神經(jīng)毒素基因RjAa17f在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)及活性分析

孟 姣，于 歡，周 斌，王 敦

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植保資源利用與病蟲(chóng)害治理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

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神經(jīng)毒素基因RjAa17f在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)及活性分析

孟 姣，于 歡，周 斌，王 敦

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植保資源利用與病蟲(chóng)害治理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

【目的】 在昆蟲(chóng)草地貪夜蛾細(xì)胞(Sf9)中表達(dá)一種能專一阻斷昆蟲(chóng)鈉、鉀離子通道的神經(jīng)毒素基因RjAa17f?！痉椒ā?運(yùn)用桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)RjAa17f毒蛋白，并用蛋白質(zhì)印跡對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)；測(cè)定RjAa17f毒蛋白引起健康棉鈴蟲(chóng)中腸膜電位的變化，并對(duì)其毒力進(jìn)行測(cè)定。【結(jié)果】 通過(guò)重組桿狀病毒質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和Western blot檢測(cè)驗(yàn)證，神經(jīng)毒素基因RjAa17f的重組Bacmid已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞中，且在Sf9中表達(dá)出與預(yù)測(cè)大小一致的RjAa17f目的蛋白；此毒蛋白作用于棉鈴蟲(chóng)中腸3～12 h后，中腸膜電位與CK相比差異顯著，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，棉鈴蟲(chóng)中腸膜電位呈逐步升高的趨勢(shì)，作用9 h以后，升高的幅度逐漸降低，趨于平緩。RjAa17f毒蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)的LD50為108.12 μg/g。【結(jié)論】 在Sf9細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出了有活性的RjAa17f毒蛋白，且該毒蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)中腸膜電位有顯著改變。

棉鈴蟲(chóng)；神經(jīng)毒素基因RjAa17f；Sf9；RjAa17f毒蛋白；桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)

棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒早在1973年已經(jīng)在美國(guó)環(huán)保局的批準(zhǔn)下成為第一個(gè)注冊(cè)登記的桿狀病毒商品殺蟲(chóng)劑。雖然桿狀病毒具有高度的專一性、對(duì)人畜及動(dòng)物無(wú)害、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，但其也有一定的缺點(diǎn)，如殺蟲(chóng)速率相對(duì)緩慢、對(duì)高齡害蟲(chóng)殺蟲(chóng)力弱等[1]。因此，利用各種生物毒素對(duì)桿狀病毒進(jìn)行基因工程改造已成為主要發(fā)展方向。

生物毒素也被稱為天然毒素，是由植物、動(dòng)物、微生物等產(chǎn)生的對(duì)其他物種有毒害作用的一類化學(xué)物質(zhì)[2-3]。在生物毒素中，有一種蝎毒(Scorpion venom)，它主要存在于蝎子尾刺的毒囊中，其主要成分是神經(jīng)毒素，而神經(jīng)毒素是引起麻痹甚至死亡的最主要成分[4-5]，并且神經(jīng)毒素可以選擇性地作用于不同的離子通道，被稱之為蝎神經(jīng)毒素。表1為幾種蝎毒素基因表達(dá)產(chǎn)物的殺蟲(chóng)效果。

表 1 不同蝎毒素基因表達(dá)產(chǎn)物的殺蟲(chóng)效果

用于外源基因真核表達(dá)的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Baculovirus expression vector system,BEVS),可以將目的基因整合到桿狀病毒基因組后導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，這類表達(dá)所得的蛋白具有完善的翻譯后修飾及同天然蛋白相同的生理活性[12]，這是細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)所不具備的[13]。

本研究所用神經(jīng)毒素基因(RjAa17f)(GenBank登錄號(hào)：HM233954)來(lái)自古巴黑腳朱蝎(Rhopalurusjunceus)的毒液，其編碼的蛋白質(zhì)RjAa17f對(duì)節(jié)肢動(dòng)物有特異毒性，該毒素蛋白對(duì)小鼠沒(méi)有毒害現(xiàn)象，而對(duì)蟋蟀有明顯的致死效應(yīng)[14]，但其機(jī)理并不清楚。本研究利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出RjAa17f毒蛋白，將該毒蛋白作用于棉鈴蟲(chóng)中腸，測(cè)定棉鈴蟲(chóng)中腸膜電位的變化，并對(duì)其毒力進(jìn)行測(cè)定，以期為闡明該神經(jīng)毒素殺蟲(chóng)作用機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

