瓊脂糖膠原防粘連膜的生物相容性研究

向健 田勝慧 柯軍 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 （廣州 510080）

瓊脂糖膠原防粘連膜的生物相容性研究

向健 田勝慧 柯軍 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 （廣州 510080）

目的：旨在研究瓊脂糖膠原防粘連膜的生物相容性，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：依據(jù)GB/T16886-ISO10993相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，通過體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)、遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激試驗(yàn)、急性全身毒性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)、皮下植入試驗(yàn)來評(píng)價(jià)瓊脂糖膠原防粘連膜的生物相容性。結(jié)果：瓊脂糖膠原防粘連膜有輕微細(xì)胞毒性、無致敏性、無皮內(nèi)刺激性、無急性全身毒性、無溶血性、無遺傳毒性，皮下植入后1周和4周，局部組織有炎癥反應(yīng)，植入后12周，炎癥反應(yīng)明顯減輕，植入期內(nèi)可見材料緩慢降解。結(jié)論：該瓊脂糖膠原防粘連膜材料具有良好的生物相容性，符合臨床使用要求。

瓊脂糖膠原防粘連膜 生物相容性 毒性試驗(yàn)

術(shù)后粘連是結(jié)締組織纖維帶與相鄰組織或器官相結(jié)合而形成的異常結(jié)構(gòu)，在外科領(lǐng)域，尤其是腹部手術(shù)中，其發(fā)生率高達(dá)93%，可引發(fā)多種嚴(yán)重并發(fā)癥，直接影響手術(shù)效果[1]。目前，國(guó)內(nèi)外防止術(shù)后粘連的方法主要有兩種，一種是使用藥物以減輕因局部缺血而引起的炎癥并溶解纖維蛋白；另一種是利用醫(yī)療器械類防粘連膜的“短期屏障”作用，隔離在創(chuàng)面與周圍組織之間，防止成纖維細(xì)胞入侵，從而達(dá)到預(yù)防組織粘連的效果[2]。近年來，已有多種高分子材料應(yīng)用于醫(yī)用防粘連膜的開發(fā)，而瓊脂糖作為一種低價(jià)高質(zhì)的天然高分子多糖，在防粘連領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值正受到越來越多的關(guān)注[3]。本研究中的防粘連膜以瓊脂糖和膠原為主要材料制成，由于此類產(chǎn)品屬于長(zhǎng)期植入類醫(yī)療器械，按Ⅲ類高風(fēng)險(xiǎn)醫(yī)療器械管理，其生物相容性和降解產(chǎn)物安全性是藥監(jiān)部門的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)內(nèi)容。因此，本研究參照GB/T16886-ISO10993醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)、遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)、皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)、急性全身毒性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)及皮下植入試驗(yàn)，來評(píng)價(jià)瓊脂糖膠原防粘連膜的生物相容性，為其臨床上的安全使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 供試品

瓊脂糖膠原防粘連膜，規(guī)格為50mm×50mm ×0.07mm，呈白色膜片狀，滅菌包裝。

1.2 供試品浸提液制備

除體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)和皮下植入試驗(yàn)，其余試驗(yàn)的浸提液均按供試品表面積/浸提介質(zhì)為6cm2/mL的比例制備，浸提介質(zhì)為0.9%氯化鈉注射液，浸提條件為37°C下浸提72h。

1.3 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

供試品按6cm2/mL的比例充入含血清培養(yǎng)基（1×），37°C下浸提24h制備供試液。

將已培養(yǎng)48h～72h生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞用消化液消化后加入細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打混勻后在顯微鏡下計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液配制成密度1×105/mL接種于直徑35mm培養(yǎng)皿，每皿2mL，共12皿，置CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)至近匯合單層細(xì)胞形成。棄去原培養(yǎng)液，分別加入空白對(duì)照液（同批含血清培養(yǎng)基（1×）37°C下放置24h）、陰性對(duì)照液（取高密度聚乙烯，用超純水洗凈晾干，紫外線照射過夜后剪碎。按表面積3cm2/mL的比例加入同批含血清培養(yǎng)基（1×）37°C下浸提24h）、陽(yáng)性對(duì)照液（5g/L苯酚溶液）、供試液各3皿，每皿2mL，置CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)72h后將培養(yǎng)皿置，顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，并進(jìn)行定性評(píng)價(jià)。

