雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測腸道病毒方法的建立及應(yīng)用*

許聯(lián)紅，岳玉林，王永仿，楚 鷹，蔣立新

(1.江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇常州 213002；2.江蘇省南京市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科 210008)

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雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測腸道病毒方法的建立及應(yīng)用*

許聯(lián)紅1，岳玉林2，王永仿1，楚 鷹1，蔣立新1

(1.江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇常州 213002；2.江蘇省南京市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科 210008)

目的 建立檢測腸道病毒(EV)和腸道病毒71型(EV71)的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法。方法 設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)該方法的靈敏度、精密度等進(jìn)行評(píng)價(jià)。收集109例臨床手足口病患者糞便和咽拭子標(biāo)本用該法進(jìn)行檢測，并與EV71商品化試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 雙重?zé)晒釶CR法建立的EV和EV71標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(r)均為0.998；該法檢測EV和EV71的靈敏度分別達(dá)到0.5 TCID50/mL和0.05 TCID50/mL；檢測EV和EV71的批內(nèi)精密度均小于3%，總精密度均小于或等于4%；對(duì)腸道病毒及其他人類非腸道病毒進(jìn)行檢測，顯示了良好的特異性。109例臨床樣本用該法檢測出84例EV病毒陽性樣本，其中EV71陽性56例，EV71總陽性率為51.4%；與單重?zé)晒釶CR商品化試劑盒的檢測結(jié)果完全一致(P=1.000)。結(jié)論 建立的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法靈敏度高、穩(wěn)定性好，對(duì)手足口病的早期高通量快速診斷具有重要意義。

手足口病；腸道病毒；腸道病毒71型；雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR

手足口病(HFMD)是一種急性傳染病，由多種腸道病毒引起，多發(fā)生于5歲以下兒童，主要通過密切接觸或消化道傳播，基本臨床表現(xiàn)為手、足、口腔等部位出現(xiàn)皰疹，部分患者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病[1]。個(gè)別重癥患兒病情發(fā)展很快，最終可能導(dǎo)致死亡。引發(fā)HFMD的20多種腸道病毒中以EV71型最為常見。1969年Schmidt等[2]首次從加利福尼亞州患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標(biāo)本中分離出腸道病毒71型，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。EV71病毒主要通過糞-口傳播，且隱性感染者居多，因此易出現(xiàn)暴發(fā)流行[3-4]。該病已被我國定為乙類傳染病?？焖?、簡便、高敏感性的檢測方法對(duì)該病的預(yù)防控制極其重要。傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)方法等，步驟繁瑣，靈敏度不高，容易出現(xiàn)漏檢。本試驗(yàn)擬通過建立一種雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，在完全閉管的條件下同步檢測通用型腸道病毒(enterovirus,EV)和EV71病毒，為臨床HFMD患者的早期診斷提供一種有效、快速的檢測手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年3月至2015年8月南京市兒童醫(yī)院住院HFMD患兒的109份治療前標(biāo)本(糞便標(biāo)本64份和咽拭子45份)。HFMD診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華人民共和國衛(wèi)生部制定的2010年版《手足口病診療指南》。EV71/FY0805和EV71/BrCr病毒株由南京大學(xué)公共衛(wèi)生中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與試劑 病毒核酸提取試劑盒(江蘇碩世公司)，一步法熒光定量RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)，ABI7500熒光PCR儀(美國ABI公司)，腸道病毒71型核酸檢測試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因公司)。

根據(jù)EV71的VP1區(qū)核酸序列和EV的5′UTR區(qū)核酸序列，用Primer Express3.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物與TaqMan 探針，并對(duì)其進(jìn)行BLAST 序列比對(duì)，驗(yàn)證引物和探針的特異性。引物和探針序列見表1，均由上海生物工程公司合成。

表1 引物和探針序列

1.3 方法

1.3.1 病毒核酸的提取 糞便標(biāo)本須加入適量生理鹽水(0.5 g糞便或0.5 mL液態(tài)糞便樣本加5 mL生理鹽水)，然后將懸液12 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液進(jìn)行RNA抽提；咽拭子標(biāo)本中加入1 mL生理鹽水充分?jǐn)噭?dòng)10次，取200 μL提取RNA；病毒細(xì)胞培養(yǎng)物直接取200 μL培養(yǎng)液用于抽提RNA。取上述各種標(biāo)本200 μL于1.5 mL離心管中，加入600 μL 裂解液，震蕩混勻，室溫放置5 min；加入600 μL緩沖液震蕩混勻，混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12 000 r/min離心1 min，去掉廢液，重復(fù)此操作直至轉(zhuǎn)移完；加入500 μL漂洗液，12 000 r/min離心1 min，去掉廢液，重復(fù)漂洗1次；12 000 r/min空柱離心2 min；將吸附柱放入1個(gè)干凈的1.5 mL離心管中，加入50 μL洗脫液靜置5 min，12 000 r/min離心1 min收獲純化的核酸溶液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 雙重?zé)晒釸T-PCR檢測方法的建立 反應(yīng)體系：2×PCR 緩沖液12.5 μL，5 U/μL Ex Taq酶0.5 μL，5 U/μL 逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)0.5 μL，20 μmol /L 上、下游引物各0.5 μL，10 μmol /L探針0.5 μL，總RNA 5 μL，DEPC水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件:50 ℃ 30 min; 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 10 s,55 ℃ 35 s，共45個(gè)循環(huán)，在55 ℃進(jìn)行雙重?zé)晒庑盘?hào)檢測。