棉鈴蟲(chóng)卵及人工飼料均購(gòu)于河南濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司。供體質(zhì)粒pFastBac-HTb、大腸桿菌(Escherichiacoli)TG1，均為西北農(nóng)林科技大學(xué)昆蟲(chóng)研究所保存。昆蟲(chóng)草地夜蛾細(xì)胞(Sf9)、E.coliDH10Bac(含有苜蓿銀紋夜蛾AcMNPV人工細(xì)菌染色體Bacmid(bMON14272)和輔助質(zhì)粒pMON7124)，均由浙江大學(xué)張傳溪教授饋贈(zèng)。含有HearNPV基因組(HaBacHZ8)的菌株E.coliBW25113，由中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所胡志紅研究員饋贈(zèng)。RjAa17f全基因(GenBank登錄號(hào)：HM233954)委托上海冠旭公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 重組轉(zhuǎn)座載體、重組穿梭載體的構(gòu)建 根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，參照RjAa17f基因的cDNA全序列及供體質(zhì)粒pFastBac-HTb，選擇的酶切位點(diǎn)分別是BamHⅠ和HindⅢ(酶切位點(diǎn)下劃線斜體標(biāo)出)。

RjAa17f-F：5′-CGGATCCATGAAGATTTT-GATATTCATC-3′(28 bp)；

RjAa17f-R：5′-CAAGCTTTTATCCTCTAC-ATTTAATGTTGC-3′(30 bp)。

通過(guò)BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，將連在T載體的RjAa17f基因通過(guò)酶切、連接、割膠回收、轉(zhuǎn)化等方法克隆進(jìn)入供體質(zhì)粒載體pFastBac-HTb，采用酶切進(jìn)行鑒定，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)座載體RjAa17f-HTb。將構(gòu)建好的RjAa17f-HTb轉(zhuǎn)化到DH10Bac菌株，在包含50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 慶大霉素、10 μg/mL 四環(huán)素、100 μg/mL X-gal、40 μg/mL IPTG 的LB瓊脂糖平板上進(jìn)行DH10Bac轉(zhuǎn)化株的藍(lán)白斑篩選。挑選10個(gè)白色的克隆，重新在含有上述抗生素和顯色試劑的LB瓊脂糖平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h。再次選出白色單克隆，轉(zhuǎn)接至含有50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 慶大霉素、10 μg/mL 四環(huán)素的液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)24 h后，根據(jù)Bac-to-BacTM(Invitrogen，USA)提取重組質(zhì)粒，并用M13引物(M13-F：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′和M13-R：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)進(jìn)行PCR鑒定，確定獲得的重組子為單一的RjAa17f-Bacmid病毒基因組。

1.2.2Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)及重組桿狀病毒質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)是用SFX昆蟲(chóng)培養(yǎng)基(SIGMA)補(bǔ)加100 μg/mL 氨芐青霉素、50 μg/mL 鏈霉素、1%的胎牛血清，置于27 ℃培養(yǎng)，約72 h細(xì)胞即處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

挑選單層貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞，鋪在準(zhǔn)備好的24孔板，置于27 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將制備好的RjAa17f-Bacmid DNA和轉(zhuǎn)染試劑(Roche,Switzerland)及無(wú)抗生素的培養(yǎng)基以1∶1∶50，2∶1∶50混合，靜置45 min。將預(yù)先混勻的DNA和轉(zhuǎn)染試劑加入已準(zhǔn)備好的含有單層貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好Sf9的24孔板中，搖晃5～10 s，混勻。27 ℃培養(yǎng)3～7 d，觀察轉(zhuǎn)染效果，確定感染正常后收集病毒上清液用于后續(xù)感染擴(kuò)繁含有RjAa17f的重組病毒。以等量未重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得對(duì)照Bacmid病毒。

