響應面法優(yōu)化合萌總黃酮提取工藝

朱媛媛，趙 明, 2*，歐陽臻，蔡建明，張 成，周文菊，劉江弟，楊 倩，王琳瑋

(1. 江蘇大學 藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2. 江蘇大學附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

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響應面法優(yōu)化合萌總黃酮提取工藝

朱媛媛1，趙 明1, 2*，歐陽臻1，蔡建明1，張 成1，周文菊1，劉江弟1，楊 倩1，王琳瑋1

(1. 江蘇大學 藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2. 江蘇大學附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

目的：利用響應面法優(yōu)化合萌中總黃酮的提取工藝條件。方法：通過單因素試驗分別考察提取時間、乙醇體積分數(shù)、液固比、提取溫度及提取次數(shù)對合萌總黃酮得率的影響，并選取提取時間、乙醇體積分數(shù)、液固比、提取溫度為影響因子，應用響應面法優(yōu)化提取工藝。結果：合萌總黃酮的最佳提取條件為：提取時間60 min，乙醇濃度65%，液固比(g∶mL)25∶1，提取溫度90 ℃，在此條件下，合萌總黃酮得率為4.08 mg/g，接近模型預測值4.11 mg/g。結論：響應面法在一定程度上可以提高合萌總黃酮得率，表明響應面法用于合萌總黃酮提取工藝的優(yōu)化具有可行性。

合萌；總黃酮；響應面法

合萌為豆科蝶形花亞科合萌屬植物合萌(AeschynomeneindicaL.)的干燥全草，又名田皂角，俗稱水槐。味甘、苦，性微寒，歸肺、胃經(jīng)。全草入藥，具有清熱利濕，祛風明目，通乳等功效。能治水腫腹脹、腫毒、濕疹、膽囊炎、尿道感染或結石、腎炎水腫等[1]。分析研究表明，黃酮類化合物具有抗菌、抗氧化自由基活性、保肝作用、抗骨質疏松作用、抗腫瘤等多種藥理作用[2-6]，但合萌中黃酮類化合物的研究尚未有文獻報道。本實驗首先采用單因素試驗分析提取時間、乙醇體積分數(shù)、液固比、提取溫度及提取次數(shù)對合萌總黃酮得率的影響，并選取提取時間、乙醇體積分數(shù)、液固比、提取溫度4個因素為影響因子，采用Box-Behnken設計建立數(shù)學模型，以合萌總黃酮得率為響應值，采用Design Expert 軟件進行數(shù)值分析，得出最優(yōu)提取工藝條件，為合萌總黃酮的進一步開發(fā)和研究提供參考。

1 實驗儀器和材料

1.1 儀器與設備

SHB-111循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；HHS-1恒溫水浴鍋，上海浦東躍新科學儀器廠；AE240分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限司；1810-B型自動雙重純水蒸餾器，上海申立玻璃儀器公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海恒科學儀器有限公司；UV-2102PCS型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)分析儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司；H66 MC超聲清洗機，無錫超聲儀器廠。

1.2 藥品與試劑

合萌(采收于江蘇省丹陽市導墅鎮(zhèn)，經(jīng)歐陽臻教授鑒定為合萌AeschynomeneindicaL.)；蘆丁對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707；三氯化鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙醇等試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；蒸餾水為實驗室自制。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品15.2 mg，置25 mL容量瓶中，加70%乙醇使之溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品母液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

干燥的合萌全草經(jīng)粉碎，過20目篩，備用。精密稱取合萌干燥粉末2.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，按照一定的提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)、液固比、提取次數(shù)進行回流提取，趁熱抽濾，合并提取液，將濾液濃縮后，轉移至50 mL的容量瓶，定容，搖勻，作為供試品溶液，備用。

