)應(yīng)區(qū)段中沒(méi)有任何解讀, 可能屬于未知基因。課題組前期構(gòu)建的黃萎病菌誘導(dǎo)下海島棉全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)陸地棉SSH文庫(kù)及轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)測(cè)序中均發(fā)現(xiàn)多條受黃萎病菌誘導(dǎo)而功能信息完全未知的基因序列, 對(duì)這些基因開(kāi)展相關(guān)研究, 將為解析棉花抗黃萎病機(jī)制奠定基礎(chǔ), 為棉花抗黃萎病增添新的功能基因。通過(guò)篩選黃萎病菌誘導(dǎo)的抗病海島棉全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)[21]和耐病陸地棉 SSH 文庫(kù)[27], 發(fā)現(xiàn)一個(gè)受黃萎病菌快速、強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的基因, 經(jīng)NCBI比對(duì), 該基因目前沒(méi)有任何注釋信息, 將其命名為GbVWR。為了解GbVWR在棉花抗黃萎病中的作用, 本研究對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)、組織表達(dá)特異性、黃萎病菌脅迫及激素誘導(dǎo)的表達(dá)模式分析。研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究該基因的功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以抗黃萎病海島棉品系Pima 90-53為材料, 選取飽滿、一致的種子, 經(jīng)干凈自來(lái)水浸泡直至露白,放在發(fā)芽盤中, 28℃恒溫暗培養(yǎng) 8～12 h, 待長(zhǎng)出0.5～1.0 cm 胚根時(shí), 挑選發(fā)芽一致的種于澆透營(yíng)養(yǎng)液的蛭石中, 上面蓋一層蛭石及保鮮膜, 在溫光濕可控的人工氣候室培養(yǎng), 待棉苗生長(zhǎng)至二葉一心時(shí)用于接菌試驗(yàn)或激素處理。

1.1.1 黃萎病菌誘導(dǎo)處理 強(qiáng)致病力落葉型菌系(Verticillium dahliae)臨西 2-1由本室分離鑒定并繼代保存于PDA培養(yǎng)基[28]。挑選生長(zhǎng)狀況健康一致的棉苗, 參照 Zhang等[21]的方法接菌, 根據(jù)大麗輪枝菌侵染植物根部的定殖過(guò)程[29], 參照囊括大麗輪枝菌孢子附著、萌發(fā), 形成菌絲及進(jìn)一步擴(kuò)展等各時(shí)間段, 分別在接菌后2、4、6、12、24和36 h取植株根部組織。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。對(duì)照組用蒸餾水代替黃萎病菌液對(duì)棉苗進(jìn)行處理。取樣時(shí), 先用滅菌水將根清洗干凈, 再將根、莖、葉分別用液氮速凍并保存在-80℃。提取上述各樣本總RNA用于GbVWR基因表達(dá)分析

1.1.2 乙烯(ET)和水楊酸(SA)處理 挑選生長(zhǎng)健康一致的棉苗, 葉面噴施ET (5 mmol L-1)和SA (10 mmol L-1)溶液, 對(duì)照組噴施無(wú)菌水。分別在處理后6、12、24、36和48 h取植株根組織, 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)生物學(xué)重復(fù); 分別提取各樣本總RNA, 分析GbVWR基因受激素誘導(dǎo)的表達(dá)規(guī)律。

1.1.3 赤霉素(GA)處理 參照 Peng等[30]的方法水培海島棉幼苗, 待幼苗長(zhǎng)至二葉一心時(shí)選取生長(zhǎng)健壯、整齊一致的幼苗轉(zhuǎn)移至含有100 mg L-1[31-32]赤霉素水溶液中生長(zhǎng), 對(duì)照組采用無(wú)菌水處理。分別取處理后6、12、24、36和48 h的根, 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。樣品經(jīng)液氮速凍并保存在-80℃?zhèn)溆?/p>

1.2 棉花總RNA的提取及cDNA的合成

將-80℃保存的樣本用液氮研磨成粉狀, 使用EASYspin植物RNA提取試劑盒(重慶波爾生物科技有限公司), 按照說(shuō)明書提取樣本總RNA。通過(guò)瓊脂糖電泳和NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific)檢測(cè)RNA的完整度和濃度。采用ReverTra Are qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (TOYOBO)試劑盒, 參照說(shuō)明書合成第1鏈cDNA。