1.4 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)

試驗(yàn)采用普通級(jí)豚鼠15只，分為試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，試驗(yàn)組采用10只動(dòng)物，陰性對(duì)照組采用5只動(dòng)物，雌雄不限。試驗(yàn)前除去動(dòng)物試驗(yàn)部位被毛，按圖1做3對(duì)左右對(duì)稱的注射點(diǎn)，每注射點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1mL弗氏完全佐劑（FCA）進(jìn)行預(yù)處理。正式試驗(yàn)分為三個(gè)階段：（1）皮內(nèi)誘導(dǎo)階段：按圖1所示的注射部位皮內(nèi)注射相應(yīng)的注射液0.1mL。部位A：空白浸提介質(zhì)與FCA以體積比50:50的比例制備成穩(wěn)定性乳化劑。部位B：試驗(yàn)組注射未經(jīng)稀釋的浸提液；對(duì)照組注射相應(yīng)溶劑。部位C：試驗(yàn)組浸提液以體積比50:50的比例與FCA與溶劑（50%）制備成的乳化劑；對(duì)照組注射相應(yīng)介質(zhì)與佐劑制備成的乳化劑。（2）局部誘導(dǎo)階段：皮內(nèi)誘導(dǎo)后7d，用面積8cm2的無菌紗布?jí)K浸透浸提液局部貼敷于每只豚鼠的肩胛骨內(nèi)側(cè)，覆蓋誘導(dǎo)注射點(diǎn)。用封閉式包扎帶固定，48h后除去包扎帶和紗布?jí)K。同法用空白浸提介質(zhì)操作對(duì)照組動(dòng)物。（3）激發(fā)階段：局部誘導(dǎo)后14d，用浸提液激發(fā)全部試驗(yàn)動(dòng)物。將無菌紗布浸透浸提液，局部貼敷于豚鼠上腹部，用封閉式包扎帶固定，24h后除去包扎帶和紗布。同法用空白浸提介質(zhì)操作對(duì)照組動(dòng)物。除去貼敷紗布?jí)K后24h和48h觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物激發(fā)部位皮膚情況，按Magnusson和Kligman分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每一激發(fā)部位和每一觀察時(shí)間皮膚紅斑和水腫情況進(jìn)行描述并分級(jí)評(píng)價(jià)。

1.5 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)

圖1. 皮內(nèi)注射點(diǎn)

試驗(yàn)采用普通級(jí)新西蘭白兔2只，體重2.4～2.5kg，雌雄不限。試驗(yàn)前12h將兔背部被毛去除干凈，用75%乙醇擦拭去毛區(qū)域，在背部選取10個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)間隔2cm，上部5個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL供試品浸提液，下部5個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL浸提介質(zhì)。注射后24h、48h和72h觀察注射局部及周圍組織的反應(yīng)情況（紅斑、水腫、壞死等），并按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定進(jìn)行評(píng)分。具體記分標(biāo)準(zhǔn)詳見表1。

表1. 皮內(nèi)刺激反應(yīng)記分標(biāo)準(zhǔn)

1.6 急性全身毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)采用SPF級(jí)KM小鼠10只，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，每組5只，雌雄不限。試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組分別尾靜脈注射供試品浸提液和浸提介質(zhì)，注射量為50mL/kg。注射完畢即時(shí)觀察小鼠反應(yīng)，并于4h、24h、48h和72h后觀察兩組動(dòng)物的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡情況，并稱量動(dòng)物體重。

1.7 溶血試驗(yàn)

