青魚γ-干擾素基因的克隆與表達分析

周 勇，范玉頂，黃莉莉，曾憲輝，張雪萍，張琳琳，曾令兵

(1 中國水產(chǎn)科學研究院 長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢430223；2 湖州師范學院 浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術研究重點實驗室，浙江 湖州 313000；3 華中農(nóng)業(yè)大學 水產(chǎn)學院，湖北 武漢4300701；4 上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

?

青魚γ-干擾素基因的克隆與表達分析

周 勇1,2,3，范玉頂1，黃莉莉4，曾憲輝4，張雪萍3，張琳琳3，曾令兵1

(1 中國水產(chǎn)科學研究院 長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢430223；2 湖州師范學院 浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術研究重點實驗室，浙江 湖州 313000；3 華中農(nóng)業(yè)大學 水產(chǎn)學院，湖北 武漢4300701；4 上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

【目的】 開展青魚γ-干擾素(IFN-γ)基因的克隆、結構特征與表達譜分析研究。【方法】 采用cDNA末端快速擴增技術獲得了青魚(Mylopharyngodonpiceus)IFN-γ基因cDNA的5′和3′末端序列，然后根據(jù)其末端序列設計特異性引物，擴增得到青魚IFN-γ基因cDNA全長序列，對其序列和編碼氨基酸序列進行生物信息學、同源性比較及系統(tǒng)進化樹分析，同時對其在青魚各組織中的表達進行分析。通過構建真核表達載體，將其轉染青魚鰭條組織細胞進行表達分析?！窘Y果】 青魚IFN-γcDNA全長為895 bp，其開放閱讀框大小為549 bp，編碼182個氨基酸。氨基酸序列比對分析結果顯示，青魚IFN-γ與人、雞、鼠IFN-γ的序列相似性僅為1.5%～7.7%，與其他魚類IFN-γ序列相似性較高，為16.3%～92.9%。青魚IFN-γ分子N末端包含1個信號肽序列、C末端有IFN-γ特征序列([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V])以及核定位基序(RRRR)。青魚IFN-γ蛋白二級結構與高等脊椎動物IFN-γ類似，包含7個α螺旋結構。經(jīng)Poly I:C誘導后發(fā)現(xiàn)，IFN-γ在青魚頭腎、腎、脾、皮膚和鰓組織中表達顯著上調(diào)，最高的為頭腎，其次為脾、皮膚、鰓和腎，而在心臟和腦組織中無顯著變化。青魚γ-干擾素真核表達質(zhì)粒在青魚鰭條組織細胞中成功表達IFN-γ?！窘Y論】 成功克隆了青魚IFN-γ基因cDNA，經(jīng)Poly I:C誘導后，該基因在頭腎中上調(diào)倍數(shù)最為顯著，青魚γ-干擾素在體外獲得表達。

青魚；IFN-γ基因；結構特征；表達分析

干擾素(IFN)是一類能夠誘導脊椎動物細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白的分泌型細胞因子，可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3種[1]。其中，Ⅱ型干擾素即γ-干擾素(INF-γ)，主要由NK細胞產(chǎn)生，也可由單核吞噬細胞及抗原提呈細胞分泌的IL-12和IL-18刺激T淋巴細胞產(chǎn)生[2-4]。IFN-γ能誘導巨噬細胞產(chǎn)生毒性物質(zhì)或促使宿主細胞合成大量抗病毒蛋白，還可介導白細胞聚集、調(diào)節(jié)T細胞增殖和分化、增強抗原提呈，從而使機體呈現(xiàn)抗病毒狀態(tài)[4]。

