青錢柳葉香豆素、黃酮含量測定及抗氧化活性研究

劉賢賢，陳剛，楊起群，蘇玉卿

（1.桂林師范高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)與藥學(xué)系，廣西桂林 541001；2.桂林伯林生物技術(shù)有限公司，廣西桂林 541003）

青錢柳葉香豆素、黃酮含量測定及抗氧化活性研究

劉賢賢1，陳剛1，楊起群1，蘇玉卿2

（1.桂林師范高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)與藥學(xué)系，廣西桂林 541001；2.桂林伯林生物技術(shù)有限公司，廣西桂林 541003）

分析青錢柳葉中的香豆素和黃酮含量，比較了不同產(chǎn)地青錢柳葉中香豆素和總黃酮含量的差異，對青錢柳葉進(jìn)行了體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：桂林伯林生物技術(shù)有限公司種植的青錢柳總黃酮含量和香豆素含量都較高，分別為2.8135%和6.9253%，高于湖南省綏寧縣、江西省修水縣的青錢柳葉總黃酮含量和香豆素含量。青錢柳葉有較好的清除羥自由基的能力，是一種較好的天然抗氧化劑，具有較高的開發(fā)價(jià)值。

青錢柳葉；香豆素；總黃酮；抗氧化活性

青錢柳（Cyclocarya paliurus(Batal.)I1jinskaya）別名:搖錢樹、麻柳，青錢李等。我國南方多省均有發(fā)現(xiàn)，多以零星分布。青錢柳乃冰川四紀(jì)幸存下來的珍稀樹種，僅存于中國。[1]青錢柳被譽(yù)為植物界的大熊貓，醫(yī)學(xué)界的第三棵樹。青錢柳葉含有多糖、氨基酸、黃酮、香豆素、生物堿、甾體、萜類、苷類、維生素E等化學(xué)成分和人體必需的一些微量元素，[2]《中國中藥資源志要》記載，青錢柳葉具有清熱、消渴、解毒之功效。此外，青錢柳還可以抑制葡萄糖的吸收，降低人體血糖，從而預(yù)防由高血糖引起的一系列病癥。[3]本研究主要對青錢柳葉的香豆素、黃酮含量進(jìn)行測定，用青錢柳葉提取物對羥基自由基（·OH）進(jìn)行體外抗氧活性研究，為開發(fā)出具有地方特色的植物保健產(chǎn)品作前期準(zhǔn)備。

一、實(shí)驗(yàn)材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

青錢柳葉（采自桂林伯林生物技術(shù)有限公司藥用植物種植基地）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（AR）、水合氧化前胡素內(nèi)酯、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇（AR）、乙醇（AR）、乙醚、1,1-二苯基-2-三硝基甲苯肼(1，1-Di?phenyl-2-TNT Thydrazine DPPH.)、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、雙氧水（H2O2）、鄰二氮菲（1,10-菲咯啉）

（二）主要儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)(SPECORD200，德國耶拿公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9140MBE，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，數(shù)控超聲波儀(KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司)，電子分析天平(FB224，上海舜宇恒平科技儀器有限公司)，粉碎機(jī)（HC-200，浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠），移液槍（GP01370、YE3K044727、DR36878，大龍行創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司），ZNHW HEATER電熱套加熱器、80-2型離心沉淀機(jī)、SPECORD200吸光儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-2000B，上海亞榮生化儀器廠)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2，上?；闯莾x器有限公司)。

（三）實(shí)驗(yàn)方法

1.青錢柳葉浸膏的制備

青錢柳葉自然晾干→粉碎過篩→稱重→加入不同溶劑→浸泡→進(jìn)行不同溶劑的超聲波提取→抽濾→蒸發(fā)濃縮→青錢柳浸膏。

將新鮮的青錢柳葉自然晾干，用粉碎機(jī)將其粉碎，稱取一定重量的青錢柳粉，分別用一定體積的50%乙醇、65%甲醇浸泡24小時(shí)，在45℃～55℃溫度，85×103～100×103Hz頻率下，進(jìn)行超聲波浸提2次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，即得到不同提取溶劑的青錢柳葉浸膏。

2.香豆素含量的測定（紫外分光光度法）

（1）水合氧化前胡素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取水合氧化前胡素內(nèi)酯對照品3.0mg，至10ml容量瓶中，加甲醇使其完全溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液（每1ml標(biāo)準(zhǔn)液含水合氧化前胡素內(nèi)酯0.3mg/ml）。