1.3 GbVWR基因gDNA和cDNA序列的克隆

黃萎病菌脅迫處理的海島棉Pima 90-53根組織全長(zhǎng) cDNA文庫(kù)由本課題組構(gòu)建并保存[25]。利用cDNA文庫(kù)中EST 序列在棉花D基因組進(jìn)行比對(duì),根據(jù)比對(duì)到的序列設(shè)計(jì)引物ORF-F和ORF-R (表1),分別以Pima 90-53根基因組DNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收目的條帶。將目的片段連接到PMD19-T (TaKaRa)載體, 再通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10及菌落PCR檢測(cè), 最終測(cè)序分析獲得目的基因序列。采用EasyPure Plant Genomic DNA Kit (TransGen Biotech)提取棉苗根基因組 DNA; 分別采用 EasySpin植物RNA提取試劑盒(重慶波爾生物科技有限公司)和ReverTra Are qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (TOYOBO)按照相應(yīng)說(shuō)明書提取RNA及合成cDNA。

1.4 GbVWR基因的生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI的Blast和CDD數(shù)據(jù)庫(kù)分析GbVWR的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域; 利用ProtParam (http：//web. expasy.org/protparam/)在線分析蛋白質(zhì)的氨基酸組成、等電點(diǎn)、相對(duì)分子量等理化性質(zhì); 利用SignalP3.0 (http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)進(jìn)行信號(hào)肽分析; 通過(guò)在線軟件 ProtScale (http：//cn.expasy.org/ cgi-bin/protscale.pl)進(jìn)行親/疏水性分析; 利用TMHMM v2.0在線軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/)分析蛋白跨膜域。在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//cgp.genomics. org.cn/page/cn/index.jsp)中 Blast GbVWR同源基因,通過(guò) DNAMAN7.0進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。通過(guò)PlantCARE (http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/)分析啟動(dòng)子的順式作用元件。

1.5 GbVWR基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)

將 GbVWR基因的 ORF片段連接到表達(dá)載體pET32a(+)中構(gòu)建融合表達(dá)載體。具體步驟為, 根據(jù)所克隆的 GbVWR基因的序列及原核表達(dá)載體pET32a(+)多克隆位點(diǎn)序列, 設(shè)計(jì)原核表達(dá)載體引物GbVWR-EF1/VWR-ER1 (表1), 用BamH I和EcoR I雙酶切含有 GbVWR基因的質(zhì)粒和 pET32a(+)質(zhì)粒,分別回收目的片段, 經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞, 經(jīng)PCR檢測(cè)后挑取陽(yáng)性克隆送至上海生工生物科技有限公司測(cè)序, 將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體命名為 pET32a-GbVWR。GbVWR蛋白的表達(dá)與檢測(cè)參照 Mo等[18]的方法。為了區(qū)分目標(biāo)蛋白, 在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中設(shè)置BL21 (DE3)空菌株和含有空載體質(zhì)粒 pET32a(+)的 BL21(DE3)菌株 2個(gè)對(duì)照。取樣時(shí)間、數(shù)量和加入的誘導(dǎo)物濃度均與轉(zhuǎn)化菌株一致。

1.6 GbVWR基因的熒光定量PCR表達(dá)分析

參照TOYOBO的熒光定量試劑盒THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix的操作說(shuō)明進(jìn)行熒光定量PCR分析。根據(jù)qRT-PCR引物的設(shè)計(jì)要求, 采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物, 引物的退火溫度為58～62℃, 長(zhǎng)度為19～26 bp, GC含量為50%～60%, 擴(kuò)增長(zhǎng)度為90～150 bp。采用20 μL擴(kuò)增體系, 包括2×SYBR mix 10 μL, cDNA 1 μL ( ＜100 ng), 上下游引物各1 μL (引物濃度為5 μmol L-1), 滅菌ddH2O 7 μL?；驍U(kuò)增上游引物為 GbVWR-RT-F、下游引物的 GbVWR-RT-R,以棉花PP2A和UBQ14基因作為內(nèi)參, 內(nèi)參基因擴(kuò)增中所用上下游引物為 PP2A-F、PP2A-R和UBQ14-F、UBQ14-R (表1)。反應(yīng)條件為95℃ 10 s; 56℃ 15 s; 72℃ 15 s, 40個(gè)循環(huán), 然后50℃ 2 min; 65℃ 5 s; 95℃ 5 s。反應(yīng)在Bio-Rad CFX96 Real-time System熒光定量PCR儀上運(yùn)行。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù), 采用2-ΔΔCt法進(jìn)行基因相對(duì)定量分析[33]。利用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

