HPLC法同時(shí)測定不同產(chǎn)地羊蹄藥材中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量

何盛江，聶 陽，陳 剛，焦豪妍，楊燕軍（.廣東省中藥研究所，廣州 5050；.解放軍第3醫(yī)院，浙江寧波 35040）

HPLC法同時(shí)測定不同產(chǎn)地羊蹄藥材中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量

何盛江1＊，聶 陽1#，陳 剛2，焦豪妍1，楊燕軍1（1.廣東省中藥研究所，廣州 510520；2.解放軍第113醫(yī)院，浙江寧波 315040）

目的：建立同時(shí)測定羊蹄藥材中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的方法，并比較不同產(chǎn)地藥材各成分含量差異。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent C18，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為254 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果：大黃素、大黃酚、大黃素甲醚檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.04～24.48 μg/ml（r＝0.999 7）、2.00～24.00 μg/ml（r＝0.999 5）、1.02～12.24 μg/ml（r＝0.999 8）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為97.09%～102.65%（RSD＝1.79%，n＝9）、97.10%～100.31%（RSD＝0.97%，n＝9）、95.45%～100.18%（RSD＝1.45%，n＝9）。結(jié)論：該方法檢測簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于羊蹄藥材中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的同時(shí)測定；不同產(chǎn)地藥材中各成分含量差異顯著。

高效液相色譜法；羊蹄；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚；含量測定

羊蹄為蓼科屬植物皺葉酸模Rumex crispus L.或羊蹄Rumex japonicus Houtt.的果實(shí)，又名東方宿、敗毒菜根、牛大黃等，以根或全草入藥，具有殺蟲、活血止血、清熱解毒等功效，可外用于治療外痔、急性乳腺炎、黃水瘡、皮癬等癥[1-2]。羊蹄主要含有大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、酸模素、槲皮素等化學(xué)成分，其中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚為主要藥效成分[3-5]。目前，各地羊蹄藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無含量測定項(xiàng)，而文獻(xiàn)報(bào)道僅以高效液相色譜法（HPLC）測定藥材中大黃素或大黃酚單一成分的含量[6-7]。因此，筆者采用HPLC法同時(shí)測定不同產(chǎn)地羊蹄藥材中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，為更全面地控制藥材質(zhì)量提供可靠方法。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀，包括DAD二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率：200 W，頻率：10 kHz）。

1.2 試劑

大黃素對照品（批號：0756-200110，純度＞98%）、大黃酚對照品（批號：110796-201017，純度＞98%）、大黃素甲醚對照品（批號：110758-200610，純度＞98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

羊蹄藥材購自廣州清平中藥材市場（見表1），經(jīng)解放軍第113醫(yī)院陳剛副主任藥師鑒定為蓼科植物羊蹄R.japonicus Houtt.的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20 μl。

表1 羊蹄藥材來源Tab 1 Origin of R.japonicus

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取大黃素對照品10.2 mg、大黃酚對照品10.0 mg和大黃素甲醚對照品5.1 mg，分別置于50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得大黃素、大黃酚、大黃素甲醚質(zhì)量濃度分別為204、200、102 μg/ml的單一對照品貯備液。精密量取上述單一對照品貯備液適量，置于同一10 ml量瓶中，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 將藥材粉碎，過40目篩，精密稱取0.20 g，置于具塞錐形瓶中，加甲醇25 ml，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，得續(xù)濾液。精密量取上述續(xù)濾液5 ml，置于圓底燒瓶中，揮去甲醇，加8%鹽酸溶液10 ml，超聲處理5 min，再加三氯甲烷10 ml，加熱回流l h，冷卻，移至分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液用三氯甲烷提取2次，每次10 ml。三氯甲烷液依次以鋪有無水硫酸鈉2 g的漏斗濾過，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，在此色譜條件下，對照品和樣品中其他成分均可達(dá)到基線分離，與相鄰色譜峰的分離度均＞1.5；理論板數(shù)以大黃素峰計(jì)≥3 000。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖A.供試品；B.混合對照品；1.大黃素；2.大黃酚；3.大黃素甲醚Fig 1 HPLC chromatogramA.test sample；B.mixed reference substance；1.emodin；2.chrysophanol；3. physcion

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下大黃素、大黃酚、大黃素甲醚單一對照品貯備液各0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml，分別置于10 ml量瓶中，加流動相定容，制成系列單一對照品溶液。精密量取上述系列單一對照品溶液各20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以大黃素、大黃酚、大黃素甲醚質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得大黃素、大黃酚、大黃素甲醚回歸方程分別為y＝44.737x－2.987 8（r＝0.999 7）、y＝66.738x－12.416（r＝0.999 5）、y＝34.554x－2.770 2（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.04～24.48、2.00～24.00、1.02～12.24 μg/ml。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.17%、0.89%、1.02%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.48%、0.27%、1.18%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（編號：1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為1.711、1.102、0.456 mg/g，RSD分別為1.42%、1.55%、0.87%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（編號：1）適量，共6份，分別加入低、中、高質(zhì)量的大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.9 樣品含量測定

取7批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery test（n＝9）

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 4 Determination results of contents in samples（n＝3，mg/g）

