腸道菌群特征與胰島素抵抗的相關(guān)性研究

熊 青，楊學(xué)軍，任 汐，林 慧

(海南省海口市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 570208)

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腸道菌群特征與胰島素抵抗的相關(guān)性研究

熊 青，楊學(xué)軍，任 汐，林 慧

(海南省海口市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 570208)

目的 探討糖尿病前期人群腸道菌群的改變與胰島素抵抗的相關(guān)關(guān)系及腸道菌群在糖尿病前期人群糖尿病發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法 選取該院糖尿病前期人群250例，分為A組(前期干預(yù)組)和B組(前期無處理組)，糖尿病人群50例為C組(陽性對照組)，采用隊列研究隨訪干預(yù)2年，分別測定不同時期的腸道菌群情況及血液生化指標，計算胰島素抵抗指數(shù)。結(jié)果 干預(yù)前，A、B組總菌數(shù)顯著高于C組；C組腸球菌屬顯著高于A、B組；A、B組變形桿菌、乳酸桿菌含量高于C組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；C組雙歧桿菌屬高于A、B組。干預(yù)后，A組細菌總量顯著高于B 、C組，B、C兩組無差異；C組腸球菌屬顯著高于A、B組，干預(yù)后A組腸球菌屬降低，B組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；A、B組變形桿菌、乳酸桿菌含量高于C組，差異不明顯；C組雙歧桿菌屬高于A、B組，且干預(yù)后B組數(shù)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。處理前，A、B組胰島素抵抗差異無統(tǒng)計學(xué)意義，C組胰島素抵抗高于A、B組，干預(yù)后，A組胰島素抵抗降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。總菌數(shù)、腸球菌屬、雙歧桿菌屬與胰島素抵抗之間呈正相關(guān)，擬桿菌屬、變形桿菌、乳酸桿菌與胰島素抵抗的相關(guān)不顯著。結(jié)論 腸道菌群與胰島素抵抗存在相關(guān)關(guān)系，可作為糖尿病前期發(fā)展的標志，通過益生菌調(diào)節(jié)，結(jié)合量化有氧肌肉運動，可實現(xiàn)對胰島素敏感性的調(diào)整，改善糖尿病前期人群糖尿病的發(fā)展。

糖尿病前期；胰島素抵抗；腸道菌群；發(fā)生發(fā)展

我國糖尿病發(fā)病率為10%左右,成年人群中約有50.1%為糖尿病前期，如不進行有效干預(yù)，一旦進入發(fā)病階段，將對我國社會、經(jīng)濟發(fā)展造成災(zāi)難性影響[1-2]。近期研究表明，糖尿病前期當血糖水平出現(xiàn)增高時血管損害已經(jīng)發(fā)生。因此，尋找血糖變化前期的生物學(xué)標志物，是更新目前糖尿病診斷指標的一個熱點[3]。腸道菌群組成直接影響代謝、腸道食物吸收、體內(nèi)營養(yǎng)組分結(jié)構(gòu)，在2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展特別是胰島素抵抗的形成中起重要作用[4-5]。胰島素抵抗是糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵病理生理變化，其具體成因仍不詳[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，有效運動可使糖尿病前期的胰島素抵抗和葡萄糖耐量曲線逆轉(zhuǎn)至正常[7]。本研究擬探討腸道菌群的組成、動態(tài)變化特點以及與胰島素抵抗形成和發(fā)展的關(guān)系；通過益生菌對腸道菌群的改善情況，探討腸道菌群特征與胰島素抵抗的相關(guān)關(guān)系，糖尿病前期的生物學(xué)指標和干預(yù)靶點，對實現(xiàn)糖尿病前期有效控制和監(jiān)測具有重要的科學(xué)意義和極大的社會價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院就診的糖尿病前期人群250例，分為A組(糖尿病前期綜合干預(yù)組)200例；B組(糖尿病前期無特殊處理組)50例(只進行第1年的對照試驗，后轉(zhuǎn)入干預(yù)組或糖尿病組)；確診為糖尿病患者50例，病程5年以上，記為C組(陽性對照組)，采用隊列研究，隨訪干預(yù)2年。糖尿病前期納入標準：(1)空腹血糖受損(IFG)空腹血糖6.1～7.0 mmol/L；(2)糖耐量異常(IGT)OGTT試驗2 h后血糖7.8～11.1 mmol/L。2型糖尿病的診斷：根據(jù)1999年的WHO的診斷標準(1)空腹血糖大于7.0 mmol/L；(2)糖尿病癥狀加隨機靜脈血漿葡萄糖大于或等于11.1 mmol/L；(3)OGTT試驗2 h血糖大于或等于11.1 mmol/L。