表1 本試驗(yàn)使用的引物Table 1 Primer sequences used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 GbVWR基因的克隆及生物信息學(xué)分析

2.1.1 GbVWR全長(zhǎng)cDNA和gDNA的克隆與序列分析 分別以海島棉 Pima90-53根組織的 cDNA和gDNA為模板, 克隆得到的海島棉GbVWR序列與cDNA全長(zhǎng)文庫(kù)中的301-G12克隆所包含的CDS序列完全一致; GbVWR基因全長(zhǎng)520 bp, 包含198 bp ORF (Open Reading Frame), 其中A、T、C、G的含量分別為27.27%、27.27%、28.28%和17.17%, 編碼65個(gè)氨基酸殘基, 預(yù)測(cè)分子量為7.0 kD。通過(guò)在線ProtParam 分析, GbVWR 蛋白的分子式為C614H1032N198O253S56, 相對(duì)分子量為7 kD, 理論等電點(diǎn)(pI)為5.32, 該蛋白中氨基酸相對(duì)含量較高的有丙氨酸Ala (27.3%, 54個(gè))、半胱氨酸Cys (28.3%, 56個(gè))、甘氨酸Gly (17.2%, 34個(gè))、蘇氨酸Thr (27.3%, 54個(gè))。將GbVWR基因序列與中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所雷蒙德氏棉(D基因組)、亞洲棉(A基因組)以及陸地棉AD基因組比對(duì), 發(fā)現(xiàn)GbVWR在A和D基因組分別存在1個(gè)拷貝, 在AD基因組存在2個(gè)拷貝。

2.1.2 GbVWR基因的生物信息學(xué)分析 利用TMpred在線預(yù)測(cè)蛋白跨膜域, 顯示GbVWR基因包含一個(gè)跨膜域, 位于第4至第24個(gè)氨基酸, 方向?yàn)橛赡?nèi)向膜外(圖1)。利用ProtScale在線分析表明,該基因是疏水性不可溶蛋白, 屬于脂溶性蛋白, 且有一個(gè)信號(hào)肽。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明該蛋白可能在細(xì)胞外。利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明, 該基因不存在已知的蛋白結(jié)構(gòu)域, 沒(méi)有相關(guān)的蛋白功能報(bào)道, 沒(méi)有同源基因和其他相似序列, 說(shuō)明是一個(gè)未知的新基因。

2.1.3 GbVWR基因的上游啟動(dòng)子分析 對(duì)位于GbVWR基因起始密碼子ATG的5′區(qū)上游1500 bp的啟動(dòng)子核苷酸序列, 利用 PlantCARE啟動(dòng)子分析軟件預(yù)測(cè)到多種順式作用元件(表 2), 包括與光響應(yīng)、真菌激發(fā)子響應(yīng)、熱響應(yīng)、干旱響應(yīng)、激素響應(yīng)、傷口響應(yīng)、黃酮生物合成基因調(diào)節(jié)、代謝調(diào)節(jié)及器官發(fā)育等相關(guān)元件。

2.2 GbVWR原核表達(dá)重組子的鑒定及在大腸桿菌BL21中的表達(dá)

圖1 GbVWR蛋白跨膜域與方向預(yù)測(cè)Fig. 1 Prediction of transmembrane region and orientation for GbVWR

