HPLC法同時測定薜荔中的蘆丁和綠原酸含量

張朝輝，丁芳林

(湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410127)

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HPLC法同時測定薜荔中的蘆丁和綠原酸含量

張朝輝，丁芳林

(湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410127)

采用HPLC法對薜荔不同部位中的蘆丁和綠原酸含量進行了測定。方法采用InertSustain C18色譜柱，乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動相，對薜荔葉、薜荔殼和薜荔籽中的蘆丁和綠原酸含量進行了測定比較。結(jié)果表明：蘆丁和綠原酸在25～200μg/mL范圍內(nèi)的濃度與峰面積均呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為101.4%和99.2%；薜荔不同部位中綠原酸的含量順序為：薜荔葉>薜荔殼>薜荔籽；薜荔葉中蘆丁含量遠遠大于薜荔殼和薜荔籽。本方法簡單、快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可以明確了解薜荔中不同藥用部位綠原酸及蘆丁的含量差異，這將為薜荔的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

薜荔；蘆?。痪G原酸；高效液相色譜法

薜荔是?？崎艑僦参颷1]，主產(chǎn)我國，分布廣，野生資源極為豐富，其生長不擇土壤、氣候，耐干旱，極易人工種植，是一種很有開發(fā)潛力的安全、健康性新型天然植物資源。

薜荔含有豐富的黃酮類物質(zhì)，廣泛分布在薜荔的葉、種子等部位[2-3]，具有抗動脈硬化、降膽固醇、抗菌、抗炎、增強免疫、祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)等作用[4-5]。魏偉等[6]對薜荔的干燥花序托進行化學(xué)成分研究，確定其化學(xué)成分中存在蘆丁和綠原酸。綠原酸具抗菌、抗病毒、抗氧化作用，蘆丁具抗氧化、抗病毒、舒張血管作用。薜荔中蘆丁和綠原酸的含量測定對薜荔的開發(fā)有非常重要的意義。何鵬等[7]對廣王不留行(薜荔的干燥花序托)中的蘆丁和綠原酸含量進行了同時測定，目前關(guān)于同時測定薜荔不同藥效部位中綠原酸和蘆丁含量的研究尚未見報道。

本文在前人研究的基礎(chǔ)上，選取了薜荔中作為涼粉食材的薜荔殼和薜荔籽以及最易采摘且來源最豐富的藥用活性部位薜荔葉作為研究對象，對其中的蘆丁和綠原酸含量進行了測定和比較，以期了解不同藥用部位中綠原酸及蘆丁的含量是否有差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：薜荔果采集于湖南省永州市祁陽縣肖家村鎮(zhèn)八廟村，薜荔葉采集于湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院藤本研究基地，樣品均經(jīng)湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院藤本所專家進行鑒定。

試劑：蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院)，綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所)，乙腈(色譜純，美國TEDIA公司)，其它試劑均為分析純，所用水均為超純水。

1.2 儀器

LC -20AT 高效液相色譜儀 (配備 LC -20AD高壓泵、SPD-M20A 檢測器、 LC-solution工作站、CTO-20A柱溫箱、SIL -20A自動進樣器, 日本島津公司)，HH-600數(shù)顯三用恒溫水浴箱(無錫沃信儀器有限公司)，KQ-100E型超聲波(昆山市超聲儀器有限公司)，F(xiàn)W177型中草藥粉碎機(上海隆拓儀器設(shè)備有限公司)，ZOOMWO-L系列超純水系統(tǒng)，美國奧豪斯CP64C分析天平(天津市順諾儀器科技有限公司)。

1.3 色譜條件

色譜柱為InertSustain C18柱(4.6mm×250 mm，5μm)，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，柱溫為35 ℃。檢測波長：綠原酸326 nm，蘆丁254 nm。

流動相：流動相采用410 mL 0.2%磷酸水溶液，用0.45 μm水膜過濾，與90 mL乙腈混勻，超聲脫氣15 min備用。

1.4 對照品儲備溶液的制備

先準(zhǔn)確稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的綠原酸和蘆丁對照品各10 mg，加甲醇溶解定容至1 mL，分別配成1 mg/mL的綠原酸和蘆丁儲備液，再由標(biāo)準(zhǔn)儲備液根據(jù)需要配成所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)儲備液及由其稀釋而成的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液均置于4 ℃冰箱中保存。

1.5 樣品前處理

1.5.1 薜荔葉的處理

將采取的新鮮薜荔葉置于70 ℃烘箱中干燥，粉碎，過40目篩。稱取干粉1.00 g，加入60%的乙醇水溶液定容至100 mL，浸提1 h，在75 ℃水浴超聲1 h。超聲條件為：頻率40 kHz，功率100 W。然后趁熱過濾，濾液冷卻至室溫用60%乙醇定容至100 mL。提取液過0.45μm有機膜，備測。