1.3.3 雙重?zé)晒釸T-PCR法的靈敏度檢測 將EV71/FY0805病毒株培養(yǎng)液(病毒滴度為5×105TCID50/mL)10倍連續(xù)稀釋(5～0.005 TCID50/mL)，提取病毒RNA，按上述條件進(jìn)行熒光定量RT-PCR，每個(gè)稀釋標(biāo)本重復(fù)檢測10次。

1.3.4 雙重?zé)晒釸T-PCR法的精密度檢測 每天分析1個(gè)批次，2個(gè)濃度樣本(5×102和0.5 TCID50/mL)，每個(gè)樣本重復(fù)測定3 次，連續(xù)檢測5 d。參照文獻(xiàn)[5]計(jì)算批內(nèi)精密度(CV批內(nèi))和總精密度(CV總)。

1.3.5 雙重?zé)晒釸T-PCR法的特異度檢測 應(yīng)用雙重?zé)晒釸T-PCR法分別檢測EV71病毒株、柯薩奇病毒A16、?？刹《尽⑤啝畈《竞土鞲胁《?。

1.3.6 雙重?zé)晒釸T-PCR法的臨床應(yīng)用 應(yīng)用雙重?zé)晒釸T-PCR法檢測收集的109例HFMD患者糞便和咽拭子樣品，并與腸道病毒71型核酸檢測試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用四格表資料的χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EV和EV71標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將EV71/FY0805病毒株培養(yǎng)液以10倍連續(xù)稀釋，提取病毒中的核酸(RNA)作為模板，按上述條件進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)，分別得到相應(yīng)熒光信號(hào)的EV和EV71特異性擴(kuò)增曲線，見圖1。然后建立相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)為病毒滴度的log值，縱坐標(biāo)為RT-PCR循環(huán)的Ct值，EV和EV71標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r)均為0.998，見圖2。

EV71擴(kuò)增曲線(a:5×104TCID50/mL,b:5×103TCID50/mL,c:5×102TCID50/mL,d:50TCID50/mL)。EV擴(kuò)增曲線(e:5×104TCID50/mL,f:5×103TCID50/mL,g:5×102TCID50/mL,h:50TCID50/mL)。

圖1 EV和EV71雙重?zé)晒釶CR擴(kuò)增曲線圖

圖2 EV71和EV標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.2 雙重?zé)晒釸T-PCR法的靈敏度 當(dāng)病毒滴度為5和0.5TCID50/mL時(shí)，10次EV和EV71均能檢出；當(dāng)?shù)味葹?.05 TCID50/mL時(shí)，10次中有2次EV未檢出，EV71全部檢出；而當(dāng)?shù)味葹?.005 TCID50/mL時(shí)，EV均未檢出， EV71有1次未檢出。因此該方法檢測EV和EV71的靈敏度分別為0.5和0.05 TCID50/mL。

2.3 雙重?zé)晒釸T-PCR法的精密度 病毒滴度為5×102TCID50/mL時(shí)，EV71和EV檢測所獲得的Ct值批內(nèi)精密度(CV批內(nèi))分別為2.1%和2.4%，總精密度(CV總)均為3.9%；病毒滴度為 0.5 TCID50/mL時(shí)，EV71和EV的批內(nèi)精密度分別為2.7%和2.6%，總精密度分別為4.0%和3.5%，見表2。

2.4 雙重?zé)晒釶CR法的特異度 EV71/FY0805 和EV71/BrCr 病毒株通用型EV和EV71檢測結(jié)果均為陽性；柯薩奇病毒A16和埃可病毒EV檢測陽性，EV71結(jié)果陰性；而輪狀病毒和流感病毒二者皆為陰性，見表3。

表2 雙重?zé)晒釸T-PCR法的精密度檢測(Ct值)