1.2.3 病毒的大量制備 收集轉(zhuǎn)染后的病毒上清液，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)增病毒，即取1 mL加入單層貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞中，再加入1 mL含血清的SFX培養(yǎng)基，溫和混勻后于27 ℃培養(yǎng)5 d。6孔板如此反復(fù)，擴(kuò)增病毒和提高病毒滴度，用于后續(xù)感染分析和重組蛋白生產(chǎn)。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)鑒定目的蛋白的表達(dá) 用含有RjAa17f的重組病毒感染Sf9細(xì)胞 120 h后，將細(xì)胞用PBS(NaCl 137 mmol/L、KCl 2.7 mmol/L、Na2HPO48 mmol/L、KH2PO41.5 mmol/L，pH 7.4)清洗3次，2 000 r/min離心10 min后收集細(xì)胞，然后用沸水煮蛋白樣品10～15 min，通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分離。電泳后凝膠上的目的條帶用電轉(zhuǎn)移法印跡到硝酸纖維素濾膜上，轉(zhuǎn)移電壓為9 V 30 min。轉(zhuǎn)移完畢后取出NC膜置于封閉液(20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、 150 mmol/L NaCl、0.05% Tween-20)中，搖床培養(yǎng)2～3 h。然后加入抗his標(biāo)簽鼠抗作為一抗(Abcam,England )4 ℃孵育，過(guò)夜，比例為1∶2 000，然后TBST洗3次，每次5 min；二抗：羊抗鼠(Abcam,England )，比例為1∶5 000，搖床培養(yǎng)1 h，然后TBST洗3次，每次5 min。通過(guò)化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo Scientific Pierce ECL,USA)顯色，熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)2950 MI (Clinx Science Instruments,China)照相。

1.2.5 RjAa17f毒蛋白的制備與中腸電生理測(cè)定 (1)RjAa17f毒蛋白的制備。RjAa17f毒蛋白通過(guò)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。用含有基因組RjAa17f的重組病毒大量感染健康的對(duì)數(shù)期Sf9細(xì)胞，感染120 h后收集感染后的細(xì)胞，加PBS溶液，500g×10 min、4 ℃反復(fù)離心，棄上清，加PBS溶液混勻、渦旋后進(jìn)行超聲波破碎，強(qiáng)度30%，破碎5 s、間隙5 s，破碎5 min。離心除去沉淀，上清液即為RjAa17f毒蛋白粗液。以等量對(duì)照Bacmid病毒感染的Sf9細(xì)胞為對(duì)照，蛋白粗液制備方法相同。制備RjAa17f毒蛋白粗液和Bacmid病毒感染Sf9細(xì)胞蛋白粗液用于后續(xù)生物活性測(cè)定。

(2)中腸電生理測(cè)定。選取末齡健康棉鈴蟲(chóng)，體質(zhì)量為60～80 mg/頭，30頭為1個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次。每頭棉鈴蟲(chóng)饑餓過(guò)夜后注射10 μL RjAa17f毒蛋白粗液，以注射10 μL Bacmid病毒感染的Sf9細(xì)胞蛋白粗液為空白對(duì)照；分別在注射后3，6，9，12 h解剖試蟲(chóng)，取出中腸用毛細(xì)管吸附，使中腸尾端包裹于毛細(xì)管口處，用正負(fù)極探針刺入中腸膜，通過(guò)Axoclamp 900A(Axon Instrument，F(xiàn)oster City，CA)電位儀器測(cè)定膜電位。測(cè)定數(shù)據(jù)由連接該儀器的計(jì)算機(jī)收集，并通過(guò)Origin 9.0軟件進(jìn)行制圖。