IFN-γ基因已在斑馬魚[5]、鯉魚[6]、虹鱒[7]、斑點叉尾鮰[8]、大西洋鮭[9]、金魚[10]、斜帶石斑魚[11]、河豚魚[12]等多種魚類中克隆得到。魚類與哺乳動物的IFN-γ基因同源性較低，但其在調(diào)節(jié)免疫應答和抗病毒等方面的作用與哺乳動物一致[13]。作為一種高效的非特異性免疫因子，INF-γ在魚類的抗病毒感染免疫中發(fā)揮重要作用[6-12]。青魚(Mylopharyngodonpiceus)屬于鯉科魚類，主要分布于我國長江以南的平原地區(qū)，是我國淡水養(yǎng)殖的“四大家魚”之一。但是，隨著養(yǎng)殖范圍、規(guī)模、密度的不斷擴大，青魚病害問題頻繁發(fā)生，制約了青魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。迄今為止，尚未見有關青魚IFN-γ編碼序列、結構特征和表達譜分析等的研究報道。因此，開展青魚抗病相關基因及蛋白質(zhì)分子結構特征與表達譜研究，對于青魚健康養(yǎng)殖具有重要的理論意義和應用價值。本研究進行了青魚IFN-γ基因的克隆、結構特征與表達譜分析，旨在為進一步研究青魚IFN-γ在抗病毒感染防御中的功能與調(diào)控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗魚與細胞系 青魚質(zhì)量約100克/尾，購自武漢某養(yǎng)殖場，暫養(yǎng)在實驗室 100 cm×50 cm×60 cm水族箱中， 1 周后用于試驗。青魚鰭條組織細胞系(BC-Fin)置于含體積分數(shù)15%胎牛血清的L-15培養(yǎng)液中，25 ℃下培養(yǎng)，由長江流域水生動物疫病重點實驗室建立并保存。

1.1.2 試 劑 反轉錄試劑盒SMART PCR cDNA Synthesis Kit和SMARTer RACE cDNA Amplification kit為Clontech公司產(chǎn)品；Dnase Ⅰ、測序載體pMD19-T、大腸桿菌菌株DH5α以及用于PCR擴增的TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs、DNA Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)為 Life Technologies公司產(chǎn)品；各種限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶為Promega公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒為OMEGA Bio-Tek公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 為Invitrogen公司產(chǎn)品；鼠抗His標簽抗體為Abcam公司產(chǎn)品；免疫熒光染色試劑盒(抗鼠Cy3)為碧云天公司產(chǎn)品。

1.2 總RNA提取及青魚IFN-γ基因cDNA的擴增

無菌條件下取青魚腎臟組織10 g，利用Trizol法提取總RNA。將提取的總RNA用Dnase Ⅰ于37 ℃下處理30 min后回收產(chǎn)物，按照反轉錄試劑盒SMART PCR cDNA Synthesis Kit說明書，反轉錄擴增獲得青魚IFN-γ基因cDNA 第一鏈。

1.3 青魚IFN-γ基因的克隆

根據(jù)已知硬骨魚類IFN-γ序列設計簡并引物(表1)，擴增得到青魚IFN-γ基因部分片段，反應體系為：10×PCR Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL，cDNA 5 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL，引物JB1-F和JB1-R(10 mmol/L)各1 μL，ddH2O 14.8 μL。再按SMARTer RACE cDNA Amplification kit要求，分別設計正、反向第一次擴增，反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，運行5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 45 s，運行5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，運行27個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將外引物(NUP,RACE1-3F/RACE1-5R)PCR產(chǎn)物用無菌水稀釋50倍后，取1 μL稀釋液作為內(nèi)引物(NUP,RACE2-3F/RACE2-5R)PCR反應的模板，進行第二次PCR擴增，反應體系為：10×Advantage 2 PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL， 50×二聚合酶混合物1 μL，NUP(10 mmol/L)1 μL，引物RACE2-3F和RACE2-5R(10 mmol/L)各1 μL，模板1 μL，ddH2O 40 μL。反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，運行35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。根據(jù)巢式PCR所得到的IFN-γ3′和5′端基因序列設計引物，擴增青魚IFN-γcDNA。反應結束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測，回收產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

表 1 本試驗所用引物序列

1.4 青魚IFN-γ基因序列分析

利用NCBI的BLAST軟件對青魚IFN-γ基因及氨基酸序列進行同源性比較；用SignalP和PSIRED軟件對其編碼蛋白進行信號肽預測及二級結構分析；用Clustal W和MEGA軟件對氨基酸序列進行多重比對及系統(tǒng)進化分析。