將PCR鑒定和測(cè)序后pET32a-GbVWR轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3), 經(jīng)1.0 mmol L-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行 SDS-PAGE分析(圖 2)。融合表達(dá)蛋白在37℃條件下誘導(dǎo)出1條約25 kD的特異條帶, 與預(yù)期目標(biāo)表達(dá)蛋白大小基本一致。其中pET32a(+)空載體表達(dá)約18 kD的蛋白, GbVWR理論上表達(dá)7 kD的蛋白, 二者融合蛋白為25 kD。37℃、200轉(zhuǎn) min-1的誘導(dǎo)條件下, 目的蛋白9 h即可高效表達(dá), 且24 h后依然保持較高的表達(dá)水平(圖2)。

表2 GbVWR基因上游調(diào)控區(qū)順式作用元件Table 2 cis-elements in the upstream regulation region of GbVWR gene

2.3 GbVWR基因的組織表達(dá)特性分析

以海島棉品系Pima 90-53根、莖、葉組織的總RNA反轉(zhuǎn)錄的 cDNA為模板, 利用 qRT-PCR分析GbVWR基因的組織表達(dá)特異性。熒光定量 PCR結(jié)果表明 GbVWR基因在海島棉的根、莖、葉中均有表達(dá), 但表達(dá)量存在差異, GbVWR基因在根中的表達(dá)量最高, 莖次之, 葉中表達(dá)量最低(圖3)。

圖2 重組蛋白pET32a-GbVWR表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the expressed product of recombinant pET32a-GbVWR箭頭所指為目的蛋白條帶; M： 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1： pET32a(+)空載體37℃下誘導(dǎo)9 h; 2： BL21(DE3)空菌株37℃下誘導(dǎo)9 h; 3～4：pET32a-GbVWR 37℃下分別誘導(dǎo)9 h和24 h。Arrows indicate the target protein bands; M： protein molecular weight standard; 1： strains harbouring pET-32a(+) after induction for 9 hours at 37℃; 2： strains harbouring BL21 (DE3) after induction for 9 hours at 37℃; 3-4： total proteins of engineering bacteria strains after induction for 9 and 24 hours at 37℃, respectively.

2.4 GbVWR基因在黃萎病菌和激素處理下的熒光定量分析

2.4.1 黃萎病菌誘導(dǎo)下GbVWR基因的表達(dá)規(guī)律

GbVWR基因在黃萎病菌脅迫下的表達(dá)模式如圖 4所示, 分別以各時(shí)間點(diǎn)的水處理樣品為對(duì)照, GbVWR基因受黃萎病菌快速、強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá), 在接菌后2 h的表達(dá)量為對(duì)照的2倍多; 隨著病菌脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), GbVWR基因的表達(dá)量在6 h和12 h較對(duì)照顯著降低; 而在24 h和36 h, GbVWR基因的表達(dá)量又顯著高于同一時(shí)期的對(duì)照。這表明GbVWR基因參與了棉花與黃萎病菌的互作, 且在病原菌侵染棉花的早期階段發(fā)揮作用。

圖3 GbVWR在海島棉品系Pima 90-53不同組織中的RT-PCR分析Fig. 3 Tissue-specific expression analysis pattern of GbVWR by qRT-PCR in the G. barbadense Pima 90-53同一處理時(shí)間內(nèi), “A”表示在0.01水平上存在極顯著差異?！癆” means the significant difference at the 0.01 probability level at the same treatment.

圖4 GbVWR在棉花黃萎病菌脅迫下的RT-PCR分析Fig. 4 Expression analysis of GbVWR under Verticillium dahliae stress同一處理時(shí)間內(nèi), “A”表示在0.01水平上存在極顯著差異?！癆” means the significant difference at the 0.01 probability level at the same treatment.

2.4.2 外施激素處理下 GbVWR基因的模式表達(dá)