1.2.6 RjAa17f毒蛋白的毒力測(cè)定 挑選健康的3齡棉鈴蟲(chóng)進(jìn)行RjAa17f毒蛋白毒力測(cè)定。將RjAa17f毒蛋白用PBS溶液進(jìn)行稀釋，稀釋后質(zhì)量濃度分別為0.375，0.75，1.5，3，6和12 mg/mL。在低溫(4 ℃)處理3齡棉鈴蟲(chóng)30 min后，用微量注射器將稀釋后的毒蛋白注射到蟲(chóng)體的前胸背板，每頭棉鈴蟲(chóng)注射2 μL，每處理注射20頭，重復(fù)3次。以注射生理鹽水為對(duì)照。處理后將試蟲(chóng)置于24 ℃的培養(yǎng)室飼養(yǎng),相對(duì)濕度75%～85%，每隔2 h觀察并記錄棉鈴蟲(chóng)死亡數(shù)。以注射后72 h死亡蟲(chóng)數(shù)計(jì)算毒力回歸方程、致死中量(LD50)、LD50值的95%置信限等。

2 結(jié)果與分析

2.1RjAa17f-HTb的酶切鑒定

查詢GenBank中神經(jīng)毒素基因RjAa17f的已知序列，并根據(jù)本試驗(yàn)的需要在基因RjAa17f兩端引入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，基因RjAa17f與供體質(zhì)粒pFastBac-HTb相連后，酶切結(jié)果如圖1所示，在252 bp得到1條清晰的條帶，與預(yù)期的結(jié)果一致，經(jīng)過(guò)測(cè)序與原序列一致。表明神經(jīng)毒素基因RjAa17f已成功與pFastBac-HTb載體相連。

2.2 轉(zhuǎn)化到DH10Bac菌株的PCR鑒定

查詢Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)可知，含有神經(jīng)毒素基因RjAa17f的重組質(zhì)粒片段大小為2 430 bp，加上插入的目的基因片段，即為2 682 bp，經(jīng)過(guò)幾輪劃線純化后，通過(guò)M13-F/M13-R的鑒定，篩選出純轉(zhuǎn)座子。由圖2可知，RjAa17f-Bacmid的PCR與預(yù)期的結(jié)果一致，說(shuō)明得到含有神經(jīng)毒素基因RjAa17f的重組Bacmid。

圖 1 RjAa17f-HTb的酶切鑒定

圖 2 RjAa17f重組Bacmid的PCR鑒定

2.3 重組桿狀病毒質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

將構(gòu)建好的RjAa17f重組Bacmid轉(zhuǎn)染至貼壁培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞，24 h后開(kāi)始觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。如圖3所示，轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞直徑增加、細(xì)胞核增大；轉(zhuǎn)染24～72 h后細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)脫壁現(xiàn)象；轉(zhuǎn)染72 h后，被感染的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，大部分細(xì)胞開(kāi)始呈現(xiàn)脫壁現(xiàn)象并上浮。這說(shuō)明神經(jīng)毒素基因RjAa17f的重組Bacmid已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞中。

圖 3 光學(xué)顯微鏡下RjAa17f-Bacmid感染后的Sf9細(xì)胞(60×)

2.4 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測(cè)毒素蛋白R(shí)jAa17f的表達(dá)

收集RjAa17f-Bacmid轉(zhuǎn)染后120 h的Sf9細(xì)胞進(jìn)行蛋白檢測(cè)。神經(jīng)毒素基因RjAa17f表達(dá)的毒蛋白再加上6×His標(biāo)簽的蛋白大小為16.2 ku左右。由圖4可知，RjAa17f毒蛋白感染細(xì)胞可明顯看到與預(yù)測(cè)條帶大小一致的陽(yáng)性條帶，說(shuō)明神經(jīng)毒素基因RjAa17f已經(jīng)在Sf9細(xì)胞中成功表達(dá)。

2.5 RjAa17f毒蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)中腸膜電位的作用

以注射后時(shí)間為x軸、棉鈴蟲(chóng)中腸膜電位為y軸，通過(guò)Origin9.0軟件進(jìn)行作圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，CK試蟲(chóng)的電位在-50～-60 mV，注射RjAa17f毒蛋白后，棉鈴蟲(chóng)中腸膜電位呈現(xiàn)逐步升高的趨勢(shì)，隨著時(shí)間的變化，升高的幅度逐漸降低，最后趨于平緩。