1.5 青魚IFN-γ基因的表達譜分析

取試驗魚20尾，平均分為試驗組和對照組，試驗組每尾魚腹腔注射500 μL(2.5 mg)Poly I:C，對照組每尾魚腹腔注射DPBS 500 μL。24 h后分別取試驗組和對照組青魚的腦、鰓、心、頭腎、腎、脾和皮膚組織，提取各組織總RNA，反轉錄擴增為cDNA。根據(jù)青魚IFN-γ基因序列合成熒光定量PCR引物JC-F和JC-R(表1)，以β-actin作為內(nèi)參基因。將目的基因擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后于16 ℃與pMD19-T載體連接1 h，用連接產(chǎn)物轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞并擴增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用分光光度計測定質(zhì)粒濃度，計算重組質(zhì)粒的DNA拷貝數(shù)。質(zhì)粒經(jīng)10倍梯度稀釋后，作為標準模板進行熒光定量PCR擴增，制作標準曲線。在熒光定量PCR儀(Rotor-Gene 6000,Qiagen)上進行擴增，反應程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，63 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)，反應結束后繪制標準曲線。根據(jù)各組織樣品的Ct值計算IFN-γ和β-actin 基因的拷貝數(shù)，并以β-actin基因拷貝數(shù)為準對目的基因拷貝數(shù)進行歸一化處理。

1.6 青魚IFN-γ真核表達載體的構建

利用引物M.IFNγ-F/M.IFNγ-R(表1)擴增帶有EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ 酶切位點的青魚IFN-γ開放閱讀框，設計引物時在IFN-γ上游ATG前加上kozak序列(GCCACC)，除去IFN-γ終止密碼，并在3′末端加上6×His標簽進行融合表達。雙酶切后將目的片段連接到真核表達載體pcDNA3.1(+)上，轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，PCR篩選陽性克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后，命名為pcDNA3.1(+)-IFN-γ，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.7 pcDNA3.1(+)-IFN-γ在青魚鰭條細胞中的表達分析

通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將真核表達載體pcDNA3.1(+)-IFN-γ轉染到青魚鰭條細胞(BC-Fin)中，同時設置空質(zhì)粒對照。將轉染后的細胞置于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)，于轉染后24，48，72，96和120 h分別取出一瓶細胞，用His抗體(Abcam)作為一抗，紅色熒光探針標記的羊抗鼠IgG(H+L)抗體為二抗，參照免疫熒光染色試劑盒說明對轉染后的細胞進行間接熒光免疫檢測。

2 結果與分析

2.1 青魚IFN-γ基因結構特征

青魚IFN-γ基因cDNA(GenBank 登錄號：KP257568)全長為895 bp(圖 1)，其開放閱讀框大小為549 bp，編碼一個含有182個氨基酸的蛋白，其5′和3′端分別有138，208 bp的非編碼區(qū)。

2.2 青魚IFN-γ氨基酸序列結構特征及比對分析

將青魚IFN-γ與部分高等脊椎動物和魚類的IFN-γ氨基酸序列進行相似性比對，結果(表2)顯示，青魚IFN-γ與高等脊椎動物IFN-γ氨基酸序列相似性僅為1.5%～7.7%，而與魚類IFN-γ的相似性為16.3%～92.9%，其中與草魚(C.idella)IFN-γ的相似性最高，為92.9%。

下劃線標示起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)

表 2 青魚與12個其他物種IFN-γ氨基酸序列的同源性(右上角)和差異性(左下角)

注：1～13分別為青魚、金魚、鯉魚、草魚、斑馬魚、斑點叉尾鮰、雞、人、露斯塔野鯪、虹鱒、黑青斑河鲀、鼠、紅鰭東方鲀的IFN-γ氨基酸序列。

Note:1-13 are IFN-γ amino acid sequences ofMylopharyngodonpiceus(KP257568),Carassiusauratus(ACG68885.1),Cyprinuscarpio(1 CAJ51088.1),Ctenopharyngodonidella(2 JX196701.1),Daniorerio(NP_998029.1),Ictaluruspunctatus(1 NP_001187231.1),chicken (NP_990480.1),human (AAX42631.1),Labeorohita(HQ667144.1),Oncorhynchusmykiss(NP_001153975.1),Tetraodonnigroviridis(CAF95605.1),mouse (NP_03063.1),Takifugurubripes(CAE82301.2).