1.5.2 薜荔籽的提取

將摘取的新鮮薜荔果切成小塊，將果殼和薜荔籽分離，薜荔籽置于70 ℃烘箱中烘干，粉碎，過40目篩。稱取干粉1.00 g，加入60%的乙醇水溶液定容至100 mL，浸提1 h，在75 ℃超聲1 h。超聲條件為：頻率40 kHz，功率100 W。趁熱過濾，濾液冷卻至室溫用60%乙醇定容至100 mL。提取液過0.45μm有機膜，備測。

1.5.3 薜荔殼的提取

將摘取的新鮮薜荔果切成小塊，將果殼和薜荔籽分離，果殼置于70 ℃烘箱中烘干，粉碎，過40目篩。稱取干粉1.00 g，加入60%的乙醇水溶液定容至100 mL，浸提1h，在75℃超聲1 h。超聲條件為：頻率40 kHz，功率100 W。趁熱過濾，濾液冷卻至室溫用60%乙醇定容至100 mL。提取液過0.45μm有機膜，備測。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

資料[7-8]，考察了不同流動相對分離的影響。結(jié)果表明，采用梯度淋洗分離效果好，但是流動相組成復(fù)雜且基線不穩(wěn)定。本文在反復(fù)改變有機相和水相配比的基礎(chǔ)上，采用乙腈-0.2%磷酸水溶液(體積比18∶82)作流動相，獲得了合適的分析時間和滿意的分離效果。在波長選擇上，比較綠原酸和蘆丁的紫外光譜圖，發(fā)現(xiàn)兩者的紫外吸收情況相差很遠，很難選取統(tǒng)一波長進行檢測，實驗中采用PDA做檢測器，選取綠原酸的檢測波長為326 nm，蘆丁的檢測波長為254 nm，獲得了理想的實驗結(jié)果。

2.2 提取條件的選擇

提取條件對實驗結(jié)果有很大的影響。常用的提取方法有回流提取、索氏提取[9]等，但這些方法有操作繁瑣且耗時等缺點。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，采用浸提法和超聲提取法相結(jié)合，樣品先用60%的乙醇水溶液浸提，然后再進行超聲提取，此方法不僅操作簡便，縮短了提取時間，且獲得了滿意的提取效果。

2.3 線性關(guān)系的考察

分別精密移取兩種對照品儲備溶液0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL和2.0 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為25、50、100、150和200 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別精密吸取上述溶液 20 μL注入色譜儀，按上述色譜條件進行測定，色譜圖見圖1。利用色譜峰面積對溶液濃度進行線性回歸，得到蘆丁和綠原酸的線性回歸方程分別為：Y= 36 773X-21 042和Y= 10 114.0X+10 357；相關(guān)系數(shù)分別為：0.999 6和0.999 8；兩者在25～200 μg/mL范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

a. 綠原酸; b. 蘆丁 圖1 200μg/mL蘆丁和綠原酸混合標(biāo)樣色譜圖

2.4 精密度

取同一濃度混合對照品溶液，在同樣色譜條件下，連續(xù)進樣5次，測定綠原酸和蘆丁峰面積的RSD分別為0.49%和0.38%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性

取同一經(jīng)過處理后的薜荔葉樣品，分別在0、4、8、12 h測定綠原酸和蘆丁的峰面積，綠原酸和蘆丁的 RSD分別為 0.55%和 0.84%。說明樣品液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性

取薜荔葉粉末5份，按薜荔葉的制備方法制備樣品，測定樣品含量，綠原酸和蘆丁的 RSD 分別為 0.93%和 1.27%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率

精密稱取已知含量的薜荔葉樣品5份，分別精密加入一定量的綠原酸對照品和蘆丁對照品，按薜荔葉的制備方法制備樣品，進樣測定，計算回收率。結(jié)果表明，綠原酸的平均回收率為99.2%(RSD=1.2%),蘆丁的平均回收率為101.4%(RSD=2.0%)。

2.8 樣品測定

分別精密稱取薜荔葉、薜荔籽和薜荔殼粉末各3 份，按1.5制備方法制得供試品溶液，按上述色譜條件，進樣20 μL注入液相色譜儀進行測定。結(jié)果分析中通過比較目標(biāo)物的紫外光譜圖對樣品色譜峰進行定性和純度比對，結(jié)果見圖2和圖3。通過比對，說明2個目標(biāo)物的紫外光譜圖和峰純度基本與標(biāo)樣一致。定量測定結(jié)果見色譜圖4和表1。由圖4和表1可知，薜荔不同部位中綠原酸的含量順序為：薜荔葉>薜荔殼>薜荔籽；薜荔不同部位中蘆丁含量測定情況為：薜荔葉中蘆丁含量為0.917%，但是薜荔殼和薜荔籽中的蘆丁在本方法中沒有被檢出。參考文獻資料，何鵬等[7]測得不同批次廣東產(chǎn)薜荔的干燥花序托(俗稱果實，包括薜荔殼和薜荔籽)中蘆丁含量基本在0.04%～0.07%之間，這說明薜荔殼和薜荔籽中蘆丁的含量非常低，薜荔葉中的蘆丁含量遠遠大于薜荔殼和薜荔籽。