2.2 標準曲線的繪制

精密量取蘆丁對照品溶液6份(0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL)，分別加入25 mL容量瓶中，加70%乙醇至6 mL，加入5% 亞硝酸鈉1 mL，搖勻，放置6 min，再加10% 硝酸鋁1 mL，搖勻，放置6 min，再加1 mol/L 氫氧化鈉10 mL，70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，于510 nm波長下測吸光度。以對照品溶液濃度為橫坐標x，吸光度測定值為縱坐標y，繪制標準曲線，如圖1所示。用最小二乘法計算得到回歸方程為y=0.0129x-0.0373，r=0.9996。在12.16～60.80 μg/mL范圍內蘆丁對照品濃度與吸光度呈良好的線性關系。

圖1 蘆丁標準曲線

2.3 合萌總黃酮含量測定

精密量取供試品溶液5.0 mL，根據(jù)亞硝酸鈉-硝酸鋁法，即“2.2”項下的方法測定吸光度，計算合萌總黃酮含量，按以下公式計算合萌總黃酮得率。

式中：P 為合萌總黃酮的得率(mg/g)，C為從回歸方程計算求得樣品溶液的濃度(μg/mL)，V1為樣品溶液定容體積(mL)，V2為提取液定容體積(mL)，V3為取樣溶液體積(mL)，M為合萌粉末質量(g)。

2.4 單因素試驗設計

2.4.1 提取溫度對合萌總黃酮得率的影響

以合萌總黃酮得率為指標，在固定提取時間60min，乙醇體積分數(shù)70%，液固比20∶1，提取次數(shù)2次的條件下，考察不同提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)對合萌總黃酮得率的影響。總黃酮得率隨提取溫度變化結果如圖2所示。

結果表明，當溫度低于80 ℃時， 隨溫度的上升，總黃酮得率變化不大，當溫度高于80℃時，隨溫度的上升總黃酮得率顯著升高，并在90 ℃時達到最高值，但當溫度高于90 ℃時，總黃酮得率反而下降，這可能是由于溫度過高導致可溶性蛋白變性，影響細胞的破裂，導致總黃酮溶出減少，從而降低了合萌總黃酮得率[7]。因而確定最佳提取溫度為90 ℃。

圖2 提取溫度對合萌總黃酮得率的影響

2.4.2 提取時間對合萌總黃酮得率的影響

以合萌總黃酮得率為指標，在固定提取溫度90 ℃，乙醇體積分數(shù)70%，液固比20∶1，提取次數(shù)2次的條件下，考察不同提取時間(30、45、60、75、90min)對合萌總黃酮得率的影響?？傸S酮得率隨提取時間變化結果如圖3所示。

結果表明：隨時間增加，合萌總黃酮提取率先上升后下降，60min時達到最高點，提取時間過長或過短時，合萌總黃酮得率均較低。這可能是由于提取時間過短時，合萌總黃酮提取不充分，而時間過長時，合萌總黃酮受熱時間過長，其中主要成分部分發(fā)生分解。因而確定最佳提取時間為60min。

圖3 提取時間對合萌總黃酮得率的影響

2.4.3 乙醇體積分數(shù)對合萌總黃酮得率的影響

以合萌總黃酮得率為指標，在固定提取溫度90 ℃，提取時間60min，液固比20∶1，提取次數(shù)2次的條件下，考察不同的乙醇體積分數(shù)(50%、60%、70%、80%、90%)對合萌總黃酮得率的影響?？傸S酮得率隨乙醇體積分數(shù)變化結果如圖4所示。

結果表明：當乙醇體積分數(shù)較小時，合萌總黃酮得率隨乙醇體積分數(shù)的增加而上升，且當乙醇體積分數(shù)為70%時達到最高；當乙醇體積分數(shù)大于70%時，合萌總黃酮得率隨乙醇體積分數(shù)的增加反而下降，且下降幅度很大。造成這種現(xiàn)象可能是由于乙醇體積分數(shù)過大時，醇溶性雜質或色素等成分溶出增加，從而使合萌總黃酮得率下降。因而確定最佳乙醇體積分數(shù)為70%。

