Apelin對(duì)葡萄糖的毒性作用及對(duì)胰島細(xì)胞PDX-1表達(dá)的影響*

黃炫賡，黎英榮 ，鄭曉菲，潘海林，蘇宏業(yè)，夏 寧，肖常青

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝病科,南寧 530007)

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Apelin對(duì)葡萄糖的毒性作用及對(duì)胰島細(xì)胞PDX-1表達(dá)的影響*

黃炫賡，黎英榮△，鄭曉菲，潘海林，蘇宏業(yè)，夏 寧，肖常青

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝病科,南寧 530007)

目的 探討Apelin對(duì)葡萄糖毒性作用及對(duì)胰島細(xì)胞胰十二指腸同源盒蛋白-1(PDX-1)表達(dá)的影響。方法 在不同葡萄糖濃度下(正糖組5.6 mmol/L，高糖組16.7 mmol/L，極高糖組33.3 mmol/L)，+/- Apelin-36培養(yǎng)胰島β細(xì)胞株NIT-1細(xì)胞3 d，然后測(cè)定基礎(chǔ)和葡萄糖刺激后胰島細(xì)胞胰島素分泌量，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)胰島素含量和PDX-1蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果 與正糖組比較，高糖組和極高糖組的基礎(chǔ)和葡萄糖刺激后胰島素分泌、細(xì)胞內(nèi)胰島素均明顯減少，PDX-1蛋白表達(dá)下降(P<0.05)；與未加Apelin組比較，加Apelin高糖組和極高糖組的基礎(chǔ)和葡萄糖刺激后胰島素分泌、細(xì)胞內(nèi)胰島素明顯減少，PDX-1蛋白表達(dá)下降(P<0.05)；6組胰島細(xì)胞的胰島素水平與PDX-1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，與PDX-1 mRNA表達(dá)無關(guān)。結(jié)論 Apelin可能通過降低PDX-1蛋白表達(dá)參與葡萄糖毒性作用，引起胰島素分泌減少，從而在糖尿病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。

Apelin；胰十二指腸同源盒蛋白-1；葡萄糖毒性

Apelin是一種孤兒G蛋白耦聯(lián)受體——血管緊張素受體AT1相關(guān)的受體蛋白的天然配體，由Tatemoto等[1]使用反向藥理學(xué)的方法從牛胃分泌物中提取得到。近年來Apelin成為糖尿病領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者血Apelin升高[2-4]。Apelin參與糖尿病的發(fā)病機(jī)制，與胰島素抵抗關(guān)系密切[4-6]，但具體機(jī)制尚未闡明。本課題組的臨床研究[7]發(fā)現(xiàn)肥胖引起血清Apelin升高，糖尿病可以導(dǎo)致肥胖患者的Apelin進(jìn)一步升高。本課題組的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[8]觀察到Apelin-36靜脈注射進(jìn)入大鼠體內(nèi)后可以降低大鼠高血糖時(shí)的胰島素水平，提示Apelin可能與葡萄糖毒性作用有關(guān)。肖常青等[9]的研究發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖通過降低胰十二指腸同源盒蛋白-1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)的蛋白表達(dá)而抑制胰島素的分泌，認(rèn)為高濃度葡萄糖對(duì)PDX-1蛋白表達(dá)的抑制是葡萄糖毒性作用的機(jī)制之一。Apelin是否通過抑制PDX-1蛋白表達(dá)，參與葡萄糖毒性機(jī)制而在糖尿病的發(fā)病中發(fā)揮作用呢？本課題組擬通過培養(yǎng)小鼠NIT-1細(xì)胞，將Apelin-36和不同濃度的葡萄糖加入培養(yǎng)液，檢測(cè)基礎(chǔ)和葡萄糖刺激的胰島素釋放、細(xì)胞內(nèi)胰島素含量、PDX-1蛋白及mRNA的表達(dá)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本試驗(yàn)選用胰島β細(xì)胞株NIT-1細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，按培養(yǎng)液所含葡萄糖濃度的不同及是否加用Apelin分為6組：(1)未加Apelin正糖組(葡萄糖濃度為5.6 mmol/L)；(2)加Apelin正糖組(葡萄糖濃度為5.6 mmol/L)；(3)未加Apelin高糖組(葡萄糖濃度為16.7 mmol/L)；(4)加Apelin高糖組(葡萄糖濃度為16.7 mmol/L)；(5)未加Apelin極高糖組(葡萄糖濃度為33.3 mmol/L)；(6)加Apelin極高糖組(葡萄糖濃度為33.3 mmol/L)。Apelin-36和胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自美國TSZ公司， PDX -1多克隆抗體、S-P免疫組化試劑盒、PDX-1原位雜交試劑盒購自上海諾淵生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基礎(chǔ)和葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗(yàn) 分別收集各組胰島細(xì)胞至1 mL離心管(每管1×106個(gè)細(xì)胞)，分批預(yù)孵育于HBSS液，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌2次后，在含5.6 mmol/L葡萄糖的HBSS緩沖液中37 ℃ 預(yù)孵育1 h，棄去緩沖液，然后將細(xì)胞置于含5.6 mmol/L葡萄糖(基礎(chǔ))和16.7 mmol/L葡萄糖(葡萄糖刺激)的HBSS緩沖液1 mL中37 ℃孵育1 h，收集反應(yīng)液，然后用ELISA法測(cè)定胰島素含量。

