分光光度法檢測酶促反應(yīng)中底物的量

周 彥 品， 王 金 輝， 李 瑞 龍， 陳 瑞 華， 俞 志 敏， 趙 長 新

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

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分光光度法檢測酶促反應(yīng)中底物的量

周 彥 品， 王 金 輝， 李 瑞 龍， 陳 瑞 華， 俞 志 敏， 趙 長 新

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

基于酶與底物結(jié)合出現(xiàn)游離氨基酸增多的現(xiàn)象建立了檢測酶促反應(yīng)底物存在的新方法。以蔗糖酶與α-淀粉酶為研究對象，采用茚三酮比色法考察了反應(yīng)溫度、pH、酶濃度等因素對因反應(yīng)造成游離氨基酸量的影響。結(jié)果表明，在50 ℃、pH=8、0.1%的蔗糖酶條件下，因反應(yīng)變化的游離氨基酸的量與蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.02%～0.08%呈線性關(guān)系，方法檢出限為37.07 μg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.75%～5.11%，方法加標(biāo)回收率為96.32%～101.31%。α-淀粉酶有相似的結(jié)果，方法檢出限、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、加標(biāo)回收率分別為1.317 mg/mL、2.79%～5.88%、92.82%～100.86%。

游離氨基酸；底物檢測；蔗糖酶；α-淀粉酶

0 引 言

酶檢測法特異性較強，常用于結(jié)構(gòu)分析與化學(xué)性質(zhì)的鑒定，該法無須復(fù)雜的預(yù)處理，檢測速度較快[1]。黃文風(fēng)等[2]利用農(nóng)藥抑制乙酰膽堿酯酶(AchE)活性影響產(chǎn)物復(fù)合物的吸光度原理來測定農(nóng)藥的殘留量；夏曉東等[3]利用葡萄糖氧化酶與葡萄糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2量間接檢測葡萄糖的存在。以前利用酶檢測微量物質(zhì)的方法，均是通過檢測酶促反應(yīng)產(chǎn)物絡(luò)合物的量間接檢測底物的存在，步驟煩瑣，精密度以及準(zhǔn)確度難以保證[4]。

酶與底物結(jié)合后，反應(yīng)液出現(xiàn)游離氨基酸增多的現(xiàn)象，且加入底物的量與反應(yīng)液中游離氨基酸的量成正比，因此通過檢測游離氨基酸的量來表征底物的量，此方法專一性強，靈敏度高。蔗糖酶α-淀粉酶、糖化酶、己糖激酶均有此特性。檢測產(chǎn)生游離氨基酸的方法較多，其中茚三酮比色法[5]相對于熒光胺法[6]、異硫氰酸苯酯(PTTC)法[7]、異硫氰酸熒光素(FITC)法[8]、鄰苯二甲醛法[9]具有快速、靈敏、經(jīng)濟等特點。利用酶與底物結(jié)合后的特性，建立一種分光光度法檢測底物的新方法，可便捷地檢測底物的含量。

1 材料與方法

1.1 主要材料

蔗糖酶、α-淀粉酶、可溶性淀粉、蔗糖、DL-蘋果酸、NaH2PO4、NaCl、Na2HPO4。實驗用水為雙蒸水。

1.2 方 法

1.2.1 溶液的配制

蔗糖酶溶液的配制：取一定的蔗糖酶溶于pH為6.9的0.02 mol/L的PBS緩沖液，分別配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%～0.3%的蔗糖酶溶液。

蔗糖溶液的配制：取一定的蔗糖分別溶于不同pH的0.02 mol/L的PBS緩沖液中，分別制成相應(yīng)pH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的蔗糖溶液以及pH 8.0的0.02%～0.08%的蔗糖溶液。

茚三酮溶液的配制：稱取0.5 g茚三酮溶于終體積為100 mL水中得到5 g/L的茚三酮水溶液，保存于棕色瓶中。

1.2.2 酶促反應(yīng)生成游離氨基酸的測定

比色管中分別加入1 mL蔗糖酶溶液與1.5 mL 蔗糖溶液，反應(yīng)完全后，加入1 mL 5 g/L的茚三酮溶液，在95 ℃下水浴30 min，避光冷卻1 h，在570 nm波長下用分光光度計測定其吸光度。以PBS緩沖液代替蔗糖溶液作空白對照。

1.2.3 溫度對游離氨基酸量的影響

將1 mL 0.02%的蔗糖酶溶液與1.5 mL pH為6.9的8%蔗糖溶液分別在40、45、50、55、60、65、70 ℃預(yù)熱1 min，每組3個平行，反應(yīng)2 min，測定不同溫度對反應(yīng)液中游離氨基酸的影響。

1.2.4 pH對游離氨基酸量的影響

取pH分別為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的8%蔗糖溶液與0.02%的蔗糖溶液，在50 ℃下反應(yīng)2 min，在570 nm波長下測定各組反應(yīng)液吸光度。