試驗(yàn)組：取3支試管，每管注入10mL0.9%氯化鈉注射液，按6cm2/mL的比例向每支試管內(nèi)加入所需樣品，搖勻，覆蓋全部材料。

陰性對(duì)照組：取3支試管，每支注入同批號(hào)10mL0.9%氯化鈉注射液。

陽(yáng)性對(duì)照組：取3支試管，每支注入10mL蒸餾水。

將試驗(yàn)管、陰性管、陽(yáng)性管放入37°C水浴中保溫30min，隨后分別加入0.2mL稀釋抗凝兔血，輕輕混勻，繼續(xù)在37°C恒溫水浴中保溫60min。水浴結(jié)束后倒出管內(nèi)液體，800g離心5min。取上清液置于紫外分光光度計(jì)比色皿中，在545nm處測(cè)量吸光度值，并計(jì)算各組3管的平均值。溶血程度按以下公式計(jì)算：

式中：A—供試品液吸光度；

B－陰性對(duì)照液吸光度；

C－陽(yáng)性對(duì)照液吸光度。

1.8 Ames試驗(yàn)

取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無菌小三角瓶中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，在（37±1）°C、（115r/min～125 r/min）振蕩培養(yǎng)10h～12h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活菌數(shù)不少于1×109/mL。融化頂層培養(yǎng)基分裝于無菌小試管，每管2mL，在45°C水浴中保溫。

在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入每種試驗(yàn)菌株新鮮菌液0.1mL，混勻；試驗(yàn)組加入0.1mL供試品浸提液和（或）0.05mLDMSO浸提液，每組三管?；罨M再加10%S9混合液0.5mL，無活化組加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL，再混勻。迅速侵入底層培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使頂層培養(yǎng)基均勻分布在底層上，平放固化，試驗(yàn)組分別設(shè)三個(gè)平行皿。

陰性對(duì)照組加入0.1mL浸提介質(zhì)，活化組再加10%S9混合液0.5mL，無活化組加0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL。陽(yáng)性對(duì)照組分別加入誘變劑（敵克松、疊氮鈉、2-氨基芴和1,8-二羥基蒽醌）0.1mL，活化組再加10%S9混合液0.5mL，無活化組加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL。陰性及陽(yáng)性對(duì)照組分別設(shè)三個(gè)平行皿。全部平皿置37°C倒置培養(yǎng)48～72h觀察結(jié)果，計(jì)算回變菌落數(shù)。

1.9 皮下植入試驗(yàn)

供試品裁剪成約1.5 cm×1.5cm小塊。

試驗(yàn)采用SPF級(jí)SD大鼠15只，每植入周期5只，雌雄不限。使用20g/L戊巴比妥鈉，腹腔注射2.3mL/kg麻醉動(dòng)物，麻醉后對(duì)動(dòng)物背部進(jìn)行剃毛，并用75%乙醇和2%碘酒消毒。使用鈍器解剖法在大鼠背部做皮膚切口，切口部位制備2個(gè)皮下囊，囊的底部距皮膚切口10mm以上，分別植入2個(gè)樣品，植入物之間不可互相接觸，手術(shù)后涂抹碘酒消毒。分別于觀察1周、4周、12周后無痛處死動(dòng)物，對(duì)植入部位周圍組織進(jìn)行肉眼觀察，切取包括植入物及其周圍足夠多未受影響的組織制作病理切片，并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。

2.結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

供試品組至多20%～50%的細(xì)胞呈圓形，疏松貼壁，無胞漿內(nèi)顆粒，偶見細(xì)胞溶解。細(xì)胞毒性計(jì)分為1分，按標(biāo)準(zhǔn)判定，供試品有輕微細(xì)胞毒性。

2.2 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)

斑貼移去后24h及48h，供試品組與陰性對(duì)照組動(dòng)物的激發(fā)部位均未見紅斑及水腫，反應(yīng)評(píng)級(jí)為0級(jí)，按標(biāo)準(zhǔn)判定，供試品無致敏性。

2.3 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)

按規(guī)定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，72h評(píng)分后計(jì)算出浸提液和浸提介質(zhì)的綜合平均記分，最后計(jì)算出浸提液與浸提介質(zhì)的綜合平均記分之差為0，按標(biāo)準(zhǔn)判定，供試品未引起皮內(nèi)反應(yīng)。