表1 薜荔不同部位中綠原酸和蘆丁含量 %

3 討論與結(jié)論

(1)實驗結(jié)果表明，薜荔不同部位中綠原酸的含量比較為：薜荔葉>薜荔殼>薜荔籽；薜荔不同部位中蘆丁含量比較為：薜荔葉中的蘆丁含量較高，薜荔殼和薜荔籽中蘆丁的含量非常低，薜荔葉中的蘆丁含量遠遠大于薜荔殼和薜荔籽。其中薜荔殼和薜荔籽中的蘆丁可能因為濃度太低，在現(xiàn)有提取方法中沒有被檢出，要獲得準(zhǔn)確含量，還需要進一步濃縮。

(2) 采用高效液相色譜法對薜荔不同部位中蘆丁和綠原酸含量進行了檢測和比較，該法簡單、快速、準(zhǔn)確，可以明確了解薜荔中不同藥用部位綠原酸及蘆丁的含量差異，為薜荔的質(zhì)量評價及其資源合理開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

(3) 薜荔是一種很有開發(fā)潛力的安全、健康性新型天然植物資源，但其化學(xué)成分和藥理作用均很不明確，使其未能科學(xué)應(yīng)用，造成了該植物資源的浪費。因此有必要對薜荔中的化學(xué)成分和藥理活性進行深入研究，為進一步開發(fā)國家藥用植物資源，擴大其應(yīng)用范圍提供研究基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 吳松成. 薜荔的開發(fā)利用及栽培技術(shù)[J]. 林業(yè)科技通訊, 2001(1):38.

[2] 裴健儒, 姚茂君. 薜荔的營養(yǎng)成分及其功能性應(yīng)用的探討[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2009, (1):64-66.

[3] 唐翠娥, 梁瑞紅, 劉偉，等. 薜荔概述及研究進展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2007, (2):18-19.

[4] 延璽, 劉會青, 鄒永青，等. 黃酮類化合物生理活性及合成研究進展[J]. 有機化學(xué), 2008,28(9):1534～1544.

[5] 李鳳林, 李青旺, 馮彩寧，等. 天然黃酮類化合物提取方法研究進展[J]. 中國食品添加劑, 2008, (5):60-64.

[6] 魏偉, 范春林, 王貴陽，等. 廣王不留行的化學(xué)成分研究[J]. 中草藥.2014, 45(5): 615-621。

[7] 何鵬, 王英, 金建平, 等. HPLC同時測定廣東王不留行中綠原酸和蘆丁的含量[J].中國現(xiàn)代中藥, 2014, 16(12):992-995.

[8] 杜倩, 湯道權(quán), 劉曉，等.藥用植物蓬子菜不同藥用部位中蘆丁及綠原酸的含量比較[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(24):14632-14633.

[9] 薛曉麗. 高效液相色譜法測定金銀花中綠原酸的含量[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010 (2 ): 296-297.

Simultaneous Determination for the Contents of Rutin and Chlorogenic Acid inFicuspumilaL. by HPLC

Zhang Zhaohui, Ding Fanglin

(Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic College, Changsha 410127, China)

An HPLC method was developed for the determination of the contents of rutin and chlorogenic acid in different parts ofFicuspumilaL. An InertSustain C18column was used. The mobile phase consisted of acetonitrile and 0.2%aqueous phosphoric acid. The contents of rutin and chlorogenic acid in leaf, shell and seed were compared.The results showed that concentrations of rutin and chlorogenic acid in the range of 25～200μg/mL had a good linear relationship with peak area, the average recovery were 101.4% and 99.2% for rutin and chlorogenic acid respectively; the content sequence of chlorogenic acid in different parts ofFicuspumilaL. is as follows: leaf> shell> seed; the rutin content in leaf is far greater than in shell and seed. the method is simple, rapid, accurate, reproducible and can be used to clearly understand the content differences of chlorogenic acid and rutin in different parts ofFicuspumilaL., which will provide a theoretical basis for the further and rational development and utilization ofFicuspumilaL.

FicuspumilaL.; rutin; chlorogenic acid; HPLC

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.05.010

2016-03-12

湖南省科技計劃一般項目(2014NK3053)；湖南省教育廳科學(xué)研究一般項目(15C0807)。

張朝輝(1980—), 女, 碩士, 從事色譜與藥物分析研究。E-mail:zhangzhaohui113@126.com

R284.1

A

1006-9690(2016)05-0037-04