GbVWR基因的表達(dá)受到水楊酸(SA)明顯的誘導(dǎo)。在處理后6 h, GbVWR基因的表達(dá)量顯著增加, 在24 h出現(xiàn)峰值(處理后的基因表達(dá)量約是對(duì)照的 20倍),隨后表達(dá)量降低, 在 48 h基本恢復(fù)至處理前的水平。受乙烯處理后, GbVWR基因的表達(dá)出現(xiàn)明顯被誘導(dǎo)表達(dá)的趨勢(shì)。在處理后的48 h內(nèi), GbVWR基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照(12 h除外), 并在6 h出現(xiàn)表達(dá)峰值?；贕bVWR基因啟動(dòng)子序列中存在參與赤霉素響應(yīng)的元件, 為進(jìn)一步確定 GbVWR基因是否能夠響應(yīng)赤霉素(GA)處理, 進(jìn)行了該基因在赤霉素處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)分析。熒光定量結(jié)果顯示, 用 100 mg L-1的 GA水培處理棉苗6 h后, GbVWR基因表達(dá)極顯著高于對(duì)照, 隨著處理時(shí)間的推移直至24 h, 基因的表達(dá)持續(xù)升高, 并在12 h仍顯著高于對(duì)照; 在36 h基因的表達(dá)開(kāi)始迅速下降,但表達(dá)量依然極顯著高于對(duì)照(圖 5)。上述研究結(jié)果表明, GbVWR基因受SA、ET和GA激素的誘導(dǎo)表達(dá)。

圖5 外源激素處理下GbVWR的表達(dá)模式分析Fig. 5 Expression analysis of VWR after treatment by hormones同一處理時(shí)間內(nèi), “A”表示在0.01水平上存在極顯著差異,“a”表示在0.05水平上存在顯著差異?！癆” means the significant difference at the 0.01 probability level at the same treatment, “a” means the significant difference at the 0.05 probability level.

3 討論

本研究基于課題組已構(gòu)建的黃萎病菌脅迫海島棉品系Pima90-53cDNA文庫(kù)[25], 篩選出一個(gè)未知的基因序列(GbVWR), 其與二倍體棉花和四倍體棉花均具很高同源性的區(qū)段, 表明 GbVWR序列的確為棉花中存在的基因。NCBI中Blast分析發(fā)現(xiàn), GbVWR基因與NCBI中已經(jīng)注冊(cè)的XR_001125651.1為同一基因, 而基因注冊(cè)者對(duì)該序列的注釋為 ncRNA, 本研究結(jié)果顯示GbVWR基因可以在37℃條件下被誘導(dǎo)表達(dá)7 kD的蛋白, 表明GbVWR基因是一個(gè)有編碼產(chǎn)物的新基因, 而非ncRNA。

生物信息學(xué)分析顯示, GbVWR基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有響應(yīng)真菌激發(fā)子和赤霉素的調(diào)控元件, 同時(shí)含有調(diào)控黃酮生物合成基因的元件, 暗示 GbVWR基因可能通過(guò)響應(yīng)赤霉素信號(hào)及調(diào)節(jié)植株次生代謝物的合成參與棉花對(duì)大麗輪枝菌的抵御過(guò)程?；诖? 本研究檢測(cè)了在黃萎病菌誘導(dǎo)及激素信號(hào)處理下 GbVWR基因的表達(dá)。黃萎病菌脅迫下, GbVWR基因在2 h被快速誘導(dǎo), 此時(shí)可能是GbVWR基因?qū)S萎病菌激發(fā)子作出的響應(yīng); 隨著接菌的推遲, 與對(duì)照相比該基因的表達(dá)量在6 h和12 h降低; 而到24 h和36 h再次升高。推測(cè)GbVWR基因在棉花與黃萎病菌互作過(guò)程的初期和后期均有重要作用。此外, GbVWR基因的表達(dá)具有很強(qiáng)的組織特異性, 主要在根中表達(dá), 這與黃萎病菌在棉花根部侵染的特點(diǎn)也是相吻合的[4]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果推測(cè)GbVWR基因?yàn)槊藁裹S萎病反應(yīng)中一個(gè)具有重要功能的新基因。

大量研究表明, 激素信號(hào)在植物抗病反應(yīng)中具有重要的作用, 一些抗病基因通過(guò)參與一個(gè)或幾個(gè)激素信號(hào)調(diào)節(jié)通路發(fā)揮其重要功能[34-35]。本研究結(jié)果顯示, GbVWR基因在處理后6 h即可響應(yīng)SA信號(hào),并且其表達(dá)量在24 h達(dá)到最高峰, 較對(duì)照高出約18倍。ET處理下, GbVWR基因的表達(dá)量整體呈上升趨勢(shì)。外施GA處理下, GbVWR基因同樣被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。上述結(jié)果證明 GbVWR基因可以參與不同植物激素信號(hào)分子調(diào)控, 推測(cè) GbVWR基因可能位于復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)位置, 通過(guò)響應(yīng)多種激素信號(hào)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在棉花抗黃萎病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在今后的研究中, 我們將通過(guò)構(gòu)建植物超表達(dá)載體和基因沉默載體分別轉(zhuǎn)化棉花, 進(jìn)一步驗(yàn)證該基因的功能及其作用機(jī)制。