排除標準:(1)1型糖尿病、特殊類型糖尿病和妊娠;(2)患有腫瘤及肝、腎等臟器嚴重損害；(3)有甲狀腺等其他內(nèi)分泌疾??；(4)近月內(nèi)服用抗生素及微生態(tài)制劑；(5)近周內(nèi)患腹瀉病或其他胃腸道疾?。?6)既往胃腸道手術(shù)史。

1.2 方法

1.2.1 隨訪 干預(yù)組集中培訓(xùn)2 d。加強干預(yù)3個月(每周培訓(xùn)1次)；隨訪2年，每3個月1次；督導(dǎo)每天至少運動30 min。運動處方：肌肉抵抗訓(xùn)練上下肢、腹部、背部肌肉，有氧變速跑動等。對照組為糖尿病前期無特殊處理組(只進行第1年的對照試驗，后轉(zhuǎn)入干預(yù)組)和糖尿病組。根據(jù)干預(yù)組的時間點采集血和大便標本。各組每天記錄：空腹和餐后2 h血糖，每2周記錄體質(zhì)量，每年進行1次葡萄糖鉗夾試驗。

1.2.2 樣本收集和檢測 試驗開始前、培訓(xùn)2周后、每3個月采集1次糞便和血液標本。糞便標本于排便后2 h內(nèi)收集在密閉的糞便儲存盒內(nèi)，于-80℃冰箱中迅速儲存，用于腸道細菌DNA的提取；血液標本于空腹采集，-80℃保存，用于血液生化的測定，并計算胰島素敏感性指數(shù)，衡量胰島素抵抗程度。

1.2.3 腸道細菌DNA的提取步驟 (1)稱取糞便樣本至離心管中，并將離心管置于冰上。向樣本中加入緩沖液，間歇振蕩1 min至樣本混勻，70 ℃孵育5 min。(2)渦旋15 s，13 000 r/min離心1 min。轉(zhuǎn)移上清液1.2 mL至新的2 mL離心管。(3)加入一個抑制劑吸附片，振蕩至吸附片徹底打開重懸。室溫孵育1 min，使吸附片能充分作用。13 000 r/min離心3 min。(4)將上一步所得上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，重復(fù)以上步驟。(5)轉(zhuǎn)移所得上清液至新的離心管，加入蛋白酶，加入緩沖液GB，渦旋15 s，70 ℃孵育10 min。(6)加入200 μL無水乙醇，渦旋混勻，將上一步所得溶液加入到一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)。(7)離心30 s后倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。(8)將吸附柱放回收集管中，離心2 min后倒掉廢液。(9)將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。(10)將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加洗脫緩沖液，室溫放置5 min，12 000 r/min離心2 min。(11)將溶液收集到離心管中。(12)為增加基因組DNA的獲得率，將離心得到的溶液再加入吸附柱中，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min。

2 結(jié) 果

2.1 3組人群細菌數(shù)量的比較 A、B組與C組比較腸道細菌總量存在差異，A、B組顯著高于C兩組(P<0.05)；擬桿菌屬各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；C組腸球菌屬顯著高于A、B組(P<0.05)；A、B組變形桿菌、乳酸桿菌屬含量高于C組，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義；雙歧桿菌屬C組高于A、B組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 干預(yù)前3組人群腸道菌群數(shù)量的比較±s)