青魚IFN-γ蛋白二級結構包含7個α螺旋結構，N端存在1個信號肽序列(MTAQHMMAIFWGVCLLILRRMTYA)，而C末端存在IFN-γ家族的特征序列([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V])以及核定位基序(RRRR)(圖2)。利用MEGA軟件構建的硬骨魚類IFN-γ蛋白序列進化系統(tǒng)發(fā)育樹表明，青魚IFN-γ與草魚(C.idella)IFN-γ聚為一支(圖3)。

相似的氨基酸用“.”和“:”表示，信號肽序列用下劃線表示，保守的α-螺旋結構以序列上方加黑線表示，IFN-γ特征序列以陰影表示，核定位序列用黑框表示

2.3 青魚IFN-γ基因的組織表達譜

青魚注射Poly I:C后，采用熒光定量PCR法檢測IFN-γ的表達譜，結果見圖4。如圖4所示，Poly I:C能誘導青魚頭腎、脾、皮膚、鰓和腎組織中的IFN-γ表達顯著上調(diào)，IFN-γ表達量分別為對照組的25，22，18，13和9倍，且以頭腎中的上調(diào)變化最為顯著，而心臟和腦組織中無顯著變化。

圖 3 硬骨魚類IFN-γ蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

*表示與對照組差異顯著(P<0.05)

2.4IFN-γ在青魚鰭條組織細胞中的表達

將真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ轉染青魚鰭條細胞，在24，48，72，96和120 h分別取出一瓶細胞，利用His抗體作為一抗，進行間接熒光免疫檢測。結果(圖5)表明，轉染重組質(zhì)粒的青魚鰭條細胞24 h后在綠光激發(fā)下有鮮艷的紅色出現(xiàn)，并且隨著細胞培養(yǎng)時間的延長，紅色熒光數(shù)量增多，72 h紅色熒光數(shù)量最多；而轉染空質(zhì)粒的青魚鰭條細胞則沒有紅色熒光出現(xiàn)。

3 討 論

本研究從青魚腎臟組織中克隆得到了IFN-γ基因cDNA全長序列，該基因編碼的氨基酸序列與草魚、鯉魚和鯽魚的IFN-γ氨基酸序列有很高的相似性，這是由于它們均屬于鯉科魚類，有較近的親緣關系。青魚IFN-γ蛋白二級結構包含7個α螺旋結構，該結構中全部肽鍵都可以形成氫鍵，故有助于其結構的穩(wěn)定[14]。此外，青魚IFN-γ N端的信號肽可指導其跨膜轉移、C末端存在的核定位基序有助于IFN-γ進入細胞核，最終使得信號轉導過程順利完成[7,15]。青魚及其他硬骨魚類的IFN-γ中都包含這段基序，推測這段基序?qū)τ谟补囚~類IFN-γ的功能是至關重要的。

對哺乳動物的研究表明，經(jīng)抗原刺激后可致巨噬細胞、NK細胞、Th1細胞以及與抗原提呈相關的細胞產(chǎn)生IFN-γ[16-18]。硬骨魚類的巨噬細胞和淋巴細胞主要存在于頭腎和脾臟中。斑馬魚、虹鱒、大西洋鱈魚經(jīng)Poly I:C誘導后，其免疫器官中IFN-γ的表達水平都會顯著升高，尤其頭腎組織中IFN-γ的表達水平上調(diào)最明顯[7,12-13]。而斑點叉尾鮰在受到外來抗原物質(zhì)刺激后，其外周血淋巴細胞中的IFN-γ轉錄水平顯著上調(diào)[19]。本研究中青魚腹腔注射Poly I:C后，頭腎、脾臟等魚類主要免疫器官中IFN-γ的表達量顯著上調(diào)，表明脊椎動物IFN-γ的細胞來源及功能在進化歷程中有較高的保守性。