4 結(jié)論

在抗病海島棉中克隆了參與抗黃萎病反應(yīng)的新基因GbVWR, 該基因ORF全長(zhǎng)198 bp, 編碼65個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)分子量為 7 kD, 理論等電點(diǎn)為 5.32,是一個(gè)分泌型蛋白。GbVWR可以表達(dá)一個(gè)約 7 kD的蛋白。GbVWR啟動(dòng)子含有響應(yīng)真菌激發(fā)子、激素、干旱、及調(diào)節(jié)黃酮生物合成等相關(guān)元件。GbVWR基因在棉花根、莖、葉中均有表達(dá), 但在根中的表達(dá)量最高; 此外, 該基因受黃萎病菌、SA、ET和GA誘導(dǎo)表達(dá), 初步推斷 GbVWR是海島棉抵御黃萎病菌過(guò)程中的一個(gè)新的功能基因, 通過(guò)參與多種激素信號(hào)途徑發(fā)揮功能。

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Cloning and Expression Analysis of a Functional Gene GbVWR Induced by Verticillium dahliae in Gossypium barbadense

ZHANG Li-Jia**, ZHANG Yan**, RONG Wei, YANG Jun, ZHANG Gui-Yin, WU Li-Qiang, LI Zhi-Kun, WU Jin-Hua, MA Zhi-Ying, and WANG Xing-Fen*

North China Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Education Ministry / Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Hebei / Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China

Verticillium dahliae is a destructive, soil-borne fungal pathogen that causes severe losses in cotton yield and fiber quality. Mining functional genes related to resistance against V. dahliae will benefit efforts to genetically improve crop plants. In this study, we identified a gene that involved in cotton defense against V. dahliae based on screening the full-length cDNA library and suppression subtractive hybridization library (SSH) induced by V. dahliae in Gossypium barbadense and Gossypium. hirsutum, respectively. Sequence analysis indicated that there was no any annotation in NCBI database, and we named the sequence from G. barbadense as GbVWR. We characterized GbVWR gene and analyzed its expression. The full length cDNA of GbVWR was 520 bp including a 198 bp open reading frame (ORF), encoding 65 amino acid residues. Bioinformatic analyses suggested that GbVWR belonged to secretory protein and tis theoretical isoelectric point was 5.32. Using pET-32a(+) as a fused expression vector, a recombinant plasmid pET32a-GbVWR was constructed. The recombinant protein was induced in Escherichia coli BL21 (DE3) with 1.0 mmol L-1IPTG then GbVWR could express about 7 kD protein in E. coli BL21 (DE3). In addition, diverse cis-acting promoter elements involved in fungal elicitor response, hormone response, wound-response, and flavonoid biosynthetic gene regulation were discovered in the promoter region of GbVWR. qPCR analysis showed that expression level of GbVWR was the highest in roots, and was significantly induced by V. dahliae. Besides, GbVWR could also be induced by SA, ET, and GA treatments, respec-tively. In conclusion, GbVWR is a new functional gene, which involved in multiple signal pathways in cotton defense response to Verticillium wilt.

Gossypium barbadense; Verticillium wilt resistance; GbVWR; Clone; Gene expression

10.3724/SP.J.1006.2016.01779

本研究由河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C2013204141), 高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20131302120002)和河北省百名優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計(jì)劃(14226308D)資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Hebei Province (C2013204141), the Special Research Found for the Doctoral Program of Higher Education (20131302120002), and the Science and Technology Support Project of Hebei Province (14226308D).

*通訊作者(Corresponding author)： 王省芬, E-mail： cotton@hebau.edu.cn

聯(lián)系方式： E-mail： 646560324@qq.com**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

稿日期)： 2016-03-14; Accepted(接受日期)： 2016-06-20; Published online(

日期)： 2016-06-27.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160627.0839.018.html