3 討論

藥材中的大黃素、大黃酚、大黃素甲醚以結(jié)合態(tài)、游離態(tài)形式存在[8]，因此樣品的前處理是保證含量測定結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵。本試驗(yàn)采用甲醇回流提取，酸性甲醇水解，水解溫度比在酸水中低，酚類成分破壞少，加上去除了萃取和蒸干步驟，理論上測定的含量更接近其真實(shí)含量[9]。

參考藥典[8]及文獻(xiàn)[10]方法，HPLC法測定以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相，經(jīng)過多次預(yù)試驗(yàn)優(yōu)化，確定梯度洗脫程序。結(jié)果表明，本試驗(yàn)所建立的HPLC法在16 min內(nèi)可完成測定，大黃素、大黃酚的保留時(shí)間約為9.8、12.3 min，兩者分離效果良好，不僅耗時(shí)短、操作簡便、重復(fù)性好，而且結(jié)果可靠。

本試驗(yàn)對全國7個(gè)產(chǎn)地羊蹄藥材中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量進(jìn)行測定，結(jié)果平均含量分別為1.41、1.00、0.35 mg/g，RSD分別為32.06%、20.96%、38.51%，表明不同產(chǎn)地羊蹄藥材中各成分含量差異顯著。筆者采購的全國7個(gè)產(chǎn)地羊蹄藥材為其根部，而仔細(xì)觀察藥材卻發(fā)現(xiàn)各地藥材根部上部保留的莖長短不一，這可能導(dǎo)致含量差異，參考與羊蹄同屬的大黃藥材的根頭、根身和根尾等部位所含的大黃素、大黃酚等成分的含量差別較大，含量順序?yàn)橐来芜f減[11]，這可印證羊蹄藥材不同部位含量存在差異。有研究發(fā)現(xiàn)，羊蹄的根中大黃素含量高于根莖中含量，酸性土壤條件下羊蹄根中大黃素的含量明顯高于堿性土壤條件[6]。

綜上所述，本方法檢測簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于羊蹄藥材中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的同時(shí)測定。

[1] 中華本草編撰委員會.中華本草：第2冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：729.

[2] 吳琪，黃璐，茹夢，等.羊蹄化學(xué)成分及其抗腫瘤活性研究[J].藥學(xué)與臨床研究，2013，21（3）：227.

[3] 邱小梅，鄒劍成，王定勇.羊蹄根的化學(xué)成分研究[J].中國藥房，2009，20（9）：681.

[4] 鄧立華，劉丹，雷鈞濤.羊蹄根有效部位的初步分離[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30（4）：197.

[5] 林菲娟.正交試驗(yàn)法優(yōu)選羊蹄中游離蒽醌的提取工藝[J].中藥材，2012，35（9）：1 521.

[6] 周子曄，林迦勒，林觀樣.不同土壤性質(zhì)下羊蹄各部位大黃素含量的比較[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30（2）：428.

[7] 鄒劍成，邱小梅，王定勇.RP-HPLC法測定羊蹄根中大黃酚的含量[J].中藥材，2009，32（7）：1 081.

[8] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：22、237.

[9] 張力，馬靜，歐洋，等.四川產(chǎn)亞大黃的鑒別及其大黃素、大黃酚的測定[J].華西藥學(xué)雜志，2015，30（3）：322.

[10] 衛(wèi)瑩芳，謝達(dá)溫，萬麗，等.HPLC梯度洗脫法同時(shí)測定決明子中櫻黃決明素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2009，11（6）：868.

[11] 王榮，賈正平，張強(qiáng)，等.甘肅道地藥材大黃不同部位的指紋圖譜研究[J].中國藥房，2012，23（1）：39.

（編輯：張 靜）

Simultaneous Determination of Emodin，Chrysophanol and Physcion in Rumex japonicus from Different ProducingAreas by HPLC

HE Shengjiang1，NIE Yang1，CHEN Gang2，JIAO Haoyan1，YANG Yanjun1（1.Guangdong Research Institute of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510520，China；2.Chinese PLA 113 Hospital，Zhejiang Ningbo 315040，China）

OBJECTIVE：To establish a method for contents determination of emodin，chrysophanol and physcion in Rumex japonicus，and compared the differences of components in medicinal materials from different producing areas.METHODS：HPLC was performed on the column of Agilent C18with mobile phase of methanal-0.1%phosphoric acid solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 254 nm，column temperature was 35℃，and injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range was 2.04-24.48 μg/ml for emodin（r＝0.999 7），2.00-24.00 μg/ml for chrysophanol（r＝0.999 5）and 1.02-12.24 μg/ml for physcion（r＝0.999 8）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 97.09%-102.65%（RSD＝1.79%，n＝9），97.10%-100.31%（RSD＝0.97%，n＝9）and 95.45%-100.18%（RSD＝1.45%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple with high precision，stability and reproducibility，and can be used for the simultaneous determination of emodin，chrysophanol and physcion in R.japonicas.There are obvious differences in medicinal materials from different producing areas.

HPLC；Rumex japonicus；Emodin；Chrysophanol；Physcion；Content determination

R927.2

A

1001-0408（2016）33-4719-03

2015-11-30

2016-01-14）

＊副主任藥師，博士。研究方向：中藥新藥與新劑型。電話：020-28854995。E-mail：hesj@gdyzy.edu.cn

#通信作者：副主任藥師。研究方向：中藥活性成分與新藥。電話：020-28854883。E-mail：drugs999@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.37