1.2.2 細(xì)胞內(nèi)胰島素含量測(cè)定 收集各組培養(yǎng)的小鼠NIT-1細(xì)胞至1 mL離心管(每管1×106個(gè)細(xì)胞)，進(jìn)行反復(fù)的冷凍、溶解、破碎然后以酸化乙醇溶液進(jìn)行抽提，4 ℃ 孵育16～24 h，用ELISA法測(cè)定胰島素含量。

1.2.3 PDX-1蛋白的表達(dá) 收集各組NIT-1細(xì)胞進(jìn)行涂片，用4%的多聚甲醛溶液固定20 min，用PBS沖洗3次，每次3 min，按照S/P免疫組化試劑盒的說明書進(jìn)行操作。在顯微鏡下計(jì)算各組細(xì)胞的陽性率。

1.2.4 PDX-1 mRNA的表達(dá) 取各組新鮮的小鼠NIT細(xì)胞涂片,用4%多聚甲醛/0.1%DEPC/0.1 mmol/L PBS(pH 7.2～7.6)固定20～30 min,按照PDX-1原位雜交試劑盒的說明書進(jìn)行操作,在顯微鏡下計(jì)算各組細(xì)胞的陽性率。

2 結(jié) 果

2.1 各組胰島細(xì)胞基礎(chǔ)和葡萄糖刺激后胰島素分泌、細(xì)胞內(nèi)胰島素的比較 (1)與正糖組比較，高糖組和極高糖組的基礎(chǔ)和葡萄糖刺激后胰島素、細(xì)胞內(nèi)胰島素分泌均明顯減少(P<0.05)；(2)與未加Apelin組相比，加Apelin的高糖組和極高糖組的胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素在基礎(chǔ)和葡萄糖刺激后分泌明顯下降(P<0.05)，見表1。

表1 各組胰島素分泌的比較±s)

☆：P<0.05，與未加Apelin正糖組相比。★：P<0.05，與加Apelin 正糖組相比；▲：P<0.05，與未加Apelin高糖組相比。△：P<0.05，與未加Apelin極高糖組相比。

2.2 各組PDX-1蛋白及PDX-1 mRNA表達(dá) (1)與正糖組比較，高糖組和極高糖組的PDX-1蛋白表達(dá)下降(P<0.05)；(2)與未加Apelin組相比，加Apelin的高糖組和極高糖組的PDX-1蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)；(3)各組間PDX-1 mRNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組PDX-1蛋白及PDX-1 mRNA表達(dá)比較

☆：P<0.05,與未加Apelin正糖組相比?！铮篜<0.05,與加Apelin正糖組相比；▲：P<0.05，與未加Apelin高糖組相比?！鳎篜<0.05，與未加Apelin極高糖組相比。

6組細(xì)胞均出自同一批胰島β細(xì)胞株NIT-1細(xì)胞，相同的培養(yǎng)條件，經(jīng)Spearman分析發(fā)現(xiàn)：胰島β細(xì)胞的胰島素分泌量及細(xì)胞內(nèi)含量均與PDX-1蛋白水平呈顯著正相關(guān)，但與PDX-1 mRNA無相關(guān)性，見表3。

表3 PDX-1與胰島素的相關(guān)分析

△：P<0.05。

3 討 論

目前全世界糖尿病患病率越來越高[10-11]，但糖尿病發(fā)病和進(jìn)行性加重的原因遠(yuǎn)未闡明。張艷玲等[12]發(fā)現(xiàn)高糖對(duì)胰島β細(xì)胞有慢性毒性作用。Lombardi等[13]的研究則證實(shí)，高糖培養(yǎng)后胰島β細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致PDX-1、葡萄糖傳運(yùn)子-2 mRNA水平下降，結(jié)果胰島β細(xì)胞的葡萄糖刺激的胰島素分泌減退。Harmon等[14]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZDF糖尿病鼠長期高血糖可以顯著抑制PDX-1基因及胰島素基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制與胰島素基因啟動(dòng)子結(jié)合的PDX-1蛋白的表達(dá)，引起胰島素釋放減少，提示葡萄糖毒性作用的發(fā)生與長期高血糖所致的PDX-1蛋白表達(dá)下降有關(guān)。肖常青等[9]的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖通過降低PDX-1的蛋白表達(dá)而抑制胰島素的分泌。本研究發(fā)現(xiàn)：胰島β細(xì)胞的胰島素分泌量及細(xì)胞內(nèi)含量均與PDX-1蛋白水平呈顯著正相關(guān)；與正糖組比較，高糖組和極高糖組的PDX-1蛋白表達(dá)均明顯下降，其基礎(chǔ)和刺激后胰島素分泌、細(xì)胞內(nèi)胰島素含量也明顯減少。上述體內(nèi)外試驗(yàn)均提示葡萄糖毒性作用的發(fā)生機(jī)制可能為：高血糖降低PDX-1蛋白表達(dá)，減少胰島素的釋放，從而進(jìn)一步加重高血糖，引起惡性循環(huán)。