圖 4 乙醇體積分數(shù)對合萌總黃酮得率的影響

2.4.4 液固比對合萌總黃酮得率的影響

以合萌總黃酮得率為指標，在固定提取溫度90 ℃，提取時間60min，乙醇體積分數(shù)70%，提取次數(shù)2次的條件下，考察不同液固比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)對合萌總黃酮得率的影響?？傸S酮得率隨液固比變化結果如圖5所示。

結果表明，合萌總黃酮得率隨液固比的增加而增加，但當液固比大于25時，總黃酮得率趨于穩(wěn)定。在實際操作中，既要考慮總黃酮得率，又要避免溶劑浪費，因而確定最佳液固比為25∶1。

圖 5 液固比對合萌總黃酮得率的影響

2.4.5 提取次數(shù)對合萌總黃酮得率的影響

以合萌總黃酮得率為指標，在固定提取溫度90 ℃，提取時間60min，乙醇體積分數(shù)70%，液固比25:1的條件下，考察不同的提取次數(shù)(1、2、3、4次)對合萌總黃酮得率的影響?？傸S酮得率隨提取次數(shù)變化結果如圖6所示。

結果表明：合萌總黃酮得率隨提取次數(shù)增加而增加，但增幅逐漸減小。從圖中可以看出提取3次后，曲線基本趨于穩(wěn)定，即總黃酮得率趨于穩(wěn)定，因而視作提取4次后已提取完全。經(jīng)計算得知提取一次后轉移率為73.98%，提取2次后轉移率達到91.02%，這表明提取兩次后，合萌中總黃酮已基本轉移完全。因而確定最佳提取次數(shù)為 2 次。

圖 6 提取次數(shù)對合萌總黃酮得率的影響

2.5 響應面試驗設計優(yōu)化合萌總黃酮提取工藝

2.5.1 響應面試驗設計因素水平

依據(jù)單因素試驗結果確定因素水平范圍，利用Design-ExpertSoftware8.0.6為輔助手段設計響應面試驗。根據(jù)中心組合設計原理，以提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)、液固比4個因素為自變量，合萌總黃酮的得率為響應值，設計了4因素3水平共29個試驗點的響應面分析試驗，其中24個為析因試驗，5個為中心試驗，其因素水平分析選取見表1。

表1 響應面因素水平編碼

2.5.2 模型方程的建立與方差分析

按照“2.5.1”項下進行響應面分析試驗，方法與結果見表2，方差分析結果見表3。采用Design-

Expert( 8.0.6 版本) 軟件對實驗結果進行分析，以總黃酮得率為響應值，對實驗數(shù)據(jù)進行二元多項式回歸擬合，得出回歸方程為：

Y=3.96+0.12A+0.066B-0.50C+0.058D-0.027AB-0.077AC-0.070AD+0.030BC+0.040BD-0.075CD-0.65A2-0.21B2-0.53C2-0.20D2

式中：Y為總黃酮得率，A為提取溫度，B為提取時間，C為乙醇體積分數(shù)，D為液固比。

表2 響應面分析試驗結果

表3 方差分析結果

注：***P<0.001為極顯著，**P<0.01為高度顯著，*P<0.05為顯著。

由表3方差分析結果可知，回歸模型是極顯著的(P<0.001)，同時該模型的相關系數(shù)r=0.990 1，CV值為2.17%。說明該模型能夠反映響應值的變化，而且方程的失擬項(P=0.134 0)不顯著，表明該方程對實驗擬合情況好、誤差小，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析和預測。

2.5.3 響應曲面的分析

根據(jù)回歸方程，作出響應面和等高線，考察擬合響應面的形狀，分析提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)、液固比對合萌總黃酮提取得率的影響。各因素及其相互作用對相應值的影響可以通過各圖直觀反應出來。Design-ExpertSoftware8.0.6軟件處理后三維響應面和等高線圖見圖7～12。