精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0ml至50ml容量品中，定容。分別吸取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.7ml，用甲醇稀釋定容到10ml容量瓶中，搖勻，在307nm波長處測定吸光度。以水合氧化前胡素內(nèi)酯對照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）青錢柳葉中香豆素含量的計(jì)算

采用分光光度法測定青錢柳葉香豆素的含量。分別稱取65%甲醇青錢柳葉浸膏和70%乙醇青錢柳浸膏適量，加甲醇和乙醇溶解定容至50ml容量瓶中，搖勻。精密吸取1ml，加甲醇和乙醇定容至10ml容量瓶中，搖勻。取一定量溶液，以甲醇試劑做對照，用分光光度計(jì)在307nm處測其吸光度。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，求出相當(dāng)于樣品吸光度的水合氧化前胡素內(nèi)酯含量，按下式求出香豆素含量（以水合氧化前胡素內(nèi)酯計(jì)）。

公式①X=［（m1v2）/(mv1)×103］×100%

式中，x為樣品中香豆素含量（以水合氧化前胡素內(nèi)酯計(jì)），m1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測液中香豆素的量（mg），m為樣品質(zhì)量（g），V1為測定樣品提取液體積（ml），V2為樣品提取液總體積（ml）。

3.總黃酮含量的測定（硝酸鋁比色法）

（1）蘆?。ㄊ|香葉苷）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取在105℃條件烘至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品約10mg，用70%乙醇定容至100ml，搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（每1ml標(biāo)準(zhǔn)液含蘆丁0.1mg）。

精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、和5.0ml（相當(dāng)于蘆丁0.0mg，0.10mg，0.20mg，0.30mg，0.40mg，0.50mg），分別置入6支10ml刻度容量瓶中，用蒸餾水定容至5.0ml，各加5%亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，放置6min后，加入10%硝酸鋁溶液0.3ml，搖勻，放置6min，再加4%氫氧化鈉溶液4ml，加蒸餾水0.4ml，搖勻，放置15min后，用分光光度計(jì)測其吸光度。（以不加蘆丁的空白管為對照調(diào)零），以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

（2）青錢柳樣品的處理[4]

分別準(zhǔn)確稱取一定重量的干粉青錢柳樣品，將粉末裝入折好的濾紙筒內(nèi)，置于索式提取器的浸提管內(nèi)，采用索式提取法，選用無水乙醚作為脫脂劑，于45-50℃脫脂約12小時(shí)。充分脫去樣品中游離之類和脂溶性色素。取出樣品濾紙筒,揮干無水乙醚，將濾紙筒烘干，得到脫脂干粉樣品。

（3）浸提

取一定量的脫脂樣品，分別用濃度為50%的乙醇在45℃～55℃、85×103～100×103Hz條件下用超聲波回流浸提2次，合并浸提液，并適當(dāng)濃縮，定容至250ml待測。

（4）提取液中黃酮類化合物含量的測定

本文參照文獻(xiàn)[5]中亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定青錢柳70%乙醇提取液的黃酮含量，在510nm處測吸光度，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（5）青錢柳總黃酮含量的測定

取一定體積的總黃酮類化合物提取液在4000r/ min下離心15min，精確吸取上層清液0.5ml放入潔凈干燥的10ml容量瓶中，補(bǔ)水至5ml，各加5%亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，放置6min，加入10%硝酸鋁溶液0.3ml，搖勻，放置6min，再加入4%氫氧化鈉溶液4ml，加蒸餾水0.4ml，搖勻，放置15min后，以試劑空白做對照，用分光光度計(jì)在510nm波長處測其吸光度。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求出相當(dāng)于樣品吸光度的蘆丁含量，按下式求出總黃酮含量（以蘆丁計(jì)）。

式中為樣品中總黃酮含量(以蘆丁計(jì))，m1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品提取液中總黃酮的量(mg),m為樣品質(zhì)量(g),V1為測定提取液體積(ml),V2為提取液總體積(ml).