表3 雙重?zé)晒釶CR法的特異度檢測

+：陽性；-：陰性。

2.5 雙重?zé)晒釸T-PCR法的臨床應(yīng)用 對(duì)109份臨床HFMD患者樣品(其中糞便標(biāo)本64份，咽拭子標(biāo)本45份)利用雙重?zé)晒釸T-PCR和EV71單重?zé)晒釶CR商品化試劑盒進(jìn)行檢測。通用型EV病毒在糞便中檢出陽性52例，咽拭子中檢出32例，總陽性率為77.1%(84/109)。糞便和咽拭子標(biāo)本的EV71陽性率分別為56.25%(36/64)和44.4%(20/45)。雙重?zé)晒釸T-PCR法和EV71熒光PCR試劑盒檢測EV71總陽性率均為51.4%(56/109)，陽性和陰性符合率均為100%，檢測結(jié)果完全一致(P=1.000)，見表4。

表4 雙重?zé)晒釶CR法和單重?zé)晒釶CR試劑盒檢測EV71的結(jié)果比較

+:陽性；-：陰性。

3 討 論

傳統(tǒng)的檢測EV71病原體的方法有病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)方法和RT-PCR等。病毒分離培養(yǎng)是手足口病感染的實(shí)驗(yàn)室診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件和操作人員技術(shù)要求嚴(yán)格，培養(yǎng)周期長，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室分離陽性率不同，病毒流行期間，不能同時(shí)處理大量樣本[6-7]。中和抗體檢測費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，無法滿足快速、早期診斷的要求。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法可以檢測相應(yīng)病毒特異性IgM抗體，操作簡便、特異、準(zhǔn)確，適用于早期檢測，但在檢測低水平抗體時(shí)易出現(xiàn)假陰性，報(bào)道稱其和RT-PCR方法聯(lián)合檢測有助于提高HFMD的早期診斷[8-10]。病原微生物檢測已開始廣泛使用分子生物學(xué)技術(shù)，普通的RT-PCR技術(shù)雖然克服了以上缺點(diǎn)，已經(jīng)成為快速診斷的重要手段，但PCR后需進(jìn)行凝膠電泳分析，且系統(tǒng)開放，容易受環(huán)境因素發(fā)生交叉污染，造成假陽性，對(duì)疾病的診斷造成誤診[11-12]。

本研究建立的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法，利用TaqMan技術(shù)，改善了單重?zé)晒舛縍T-PCR耗時(shí)長，成本高和多重高通量RT-PCR易發(fā)生污染、靈敏度和特異性較低的不足[13]。該檢測方法能在一個(gè)反應(yīng)管中靈敏、特異地檢測并區(qū)分EV和EV71。EV71屬于EV 的一個(gè)亞型，利用RT-PCR 檢測EV71時(shí)，理論上不僅僅特異性的EV71探針應(yīng)該呈現(xiàn)陽性曲線，EV 的通用型EV 探針也應(yīng)該呈現(xiàn)陽性曲線，最后結(jié)果應(yīng)該顯示為雙陽性曲線。若是在檢測EV71時(shí)僅僅只有特異性EV71 探針顯示陽性而EV探針顯示為陰性時(shí)，則該樣本需重新進(jìn)行檢測。而對(duì)于EV陽性EV71陰性的標(biāo)本提示患者是由其他腸道病毒引起，為明確病因需進(jìn)一步進(jìn)行其他腸道病毒檢測。

本研究結(jié)果顯示，雙重?zé)晒釶CR法建立的EV和EV71標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均為0.998；檢測EV和EV71的靈敏度高，分別達(dá)到0.5 TCID50/mL和0.05 TCID50/mL；重復(fù)性好，批內(nèi)精密度均小于3%，總精密度均小于或等于4%；特異性檢測顯示只有EV71樣本呈現(xiàn)EV和EV71雙陽性曲線，其他病毒標(biāo)本均未出現(xiàn)特異性EV71陽性曲線，表明該法特異性強(qiáng)。臨床樣本檢測結(jié)果顯示，雙重?zé)晒釸T-PCR法通用型EV陽性檢出率為77.1%，EV71總陽性率為51.4%，與EV71商品化試劑盒的檢測結(jié)果完全一致(P=1.000)。以上結(jié)果表明雙重?zé)晒釸T-PCR法可以對(duì)EV和EV71進(jìn)行穩(wěn)定可靠的檢測。

本研究建立的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測腸道病毒快捷，靈敏度高，穩(wěn)定性好，污染小，省時(shí)省力，能夠有效檢測手足口病患者感染的病原體，也可進(jìn)行大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。

[1]Yang TT,Huang LM,Lu CY,et al.Clinical features and factors of unfavorable outcomes for non-polio enterovirus infection of the central nervous system in northern Taiwan,1994-2003[J].J Microbiol Immunol Infect,2005,38(6):417-424.

[2]SchmidtNJ,LennetteEH,HoHH.Anapparently new enterovirus isolated from patients with disease of the central nervous system[J].J Infect Dis,1974,129(3):304-309.