2.2 干預(yù)后3組人群腸道菌群數(shù)量比較 A組與B、C組比較腸道細菌總量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，A組顯著高于B 、C兩組(P<0.05)，B、C兩組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義；擬桿菌屬各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；C組腸球菌屬顯著高于A、B組，干預(yù)后A組腸球菌屬數(shù)量降低，B組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；變形桿菌、乳酸桿菌屬含量A、B組高于C組，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；雙歧桿菌屬C組高于A、B組，且干預(yù)后B組數(shù)量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 干預(yù)后3組人群腸道菌群數(shù)量比較±s)

*：P<0.05，與其他兩組比較。

2.3 各組人群干預(yù)前后胰島素抵抗(HOMA-IR)水平比較 處理前，A、B兩組胰島素抵抗水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，C組胰島素抵抗水平高于糖尿病前期人群組，干預(yù)后，A組胰島素抵抗水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而B組未進行處理，其胰島素抵抗平均水平升高，有向糖尿病發(fā)展的趨勢，而糖尿病患者組進行合理的處理后，其胰島素抵抗水平呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組胰島素抵抗程度的比較±s)

2.4 腸道菌群與胰島素抵抗的相關(guān)關(guān)系 總菌數(shù)、腸球菌屬、雙歧桿菌屬與胰島素抵抗水平之間呈正相關(guān)，而擬桿菌屬、變形桿菌、乳酸桿菌與胰島素抵抗水平的相關(guān)關(guān)系不顯著，見表4。

表4 腸道菌群與胰島素抵抗的相關(guān)關(guān)系

3 討 論

2004年首次通過腸道糞便替換實驗發(fā)現(xiàn)，抵抗高脂飲食致肥胖和胰島素抵抗的無菌小鼠接受普通小鼠糞便后14 d形成胰島素抵抗[8]。TLR5基因缺失代謝綜合征小鼠的糞便使野生型小鼠發(fā)生類似表現(xiàn)。 胰島素抵抗形成同時與細菌引起的炎癥有關(guān)[9]。Cani等[9]使用氨芐西林和新霉素，減少腸道內(nèi)毒素吸收入血，成功阻止糖尿病前期的發(fā)展。這些證據(jù)充分表明，調(diào)整腸道菌群既能減輕炎癥，亦能提高胰島素敏感性[10]。另外，高脂飲食能使腸道細菌進入血液和組織分布，造成胰島素抵抗[11]。腸道菌群作為生物學(xué)標志物，可以預(yù)測糖尿病發(fā)生和心血管疾病的風險，大量研究(主要在動物模型中)表明腸道菌群可能通過系統(tǒng)性炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)宿主能量代謝。調(diào)節(jié)腸源性激素如腸源性肽、胰高血糖素樣肽的分泌等多種機制參與肥胖、糖尿病的發(fā)生、發(fā)展[12]。隨后證實其作為新的靶點，可成為預(yù)防和治療糖尿病的希望，本研究選取的研究對象為存在胰島素抵抗，血糖水平正?；蜓撬疆惓５珔s還達不到糖尿病診斷標準的人群，即糖尿病前期人群。對人群進行為期2年的隨訪，監(jiān)測胰島素抵抗逐漸從糖尿病前期到典型糖尿病演化的整個過程，同時對相關(guān)代謝和腸道細菌集落的組成改變進行觀察和動態(tài)檢測。結(jié)合以空腹、餐后血糖，糖化血紅蛋白水平和胰島素抵抗為指標，對該人群與典型糖尿病人群腸道細菌和血代謝組學(xué)進行對比觀察，篩選對糖尿病前期發(fā)展趨勢和演變規(guī)律有重大影響，并可作為預(yù)測預(yù)后、提示干預(yù)靶點的生物學(xué)標志意義突出，并充分體現(xiàn)個體化、動態(tài)化特點。