4.青錢柳葉提取物對羥基自由基（·OH）的清除能力的測定（鄰二氮菲-亞鐵離子氧化(Feton)法）

取1ml鄰二氮菲溶液（摩爾濃度為0.75mmol/L),分別加入2mL磷酸緩沖液(pH為7.4)和1mL樣品溶液,充分混勻,再加入1mL硫酸亞鐵溶液(摩爾溶度為0.75 mmol/L),混合均勻,最后加入1mL新鮮的雙氧水(0.01%),迅速置于37℃水浴保溫60min后,放至室溫,于536nm波長下測其吸光值。每個(gè)濃度平行做3管，取其平均值。同時(shí)做空白對照實(shí)驗(yàn),用1mL超純水代替雙氧水測其吸光值；用1mL的無水乙醇代替1mL樣品溶液,測吸光值。按下列公式計(jì)算其清除率。

清除率%=[（As-Ap）×100]/(Ab-Ap)

其中As是樣品測試值，Ab是不加雙氧水的試樣測試值，Ap是無樣品的試樣測試值。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

（一）青錢柳葉浸膏香豆素含量的測定

1.水合氧化前胡素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照“水合氧化前胡素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的實(shí)驗(yàn)方法，在307nm波長處分別測定不同濃度的水合氧化前胡素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。

表1 水合氧化前胡素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品吸光度

根據(jù)表1的數(shù)據(jù)，繪制水合氧化前胡素內(nèi)酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1所示：

圖1 水合氧化前胡素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液回歸曲線

由圖2得到線性方程為：Y=5.3733X-0.003，相關(guān)系數(shù)R2=0.9989，Y為吸光度；X為水合氧化前胡素內(nèi)酯濃度（mg/ml）。

2.65%甲醇青錢柳葉提取浸膏香豆素含量的測定

稱取65%甲醇的青錢柳葉浸膏適量，加甲醇溶解定容至50ml容量瓶中，搖勻。精密吸取1ml，加溶劑定容至10ml容量瓶中，搖勻。取一定量溶液，以甲醇或乙醇試劑做對照，用分光光度計(jì)在307nm處測其吸光度。

根據(jù)圖2的水合氧化前胡素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線和公式①計(jì)算得香豆素含量，結(jié)果見表2、表3

由表2、表3可知：在45℃～55℃溫度、85×103～100×103Hz頻率下，采用65%甲醇做提取溶劑，對桂林伯林生物技術(shù)有限公司種植的青錢柳葉進(jìn)行超聲波浸提，所獲得浸膏的香豆素類化合物的含量較高，為6.9253%，比江西省修水縣種植的青錢柳高2.6953%，比湖南省綏寧縣種植的青錢柳高0.2953%。

表2 超聲波提取的65%甲醇浸膏香豆素含量的研究

表3 不同產(chǎn)地青錢柳葉中香豆素含量的比較

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的回歸曲線

本實(shí)驗(yàn)測得三份青錢柳葉粉末樣品的總黃酮含量見表4。

由表4、表5可知：在45℃～55℃溫度、85×103～100×103Hz頻率下，采用50%乙醇做提取溶劑，對桂林

（二）青錢柳葉總黃酮含量的測定

1.蘆?。ㄊ|香葉苷）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照“蘆?。ㄊ|香葉苷）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的實(shí)驗(yàn)方法，在510nm波長處分別測定不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程Y=1.2011X+ 0.0147，相關(guān)系數(shù)R2=0.996，蘆丁濃度在0.12-0.60mg/ ml范圍與吸光度呈線性關(guān)系。如下圖所示：

2.青錢柳總黃酮含量的測定（硝酸鋁比色法）伯林生物技術(shù)有限公司種植的青錢柳葉進(jìn)行超聲波浸提，青錢柳總黃酮類化合物的含量較高，為2.8135%，比江西省修水縣種植的青錢柳高1.5535%，比湖南省綏寧縣種植的青錢柳高0.8435%。

（三）青錢柳葉提取物對羥基自由基（·OH）的清除能力的測定（鄰二氮菲-亞鐵離子氧化(Feton)法）

新鮮的青錢柳葉自然晾干，用粉碎機(jī)將其粉碎，稱取一定重量的青錢柳粉，用65%甲醇浸泡24小時(shí)，在45℃～55℃溫度、85×103～100×103Hz頻率下，進(jìn)行超聲波浸提2次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，即得青錢柳葉浸膏。

表4 青錢柳總黃酮類化合物的含量

表5 不同產(chǎn)地青錢柳葉中總黃酮類化合物含量比較

把所獲得的青錢柳葉浸膏分別制成一定濃度的溶液，用鄰二氮菲-亞鐵離子氧化(Feton)法測定各提取物對羥基自由基（·OH）的清除能力，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖3