1.2.5 蔗糖酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對游離氨基酸量的影響

將0.04%～0.3%的蔗糖酶溶液分別與1.5 mL pH為8的0.25%蔗糖溶液，在50 ℃下反應(yīng)2 min，在570 nm波長下測定其吸光度。

1.2.6 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對游離氨基酸量的影響

測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%～0.08%，pH為8的蔗糖溶液，在0.1%蔗糖酶50 ℃下反應(yīng)3 min，對反應(yīng)液中游離氨基酸的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 游離氨基酸的測定結(jié)果

分別取0.1%的蔗糖酶、0.08%的蔗糖、0.2% 的α-淀粉酶、0.6%的淀粉溶液，按圖1中的分組反應(yīng)，測定游離氨基酸的量。

圖1 不同酶促反應(yīng)液中游離氨基酸的量

從圖1可以看出，蔗糖酶、蔗糖、α-淀粉酶、淀粉溶液的4種反應(yīng)液中游離氨基酸的量非常少，而酶與底物反應(yīng)后反應(yīng)液中游離氨基酸的量明顯增多。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能由于酶分子在酶促反應(yīng)過程中的構(gòu)象向有利于酶促反應(yīng)發(fā)生的方向變構(gòu)，在變構(gòu)過程中，由于蛋白質(zhì)的N端和C端具有較大的柔性，使得肽鏈上的氨基酸在酶分子翻轉(zhuǎn)過程中脫落下來[10-11]。而氨基酸脫落的原因也可能與酶的半衰期有關(guān)。酶上氨基酸的脫落有利于調(diào)節(jié)酶在體內(nèi)的半衰期，如王鏡巖等[12]提到，生物體內(nèi)半衰期較短的酶都處于重要的代謝控制部位。但對于出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原理還有待進一步的探究。

2.2 反應(yīng)溫度

如圖2所示，隨著溫度的升高，蔗糖酶反應(yīng)液的吸光度隨溫度的增加先緩慢增加，達到一定值后逐漸降低，因此選擇50 ℃為蔗糖酶酶促反應(yīng)的最佳溫度。這種現(xiàn)象的原因可能有兩方面：一是溫度升高可以加快分子運動速率，提高分子碰撞概率，從而使反應(yīng)速率加快，同時提高游離氨基酸的增加程度；另一方面，溫度升高可以使酶蛋白逐漸變性失活，從而降低酶促反應(yīng)速率[13]。溫度對酶促反應(yīng)速率的影響是這兩方面作用的綜合結(jié)果。

圖2 溫度對游離氨基酸量的影響

2.3 pH

如圖3所示，隨著蔗糖溶液pH的增大，反應(yīng)液的吸光度先逐漸增大后逐漸減小，出現(xiàn)最大值，此吸光度對應(yīng)最適pH為8。

圖3 pH對游離氨基酸量的影響

底物pH的選擇基于多方面綜合考慮:一，pH影響酶促反應(yīng)。酶促反應(yīng)速率受環(huán)境pH的影響，其會影響底物分子的解離狀態(tài)，從而影響酶與底物的結(jié)合；pH也會影響酶分子的解離狀態(tài)，特別是酶活性中心有關(guān)基團的解離，或者是維持酶的空間結(jié)構(gòu)的有關(guān)基團的解離，從而影響酶與底物的結(jié)合；pH可能影響中間復(fù)合物的解離狀態(tài)，影響中間復(fù)合物分解產(chǎn)生產(chǎn)物；過高或者過低的pH條件甚至?xí)?dǎo)致酶蛋白變性而失活[14-15]。二，pH影響茚三酮顯色反應(yīng)。茚三酮顯色反應(yīng)也受環(huán)境pH的影響，當(dāng)pH在4以下時不顯色，而pH在6～10時，顏色變化明顯[16]。三，pH對游離氨基酸量的影響。游離氨基酸的來源可能是由于酶分子電荷失衡導(dǎo)致氨基酸脫落，體系的pH對酶分子電荷有影響。

2.4 蔗糖酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)

不同蔗糖酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)下茚三酮反應(yīng)液的吸光值變化如圖4所示。從圖4可以看出，隨著蔗糖酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，反應(yīng)液的吸光度也逐漸增加，但增長率逐漸降低，考慮到蔗糖酶成本、分光光度計的檢測范圍以及吸光度增長率等因素，可選擇酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.08%～0.20%，本實驗中選擇0.1% 為酶促反應(yīng)條件。

圖4 蔗糖酶溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對游離氨基酸量的影響

Fig.4 The effects of sucrose enzyme concentrations on the amounts of free amino acids