[3]Zhang Y,Zhu Z,Yang W,et al.An emerging recombinant human enterovirus 71 responsible for the 2008 outbreak of hand foot and mouth disease in Fuyang city of China[J].Virol J,2010,7(1):94.

[4]Liu SL,Pan H,Liu P,et al.Comparative epidemiology and virology of fatal and nonfatal cases of hand,foot and mouth disease in mainland China from 2008 to 2014[J].Rev Med Virol,2015,25(2):115-128.

[5]王薇，王治國，李少男．臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)廠家聲明的精密度和真實(shí)度的性能驗(yàn)證要求[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，25(12)：1001-1005．

[6]Ooi MH,Solomon T,Podin Y,et al.Evaluation of different clinical sample types in diagnosis of human enterovirus 71-associated hand-foot-and-mouth disease[J].J Clin Microbiol,2007,45(6):1858-1866.

[7]Tsai JD,Tsai HJ,Lin TH,et al.Comparison of the detection rates of RT-PCR and virus culture using a combination of specimens from multiple sites for enterovirus-associated encephalomyelitis during enterovirus 71 epidemic[J].Jpn J Infect Dis,2014,67(5):333-338.

[8]謝靖婧，楊桂林，劉映霞，等．腸道病毒71型手足口病ELISA診斷試劑盒研制與臨床應(yīng)用[J]．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，32(11)：1262-1265．

[9]呂園園，徐家麗．手足口病引起免疫學(xué)變化及實(shí)驗(yàn)室診斷[J]．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28(10)：1114-1116．

[10]Wang Y,Zou G,Xia AM,et al.Enterovirus 71 infection in children with hand,foot,and mouth disease in Shanghai,China:epidemiology,clinical feature and diagnosis[J].Virol J,2015,12(1):83.

[11]許玉玲，黃學(xué)勇，衛(wèi)海燕，等．實(shí)時(shí)熒光RT-PCR與普通RT-PCR檢測手足口病病原體的比較分析[J]．中國病原生物學(xué)雜志，2011，6(10)：736-738．

[12]Jiang B,Zhang J,You X,et al.Diagnosis of hand,foot,and mouth disease caused by EV71 and other enteroviruses by a one-step,single tube,duplex RT-PCR[J].J Med Virol,2012,84(11):1803-1808.

[13]Hwang S,Kang B,Hong J,et al.Development of duplex real-time RT-PCR based on Taqman technology for detecting simultaneously the genome of pan-enterovirus and enterovirus 71[J].J Med Virol,2013,85(7):1274-1279.

Establishment and application of dual real-time fluorescent RT-PCR method for detection of Enterovirus*

XuLianhong1,YueYulin2,ChuYing1,WangYongfang1,JiangLixin1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedWujinHospitalofJiangsuUniversity,Changzhou,Jiangsu213002,China； 2.DepartmentofClinicalLaboratory,NanjingMunicipalChildren′sHospital，Nanjing,Jiangsu210008，China)

Objective To develop a dual real-time fluorescent RT-PCR method for rapid detection of enterovirus(EV)and enterovirus type 71(EV71). Methods Specific primers and probes were designed and the dual real-time fluorescent RT-PCR reaction system was established. The quantitative standard curve was drawn; its sensitivity and precision were evaluated. Feces and throat swab specimens of 109 clinical patients with hand foot and mouth disease were collected and tested by using this method. Then the obtained results were compared with those detected by commercial EV71 PCR kit.Results The relative coefficient(2)of EV and EV71 standard curve established by the dual real-time fluorescent RT-PCR method were both 0.998. Its sensitivity reached 0.5 TCID50/mL for detecting EV and 0.05 TCID50/mL for detecting EV71. The within-run precision for detecting EV and EV71 was<3% and total precision≤4%. The results showed good specificity for the detection of enterovirus and non-enterovirus. In 109 detected clinical samples, 84 cases of EV positive samples were detected, in which 56 cases were EV71 positive with the total positive rate of 51.4%, which was consistent with the result of simple fluorescent RT-PCR commercialization kit(P=1.000).Conclusion The established dual real-time fluorescent RT-PCR method has high sensitivity and good stability, which has an important significance for early high throughput rapid diagnosis of hand foot and mouth disease.

hand foot and mouth disease; enterovirus;enterovirus71;dual real-time fluorescence RT-PCR method

?術(shù)與方法·

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.026

江蘇省武進(jìn)市科技發(fā)展計(jì)劃(WS201312)。 作者簡介：許聯(lián)紅(1981-)，碩士，主管技師，主要從事病原體分子生物學(xué)研究。

R512.5；Q93-33

A

1671-8348(2016)33-4688-03

2016-05-11

2016-07-21)