2.4 急性全身毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)期間，小鼠無毒性癥狀，無死亡，供試品組體重變化與陰性對(duì)照組相比無顯著性差異（P＞0.05），按標(biāo)準(zhǔn)判定，供試品未引起急性全身毒性反應(yīng)。具體結(jié)果見表2。

2.5 溶血試驗(yàn)

供試品組溶血率小于5%，按標(biāo)準(zhǔn)判定，供試品未引起溶血反應(yīng)。具體結(jié)果見表3。

2.6 Ames試驗(yàn)

供試品對(duì)TA97、TA98、TA100和TA102回變菌落數(shù)，在加與不加S9的條件下，均不超過其自發(fā)回變數(shù)1倍以上，按標(biāo)準(zhǔn)判定，供試品Ames試驗(yàn)為陰性。具體結(jié)果見表4。

表2. 急性全身毒性試驗(yàn)動(dòng)物體重統(tǒng)計(jì)（g）

表3. 溶血試驗(yàn)結(jié)果

表4. 細(xì)菌回復(fù)突變結(jié)果

2.7 皮下植入試驗(yàn)

顯微鏡下觀察可見：供試品于皮下植入1周后（見圖2），樣品呈條帶狀，結(jié)構(gòu)致密；周圍有纖維囊形成，厚度中等；植入物周圍可見淋巴細(xì)胞（＜25個(gè)/HPF），較多漿細(xì)胞（26～50個(gè)/HPF），極少量巨噬細(xì)胞（1～5個(gè)/HPF），偶見多核巨細(xì)胞浸潤(rùn)（1～2個(gè)/HPF），增生纖維組織間可見大量毛細(xì)血管增生（8～20個(gè)/HPF）。植入后4周（見圖3），樣品呈條帶狀，結(jié)構(gòu)較松散；纖維囊厚度中等；植入物周圍可見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（＜25個(gè)/HPF），少量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)（5～10個(gè)/HPF），極少量多核巨細(xì)胞浸潤(rùn)（3～5個(gè)/HPF），增生的纖維組織間偶見毛細(xì)血管增生（1～3個(gè)/HPF）。植入后12周（見圖4），樣品呈條帶狀，結(jié)構(gòu)較松散；纖維囊較薄；植入物周圍炎癥細(xì)胞較1周和4周明顯減少，僅見少量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)（5～10個(gè)/HPF），偶見多核巨細(xì)胞浸潤(rùn)（1～2個(gè)/HPF），增生的纖維組織間偶見毛細(xì)血管增生（1～3個(gè)/HPF）。

圖2. 皮下植入后1周?HE染色（20倍物鏡）

圖3. 皮下植入后4周?HE染色（20倍物鏡）

圖4. 皮下植入后12周?HE染色（20倍物鏡）

3.討論

理想的防粘連材料應(yīng)具有良好的生物相容性、自動(dòng)粘附性、可降解吸收性，以及足夠的體內(nèi)存留時(shí)間，促進(jìn)傷口愈合并將纖維組織增生降至最低程度等特性[4]。本研究中的防粘連膜以瓊脂糖和膠原為主要材料制成，體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示其有輕微細(xì)胞毒性，從已有研究可知，多糖成分具有選擇性抑制纖維細(xì)胞增生的作用，這也是瓊脂糖膠原防粘連膜具有防粘連作用的機(jī)理所在[5]，其細(xì)胞毒性計(jì)分不大于1分，符合臨床使用要求。遲發(fā)型超敏反應(yīng)結(jié)果顯示其無致敏性，致敏試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)受試物存在的殘余單體或低分子物質(zhì)等半抗原是否會(huì)與皮膚的蛋白質(zhì)結(jié)合形成完全抗原而引起皮膚過敏，從試驗(yàn)結(jié)果可知，瓊脂糖膠原防粘連膜不存在致生物體過敏的低分子物質(zhì)。皮內(nèi)刺激試驗(yàn)結(jié)果顯示，家兔背部在注射供試品浸提液后即刻及24h、48h、72h后均未見紅斑及水腫情況，記分為0，與陰性對(duì)照組結(jié)果一致，表明其未引起皮內(nèi)刺激反應(yīng)。一般而言，靜脈注射是材料與機(jī)體接觸的最直接快速的方式，急性全身毒性試驗(yàn)中供試品浸提液直接進(jìn)入血液循環(huán)，若有毒性物質(zhì)，動(dòng)物可立即表現(xiàn)出各種毒性癥狀，結(jié)果可見其未引起急性全身毒性反應(yīng)。溶血試驗(yàn)是細(xì)胞毒性試驗(yàn)的一個(gè)補(bǔ)充性的，而且較靈敏的試驗(yàn)，通過將瓊脂糖防粘連膜直接與稀釋兔血接觸一定時(shí)間，其溶血率為1.5%(+)，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