圖3 提取的青錢柳浸膏對羥基自由基（·OH）的抑制率

根據(jù)圖3的線性方程，計(jì)算出65%甲醇的青錢柳葉浸膏清除羥自由基的IC50(g/ml)為1.944×10-4。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，對羥自由基清除能力可通過IC50的大小來判定，IC50越小，說明羥自由基的清除能力越強(qiáng)，抗氧活性效果越好，本實(shí)驗(yàn)的青錢柳葉浸膏對羥自由基清除活性的IC50為1.944×10-4，說明青錢柳葉有較好的清除羥自由基的能力。

三、結(jié)論

青錢柳被稱為醫(yī)學(xué)上的第三棵樹，它具有護(hù)肝、擴(kuò)冠、降低血管脆性，增強(qiáng)心臟收縮，降血糖、降血脂等多種生理活性，有一定程度的抗菌及抑制腫瘤的作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：桂林伯林生物技術(shù)有限公司種植的青錢柳總黃酮含量和香豆素含量都較高，分別為2.8135%和6.9253%，高于湖南省綏寧縣、江西省修水縣的青錢柳葉總黃酮含量和香豆素含量。青錢柳葉提取物對羥基自由基（·OH）的清除能力的測定實(shí)驗(yàn)說明，青錢柳葉有較好的清除羥自由基的能力，是一種較好的天然抗氧化劑。青錢柳的功效已被臨床研究所證實(shí)，說明其具有一定的開發(fā)價(jià)值。研究表明：本實(shí)驗(yàn)所采用的桂林伯林生物技術(shù)有限公司種植的青錢柳具有較高的開發(fā)價(jià)值。

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員.中國植物志：第21卷[M].北京：科學(xué)出版社，1979.

[2]李俊，陸園園，許子競，等.青錢柳中總黃酮成分的研究[J].中藥材，2005,28（12）：1058-1059

[3]KURIHARA H,FUKAMI H.Hypoglycemic action ofCyclo?caryaPaliurus(Batal.)IlJinskajainnormalanddiabeticmice[J]. BiosciBiotechnolBiochem,2003,67(4):877-88.

[4]張莉，陳乃富，吳美.蕨根莖及老嫩葉中黃酮含量的比較[J].食品與發(fā)酵工業(yè).2006,32(11):43-46.

[5]盧文蕓，許文琴，于錫忠等.貴州野生蕨菜中總黃酮含量的測定與分析[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué).2012,40(5):47-49.

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Determining the Content of Coumarin and Flavonoids and Studing the Activities of Antioxidant from Cyclocarya Paliurus Leaf

Liu Xianxian,Chen Gang,Yang Qiqun,Su Yuqing
(1.Department of Chemistry and Pharmacy,Guilin Normal College,Guilin,Guangxi 541001,China; 2.Guilin Berlin BioTechnology Co.,LTD,Guilin,Guangxi 541003,China)

They analyze the content of coumarin and flavonoids in Cyclocarya paliurus leaves,and compare the coumarin and flavonoids content in different cultivation zones of Cyclocarya paliurus leaves,and test in vitro antioxidant activity of Cyclocarya paliurus.The results show that the contents of flavonoids and coumarin in Guilin Berlin biotechnology co.,LTD.,are 2.8135%and 6.9253%higher than those of Suining County,Hunan,and Xiushui County,Jiangxi.Cyclocarya paliurus,scavenging hydroxyl radicals,is a good natural antioxidant which has high value for development.

Cyclocarya paliurus leaf;coumarin;flavonoids;antioxidant activity

O69

A

1001-7070（2016）06-0123-04

(責(zé)任編輯：楊建香)

2016-09-01

2015年廣西教育廳科研項(xiàng)目“基于功能納米材料電化學(xué)傳感器的制備及應(yīng)用研究”(項(xiàng)目編號：KY2015YB368)；桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“青錢柳組培快繁體系的建立及其栽培技術(shù)研究”（項(xiàng)目編號：20140303-2）。

劉賢賢（1963-），女，廣西平樂人，桂林師范高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)與藥學(xué)系教授，主要從事天然產(chǎn)物提取分離與活性篩選及有機(jī)合成。