多項(xiàng)研究提示Apelin能抑制胰島素的釋放。S?rhede等[15]觀察到Apelin-36可以使肥胖C57BL/6J大鼠模型靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn)快速相(1～5 min)的胰島素釋放減低35%。本課題組的研究[8]通過高脂飲食及STZ腹腔注射建立肥胖糖尿病大鼠的模型，然后進(jìn)行靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)肥胖糖尿病組大鼠注射Apelin-36后，胰島素曲線下面積減少38.1%。上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示Apelin在高糖的條件下可以抑制胰島素的分泌，進(jìn)而參與葡萄糖毒性作用。本研究發(fā)現(xiàn)加Apelin的高糖組和極高糖組的基礎(chǔ)和葡萄糖刺激后胰島素分泌、細(xì)胞內(nèi)胰島素含量較未加Apelin組明顯下降，而在正糖組加與未加Apelin上述指標(biāo)無明顯差異，證實(shí)Apelin在高糖條件下抑制胰島素的分泌，參與了葡萄糖毒性作用，這與S?rhede等[15]的研究結(jié)果相似：Apelin抑制葡萄糖濃度為16.7 mmol/L的胰島素釋放，而葡萄糖濃度為2.8或8.3 mmol/L時(shí)，Apelin對(duì)胰島素釋放無影響。綜合上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞學(xué)研究的結(jié)果，說明Apelin在高糖條件下可以抑制胰島素的釋放，可能參與葡萄糖毒性作用。

Apelin參與葡萄糖毒性作用是否通過PDX-1的蛋白表達(dá)減低這一途徑呢？本課題研究結(jié)果為：加Apelin的正糖組與未加Apelin正糖組相比，PDX-1蛋白表達(dá)無明顯差異，血糖正常時(shí)Apelin對(duì)PDX-1蛋白表達(dá)無影響；與未加Apelin組相比，加Apelin的高糖組和極高糖組的PDX-1蛋白表達(dá)明顯下降，提示Apelin參與葡萄糖毒性作用可能通過PDX-1的蛋白表達(dá)減低這一途徑。

綜上所述，Apelin可能通過降低PDX-1蛋白表達(dá)，參與葡萄糖毒性作用，引起胰島素分泌減少，對(duì)其進(jìn)行更深入的研究將為揭示糖尿病的發(fā)病機(jī)制提供更多的依據(jù)。

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Effects of Apelin on glucose toxicity and islet cells PDX-1 expression*

HuangXuangeng,LiYingrong△,ZhengXiaofei,PanHailin,SuHongye,XiaNing，XiaoChangqing

(DepartmentofEndocrinologyandMetabolismDiseases,FirstAffiliatedHospital，GuangxiMedicalUniversity，Nanning,Guangxi530007，China)

Objective To study the effects of Apelin on glucose toxicity and islet cells PDX-1 protein expression.Methods The islet β cell line NIT-1 cells were incubated in the medium containing different glucose concentrations(normal glucose concentration group 5.6 mmol/L,high glucose concentration group 16.7 mmol/L,extremely high glucose concentration group 33.3 mmol/L)and +/- Apelin-36 respectively for 3 d.Then the basic insulin secretion amount of islet cells and their secretion amount after glucose stimulation were detected.The intracellular insulin content and the PDX-1 protein and mRNA expression were detected．Results Compared with the normal glucose group,the basic insulin secretion,secretion after stimulation and intracellular insulin in the high glucose group and extremely high glucose group were significantly decreased and PDX-1 protein expression was declined(P<0.05);compared with non-adding Apelin group,the basic insulin secretion,secretion after stimulation and intracellular insulin in the adding Apelin high glucose group and extremely high glucose group were significantly decreased and PDX-1 protein expression was decreased(P<0.05);the insulin level in islet cells of 6 groups was positively correlated with PDX-1 protein expression and had no correlation with PDX-1 mRNA expression.Conclusion Apelin may participate in the glucose toxic effect by decreasing PDX-1 protein expression,causes the decrease of insulin secretion,thus plays a role in the pathogenesis of diabetes.

Apelin;pancreatic duodenal homeobox-1;glucose toxicity

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.008

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳重點(diǎn)課題(桂衛(wèi)重2010024)。 作者簡介：黃炫賡(1980-)，本科，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的研究工作?！?/p>

R587.1

A

1671-8348(2016)33-4633-03

2016-02-23

2016-06-11)