A.白光下的青魚鰭條細胞；B，C，D，F(xiàn)，G，H.熒光顯微鏡下pcDNA3.1(+)-IFN-γ轉染24，48，48，72，96和120 h后的細胞；E.熒光顯微鏡下空質(zhì)粒轉染后的細胞。標尺 100 μm

為方便體外開展青魚IFN-γ功能研究，本研究選擇使用真核表達系統(tǒng)在青魚鰭條細胞系中表達IFN-γ。設計引物時，在IFN-γ上游ATG前加上kozak序列(GCCACC)，同時在終止密碼子(TAG)前加上6×His基因(CATCATCATCATCATCAT)，以增強基因的融合表達，便于對蛋白表達情況進行檢測。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ轉染青魚鰭條細胞后，用表達的融合蛋白與鼠抗His標簽抗體雜交，再與帶有熒光Cy3標記的抗體雜交，在綠光激發(fā)下觀察細胞呈鮮紅色，說明IFN-γ在青魚鰭條細胞中被正確表達。本研究結果為進一步探討青魚IFN-γ的時序表達特征及其抗感染防御機制奠定了基礎。

[1] Pestka S,Krause C D,Walter M R.Interferons,interferonlike cytokines,and their receptors [J].Immunological Reviews,2004,202:8-32.

[2] Savan R,Ravichandran S,Collins J R,et al.Structural conservation of interferon gamma among vertebrates [J].Cytokine & Growth Factor Reviews,2009,20(2):115-124.

[3] Perussia B.Lymphokine-activated killer cells,natural killer ce-lls and cytokines [J].Current Opinion in Immunology,1991,3(1):49-55.

[4] Schroder K,Hertzog P J,Ravasi T,et al.Interferon-gamma:an overview of signals, mechanisms and functions [J].Journal of Leukocyte Biology,2004,75(2):163-189.

[5] Igawa D,Sakai M,Savan R.An unexpected discovery of two interferon gamma like genes along with interleukin (IL)-22 and -26 from teleost: IL-22 and -26 genes have been described for the first time outside mammals [J].Molecular Immunology,2006,43(7):999-1009．

[6] Ellen H S,Huub F J S,Geert W,et al.Differential expression of two interferon-c genes in common carp (CyprinuscarpioL.) [J].Developmental and Comparative Immunology,2008,32(12):1467-1481.

[7] Zou J,Carrington A,Collet B,et al.Identification and bioactivities of IFN-gamma in rainbow troutOncorhynchusmykiss:the first Th1-type cytokine characterized functionally in fish [J].Journal of Immunology,2005,175(4):2484-2494.

[8] Milev-milovanovic I,Long S,Wilson M,et al.Identification and expression analysis of interferon gamma genes in channel catfish [J].Immunogenetics,2006,58(1):70-80．

[9] Robertsen B.The interferon system of teleost fish [J].Fish & Shellfish Immunology,2006,20(2):172-191.

[10] Leon G,Miodrag B.Molecular characterization,expression and functional analysis of goldfish (CarassiusaurutusL.) interferon gamma [J].Developmental and Comparative Immunology,2009,33(2):235-246.

[11] 黃 貝,陳善楠,黃文樹,等.斜帶石斑魚IFN-γ基因的克隆與表達分析 [J].中國水產(chǎn)科學,2013,20(2):269-275.

Huang B,Chen S N,Huang W S,et al.Molecular characterization and expression of interferon gamma (IFN-γ) in orange-spotted grouper (Epinepheluscoioides) [J].Journal of Fishery Sciences of China,2013,20(2):269-275.

[12] Zou J,Yoshiura Y,Dijkstra J M,et al.Identification of an interferon gamma homologue in Fugu,Takifugurubripes[J].Fish & Shellfish Immunology,2004,17(4):403-409.