圖 4 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)毒素蛋白R(shí)jAa17f的表達(dá)

圖 5 RjAa17f毒蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)中腸膜電位的作用

2.6 RjAa17f毒蛋白的毒力測(cè)定

RjAa17f毒蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)的毒力回歸方程為Y=1.93+1.52X，相關(guān)系數(shù)r=0.98，LD50為108.12 μg/g，95%水平的置信區(qū)間為75.68～161.34 μg/g。

3 討論與結(jié)論

編碼整合有神經(jīng)毒素基因的桿狀病毒可以提高桿狀病毒對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)速度，例如螨類毒素TxP-1[15]、蜘蛛毒素Av-Tox2[16]、東亞鉗蝎毒素BmKIT[9]等，這些重組病毒加快了昆蟲(chóng)的死亡，減少了昆蟲(chóng)取食量，引起昆蟲(chóng)肌肉麻痹，但對(duì)其作用機(jī)理的研究甚少。為進(jìn)一步明確神經(jīng)毒素對(duì)鱗翅目幼蟲(chóng)的致毒機(jī)理，本研究通過(guò)真核表達(dá)系統(tǒng)在Sf9細(xì)胞中成功表達(dá)了RjAa17f毒蛋白，通過(guò)組織電極測(cè)定發(fā)現(xiàn)RjAa17f毒蛋白作用于棉鈴蟲(chóng)后，棉鈴蟲(chóng)中腸膜電位顯著升高，而注射對(duì)照蛋白液的棉鈴蟲(chóng)中腸膜電位則沒(méi)有發(fā)生變化。這說(shuō)明RjAa17f毒蛋白能直接作用于鱗翅目幼蟲(chóng)的中腸，導(dǎo)致其膜電位的升高，使得中腸跨膜電位差縮小，從而影響離子的運(yùn)輸，對(duì)中腸產(chǎn)生一定的麻痹作用。由于中腸是昆蟲(chóng)消化吸收營(yíng)養(yǎng)的主要部位，這解釋了神經(jīng)毒素基因重組的桿狀病毒能夠有效減少試蟲(chóng)取食量并提高殺蟲(chóng)速度的原因。當(dāng)然，神經(jīng)毒素的作用靶標(biāo)遠(yuǎn)不止中腸，要完全了解神經(jīng)毒素對(duì)昆蟲(chóng)的全部作用途徑與機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。

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Expression and activity of neurotoxin geneRjAa17finSf9 cells

MENG Jiao,YU Huan,ZHOU Bin,WANG Dun

(MinistryEducationKeyLaboratoryofPlantProtectionResources&PestManagement,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study aimed to expressRhopalurusjunceusneurotoxin gene inSpodopterafrugiperdacells (Sf9) to block insect sodium and potassium ion channels.【Method】 The toxic protein RjAa17f was expressed by baculovirus eukaryotic expression vector system,and western blots was used to identify the toxic protein.The change of midgut membrane potential caused by RjAa17f toxic protein crude extract was determined and the toxicity was tested.【Result】 By Western blot verification,RjAa17f target protein expressed inSf9 had the same size as predicted.After acting onHelicoverpaarmigeramidgut,the midgut membrane potential increased significantly during 3-12 h compared to CK and the trend decreased after 9 h.LD50of RjAa17f toxin protein crude extract was 108.12 μg/g.【Conclusion】 RjAa17f active protein was expressed inSf9,and it significantly changed midgut potential ofHelicoverpaarmigera.

Helicoverpaarmigera;neurotoxin geneRjAa17f;Sf9;toxic protein RjAa17f;baculovirus eukaryotic expression system

時(shí)間:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.024

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.048.html

2015-05-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170609，31270691)

孟 姣(1989-)，女，山西太原人，碩士，主要從事微生物資源與利用研究。E-mail：mengjiaomjmj@126.com

王 敦(1973-)，男，青海西寧人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事昆蟲(chóng)和病毒分子生物學(xué)研究。 E-mail:dunwang@foxmail.com;wanghande@nwsuaf.edu.cn

Q78

A

1671-9387(2016)11-0166-06