Ames試驗(yàn)是利用鼠傷寒沙門氏菌，在加入哺乳動(dòng)物肝微粒體酶活化條件下，測(cè)定物質(zhì)誘導(dǎo)回復(fù)突變的能力。本研究Aems試驗(yàn)中，供試品各劑量組對(duì)鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100和TA102的回變菌落數(shù)與自發(fā)回變數(shù)相近，表明瓊脂糖膠原防粘連膜對(duì)鼠傷寒沙門氏菌無致突變作用。皮下植入試驗(yàn)中，材料于1周和4周植入周期結(jié)束后，鏡下觀察病理切片可見植入局部周圍有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。12周植入周期結(jié)束后，炎癥反應(yīng)明顯減輕；鏡下觀察可見，隨著植入時(shí)間的延長(zhǎng)，材料從致密變?yōu)槭杷?，這符合瓊脂糖的可降解性。有研究指出，由于動(dòng)物體內(nèi)缺乏降解瓊脂糖的酶，其體內(nèi)降解主要依靠巨噬細(xì)胞的吞噬作用[6]。Varoni等[7]進(jìn)行的試驗(yàn)也表明瓊脂糖的降解是一個(gè)相對(duì)緩慢的過程，這于其致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和降解機(jī)制有關(guān)。綜上所述，瓊脂糖膠原防粘連膜具有良好的生物相容性及可降解性，在術(shù)后防粘連方面具有廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。但瓊脂糖在體內(nèi)的降解產(chǎn)物及代謝途徑，其與細(xì)胞之間的相互作用機(jī)理等問題丞待進(jìn)一步深入研究，以為其臨床上的安全使用提供更完善的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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The Biocompatibility Evaluation of Agarose Collagen Anti-adhesive Film

XIANG Jian TIAN Sheng-hui KE Jun Guangdong Medical Devices Quality Surveillance and Test Institute (Guangzhou 510080)

Absract: Objective: To explore the biocompatibility of agarose collagen anti-adhesive film to provide experimental bases for clinical applications. Methods: According to the standard GB/T16886-ISO10993, to evaluate the biocompatibility of agarose collagen anti-adhesive film using the cytotoxicity test, guinea pig maximization test, animal Intracutaneous (intradermal) reactivity test, acute systemic toxicity test, haemolysis test, Ames test and subcutaneous implant test . Results: There was mild cytotoxicity, no sensitization, no intradermal reactivity, no acute systemic toxic reactivity, no hemolysis and no mutagenicity in Ames test. And, the result of subcutaneous implant test showed that the samples had local tissue irritation on 1 and 4 weeks after implantation, and mild irritation on 12 weeks. Conclusions: These results suggest that agarose collagen anti-adhesive film has favourable biocompatibility and meets the requirements for clinical applications.

agarose collagen anti-adhesive film, biocompatibility, toxicity test

1006-6586(2016)06-0048-06

R318.08

A

2016-01-22

向健，助理工程師

廣東省醫(yī)療產(chǎn)品生物安全評(píng)價(jià)科技服務(wù)平臺(tái)（2012B011000003）