當(dāng)酶促反應(yīng)體系的溫度、pH不變、底物過量時，酶量與酶促反應(yīng)的速度成正比關(guān)系，在底物過量的情況下，酶量越大，則生成的中間產(chǎn)物越多，反應(yīng)速度也就越快。如果反應(yīng)體系中底物不足，酶過量也不會加大酶促反應(yīng)的速度[17]。在2min內(nèi)0.02%的蔗糖酶對0.25%的蔗糖是過量的，因此在此基礎(chǔ)上，隨著酶濃度的增加，酶促反應(yīng)的速率也不會增加，因此隨著酶量的增加反應(yīng)液的吸光度增長率也不會增加。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

0.1%的蔗糖酶分別與pH為8不同濃度梯度的蔗糖溶液，在50 ℃溫度下反應(yīng)3min，測定不同濃度蔗糖溶液對應(yīng)茚三酮反應(yīng)液吸光度變化。結(jié)果表明，蔗糖溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.02%～0.08% 與其吸光度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y=351.67x+0.021 7(R2=0.999 7)。

2.6 方法檢出限的測定

以蔗糖酶為例，用相應(yīng)緩沖液代替底物標(biāo)準(zhǔn)液，以酶、茚三酮與緩沖液混合溶液作參比測定吸光度，平行測定11次，計算空白液的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb=0.004 346，根據(jù)工作曲線斜率，計算出檢出限C=37.07μg/mL。經(jīng)計算，檢測淀粉的方法檢出限為1 317μg/mL。

2.7 精密度試驗

以蔗糖酶為例，吸取3組不同濃度的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液測定吸光度。平行測定5次，得出S在0.094 5%～0.003 5%，RSD在1.75%～5.11%，而α-淀粉酶RSD在2.79%～5.88%，說明精密度良好。

2.8 干擾因素的測定

將蔗糖酶與除蔗糖以外的其他溶液，如DL-蘋果酸溶液、淀粉溶液混合，在相同條件下進行測定，未出現(xiàn)吸光度的變化，表明由于酶的專一性，除底物之外的物質(zhì)對測定并不產(chǎn)生干擾。

2.9 實際樣品分析

稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%、0.07%、0.08%的蔗糖溶液，在已確定的最佳反應(yīng)條件下進行酶促反應(yīng)，測定反應(yīng)液中的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對應(yīng)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并作樣品加標(biāo)回收率測定，結(jié)果見表1。如表1所示，加標(biāo)回收率在96.32%～101.31%，而α-淀粉酶加標(biāo)回收率在95.95%～100.40%。說明此方法的系統(tǒng)誤差小，重現(xiàn)性好。

表1 蔗糖酶的驗證性實驗(n=5)

3 結(jié) 論

用分光光度法建立酶促反應(yīng)檢測底物含量的方法。以蔗糖酶為例，該方法的線性回歸方程為y=351.67x+0.021 7(R2=0.999 7)，方法檢出限為37.07 μg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2%～6%，加標(biāo)回收率為96.32%～101.31%。淀粉酶同樣有此現(xiàn)象，方法檢出限、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、加標(biāo)回收率分別為1 317 μg/mL、2.79%～5.88%、95.95%～100.40%。說明此方法系統(tǒng)誤差小，測定數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，操作簡便。

蔗糖酶、α-淀粉酶、糖化酶與己糖激酶均出現(xiàn)酶遇底物游離氨基酸增加的現(xiàn)象，由此推測此方法可能適用于大部分專一性的酶，根據(jù)此原理建立了一種利用酶促反應(yīng)檢測底物的新方法。

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Spectrophotometry method to detect the substrate of enzymatic reaction

ZHOU Yanpin, WANG Jinhui, LI Ruilong, CHEN Ruihua, YU Zhimin, ZHAO Changxin

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

A new method for determination of enzymatic reaction substrates based on the phenomenon that free amino acids increased in the process of enzyme and substrate mixture was proposed. The effects of reaction temperature, pH, enzyme concentration on the free amino acids were investigated using invertase and α-amylase as the research object by ninhydrin colorimetry. Results showed that a good linearity between the amount of free amino acids and sucrose concentration was observed within the range of the sucrose mass fraction of 0.02%-0.08% with the linear equation in the optimum conditions of 50 ℃, pH=8 and 0.1% invertase. The detection limit was 37.07 μg/mL and the relative standard deviation was 1.75%-5.11%, while the method of standard addition recoveries were 96.32%-101.31%. The result of α-amylase was similar with invertase, of which the method detection limit, relative standard deviation and standard addition recovery rate were 1.317 mg/mL, 2.79%-5.88% and 92.82%-100.86%, respectively.

free amino acids; detection of substrate; invertase; α-amylase

2015-03-31.

國家自然科學(xué)基金資助項目(31401681).

周彥品(1990-)，女，碩士研究生；通信作者：趙長新(1955-)，男，教授.

Q55

A

1674-1404(2016)06-0433-04

ZHOU Yanpin, WANG Jinhui, LI Ruilong, CHEN Ruihua, YU Zhimin, ZHAO Changxin. Spectrophotometry method to detect the substrate of enzymatic reaction[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(6): 433-436.