根據(jù)圖7～12及表3可知，一次項中，乙醇體積分數(shù)(C)、提取溫度(A)對總黃酮得率的線性效率極顯著(P<0.001)，提取時間(B)對總黃酮得率的線性效率高度顯著(P<0.01)，液固比(D)對總黃酮得率的線性效率顯著(P<0.05)，二次項中，A2、B2、C2和D2影響均極顯著(P<0.001)，交互項按影響大小排列依次為AC、CD、AD、BD、BC、AB，其中提取溫度和乙醇體積分數(shù)交互項即AC對合萌總黃酮的提取率有顯著影響，其他交互項均不顯著，表明各因素對黃酮得率不是簡單的線性關系。同時，由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗范圍內，4個因素對總黃酮提取得率影響的排序為乙醇體積分數(shù)(C)>提取溫度(A)>提取時間(B)>液固比(D)。

2.6 驗證實驗

由Design-Expert8.0.6軟件分析得出合萌總黃酮的最優(yōu)提取工藝為：提取溫度91.06 ℃，提取時間62.02min，乙醇體積分數(shù)65.05%，液固比26.16∶1，其總黃酮得率為4.11mg/g。根據(jù)實際情況可將條件優(yōu)化為提取溫度90 ℃，提取時間60min，乙醇體積分數(shù)65%，液固比25∶1。在此優(yōu)化條件下，進行3次平行實驗進行驗證，結果表明合萌平均總黃酮得率為4.08mg/g，與模型預測值的誤差為0.73% ，說明該方程與實際情況擬合較好。

3 結論與討論

響應面分析克服了正交設計在考慮因素間交互作用時，如果任意安排正交表中各列因素將會導致交互效應與其它效應混雜的缺陷。響應面分析法是研究幾種因素間交互作用的回歸分析方法[8]。本實驗采用單因素試驗和響應面分析法對合萌總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，并結合實際情況得出最優(yōu)條件：提取溫度90 ℃，提取時間60min，乙醇體積分數(shù)65%，液固比25∶1，在此優(yōu)化條件下，總黃酮得率為4.08mg/g。回歸分析和驗證試驗結果表明，模型擬合情況好、實驗誤差小，可用于實際預測，從而也說明了采用響應面分析法中Box-Behnken對合萌總黃酮提取條件進行優(yōu)化合理可行，具有一定的實際應用價值。

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Optimization of Extraction for Flavonoids fromAeschynomeneindicaL.by Response Surface Methodology

Zhu Yuanyuan1，Zhao Ming1, 2*，Ouyang Zhen1，Cai Jianming1，Zhang Cheng1,Zhou Wenju1，Liu Jiangdi1，Yang Qian1，Wang Linwei1

(1. School of Pharmacy, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China;2. Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Objective: Response Surface Methodology (RSM) was used to optimize the extraction technology of total flavonoids fromAeschynomeneindicaL.. Methods: In single-factor tests, extraction time, ethanol concentration, liquid-solid ratio, extraction temperature and extraction times on yield of total flavonoids were explored. Among them, extraction time, ethanol concentration, liquid-solid ratio and extraction temperature were selected as influencing factors during extraction. The extraction technology was optimized by RSM. Results: The optimal extraction conditions of total flavonoids were extraction time of 60 min, ethanol concentration of 65%, liquid-solid ratio (g∶mL) of 25∶1, extraction temperature of 90 ℃. Under the optimal conditions, the yield of total flavonoids was 4.08 mg/g, which was close to the predicted value (4.11 mg/g). Conclusion: RSM can improve the yield of total flavonoids in a certain extent, which indicated that RSM is feasible to optimizing the extraction technology of total flavonoids fromAeschynomeneindicaL..

AeschynomeneindicaL.; flavonoids; Response Surface Methodology (RSM)

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.05.003

2016-03-28

江蘇省中醫(yī)藥局科技項目(LB 13037)；江蘇省江蘇大學第13批大學生科研立項資助項目(13A167)。

朱媛媛(1992—)，女, 在讀碩士研究生，主要從事中藥活性成分研究及新藥開發(fā)。E-mail：1462936884@qq.com

*通訊作者： 趙明(1962—)，男，主任中藥師，碩士研究生導師，主要從事中藥活性成分研究及新藥開發(fā)工作。 E-mail：anchorage8@126.com

R284.2

A

1006-9690(2016)-05-0009-05