[13] Clemens F,Marit S,Bore R.Molecular characterization and expression analysis of interferon gamma in Atlantic cod (Gadusmorhua) [J].Fish & Shellfish Immunology,2009,26(2):285-292.

[14] Savan R,Ravichandran S,Collins J R,et al.Structural conservation of interferon gamma among vertebrates [J].Cytokine& Growth Factor Reviews,2009,20(2):115-124.

[15] Subramaniam P S,Mujtaba M G,Paddy M R,et al.The carboxyl terminus of interferon-gamma contains a functional polybasic nuclear localization sequence [J].Journal of Biological Chemistry,1999,274(1):403-407.

[16] Gessani S,Belardelli F.IFN-gamma expression in macrophages and its possible biological significance [J].Cytokine & Growth Factor Reviews,1998,9(2):117-123.

[17] Yoshimoto T,Takeda K,Tanaka T,et al.IL-12 up-regulates IL-18 receptor expression on T cells,Th1 cells,and B cells:synergism with IL-18 for IFN-gamma production [J].Journal of Immunology,1998,161(7):3400-3407.

[18] Di Marzio P,Puddu P,Conti L,et al.Interferon gamma upregulates its own gene expression in mouse peritoneal macrophages [J].Journal of Experimental Medicine,1994,179(5):1731-1736.

[19] Hebert P A,Jerald A,Boyd B.Histological enzyme and flow cytometric analysis of channel catfish intestinal tract immune cells [J].Developmental & Comparative Immunology,2002,26(1):53-62.

Clone and expression of interferon gamma (IFN-γ) in black carp,Mylopharyngodonpiceus

ZHOU Yong1,2,3,FAN Yuding1,HUANG Lili4,ZENG Xianhui4,ZHANG Xueping3,ZHANG Linlin3,ZENG Lingbing1

(1YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisheryScience,Wuhan，Hubei430223,China; 2ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofAquaticDevelopment,HuzhouNormalUniversity,Huzhou,Zhejiang313000,China; 3CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei430070,China; 4CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

【Objective】 This study cloned black carp (Mylopharyngodonpiceus)IFN-γgene and analyzed its structural features and expression profiles.【Method】 Using cDNA RACE,the 5′ and 3′ terminal sequences ofIFN-γgene cDNA were obtained from black carp.Then,the specific primers were designed and the full length ofIFN-γcDNA of black carp was cloned.The nucleic acid sequence and its coded amino acid sequence were analyzed by bioinformatics,homology comparison,phylogenetic tree,and expression profiles.Finally,the eukaryotic expression vector of the IFN-γ gene was transfected into black carp fin cells for expressioninvitro.【Result】 TheIFN-γcDNA sequence consisted of 549 bp,encoding a putative protein of 182 amino acids. This IFN-γ was only 1.5%-7.7% similar to its counterparts in higher vertebrates and 16.3%-92.9% similar to those in other teleost fish. Sequence analysis revealed that the black carp IFN-γ contained the typical IFN-γ motif ([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V]) and a conserved nuclear localization site (RRRR) in the C-terminal end and displayed seven alpha-helix structures similar to mammalian IFN-γ.The expression ofIFN-γincreased in the kidney,spleen,gills,head kidney,and skin after the poly I:C stimulation.TheIFN-γgene was cloned into the pcDNA3.1 (+) eukaryotic expression vector and expressed in black carp fin cells.【Conclusion】 The black carpIFN-γcDNA was successfully cloned.The expression ofIFN-γwas significantly increased in kidney after poly I:C stimulation andIFN-γgene was expressedinvitro.

Mylopharyngodonpiceus;IFN-γgene;molecular characterization;expression profile

時間:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.007

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.014.html

2015-05-19

國家“大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項”(CARS-46-11)；浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術研究重點實驗室開放基金項目(SS201403)

周 勇(1984-)，男，湖北荊州人，助理研究員，碩士，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害研究。E-mail:zhouy@yfi.ac.cn

曾令兵(1962-)，男，湖北仙桃人，研究員，博士，博士生導師，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害研究。E-mail:zlb@yfi.ac.cn

Q786

A

1671-9387(2016)11-0047-08