本研究結(jié)果表明，(1)糖尿病人群與糖尿病前期人群腸道菌群差異有統(tǒng)計學(xué)意義；(2)進行干預(yù)后，糖尿病前期人群腸道菌群會有所改善；(3)符合糖尿病前期診斷標準的人群，任由其發(fā)展，具有發(fā)生發(fā)展為糖尿病的趨勢；其腸道菌群特征與糖尿病患者類似；(4)糖尿病前期人群某些腸道菌群與胰島素抵抗水平之間存在正相關(guān)關(guān)系，某些菌屬在糖尿病患者與糖尿病前期人群中差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，也可為臨床糖尿病患者腸道菌群調(diào)節(jié)提供依據(jù)。然而，目前糖尿病前期判斷主要取決于空腹和餐后血糖異常，以胰島素抵抗和胰島素分泌亢進為主要表現(xiàn)。腸道菌群能夠改變腸道糖異生、糖對門靜脈壁的刺激，通過腸腦調(diào)節(jié)環(huán)路改變胰島素的敏感性[13]，亦有文獻報道C梭形芽孢桿菌通過與相應(yīng)宿主遺傳性變異增加糖尿病易感性[14]。

綜上所述，本研究通過糖尿病前期人群的隨訪，并對人群樣本進行臨床試驗，對腸道細菌進行DNA測序，分析基因組數(shù)據(jù),獲取腸道細菌集落組成和動態(tài)變化特點等信息。探討了腸道菌群變化與胰島素抵抗水平的關(guān)系，使其作為糖尿病前期的生物學(xué)標志和干預(yù)靶點，實現(xiàn)糖尿病前期有效控制和監(jiān)測。同時，通過精確指導(dǎo)下的益生菌調(diào)節(jié)，實現(xiàn)了對糖尿病前期胰島素敏感性的調(diào)整，對臨床治療和干預(yù)提供理論依據(jù)。

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Study on correlation between intestinal flora characteristic and insulin resistance

XiongQing,YangXuejun,RenXi,LinHui

(DepartmentofEndocrinology,HailouMunicipalPeople′sHospital,Haikou,Hainan570208,China)

Objective To explore the correlation between the change of intestinal flora and insulin resistance in pre-diabetes population,and the role of intestinal flora in the occurrence and development in the pre-diabetes population.Methods two hundreds and fifty cases of pre-diabetes in our hospital were selected and divided into the group A(pre-diabetes intervention group)and B(pre-diabetes non-treatment group).Fifty cases of diabetes(positive control group)served as the group C.The cohort study was adopted.The follow-up intervention lasted for two years.The intestinal flora and blood biochemical indicators were detected in different groups and at different time periods.The insulin resistance index was calculated.Results The total bacterial count before intervention in the group A and B was significantly higher than that in the group C;Enterococcus genus in the group C was significantly higher than that in the group A and B;the proteus and lactobacillus content in the group A and B was higher than that in the group C,but the difference was not significant;Bifidobacterium genus in the group C was higher than that in the group A and B.After intervention,the total bacterial amount in the group A was significantly higher than the group B and C,but there was no statistical difference between the group B and C;enterococcus genus in the group C was significantly higher than that in the group A and B,enterococcus genus after intervention in the group A was reduced and which in the group B was increased,the difference had statistical significance;the proteus and lactobacillus content in the group A and B was higher than that in the group C,but the difference was not significant;bifidobacterium genus in the group C was higher than that in the group A and B,moreover which after intervention in the group B was increased,the difference was statistically significant.The insulin resistance before processing had no statistical difference between the groups A and B,which in the group C was higher than the group A and B,the insulin resistance after intervention in the group A was decreased,the difference was statistically significant.The total bacterial count,enterococcus and bifidobacterium were positively correlated with insulin resistance,and bacteroides,proteus and lactobacillus had no significant correlation with insulin resistance.Conclusion Intestinal flora has correlation with insulin resistance,and serves as a marker of pre-diabetes development,implementing the probiotics adjustment combined the quantization aerobic muscular movement can realize the adjustment of insulin sensitivity and improves the diabetic development in the prediabetic population.

pre-diabetes;insulin resistance;intestinal flora;occurrence and development

熊青(1983-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事早期糖尿病的胰島素功能及腸道菌群研究。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.016

R587

A

1671-8348(2016)33-4658-03

2016-04-06

2016-06-19)