雷帕霉素對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道重塑中血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)作用的研究

童衛(wèi)泉，楊宏寬，夏婷婷，劉賢忠，陳 彬，陳 芳

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·論著·

雷帕霉素對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道重塑中血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)作用的研究

童衛(wèi)泉，楊宏寬，夏婷婷，劉賢忠，陳 彬，陳 芳

目的 探討雷帕霉素對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠氣道重塑中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的作用。方法 2015年6月—2016年3月，采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠分為正常組、模型組、雷帕霉素組，每組10只。模型組與雷帕霉素組采用氣道內(nèi)滴入脂多糖(LPS)加煙熏雙重刺激法建立COPD氣道重塑大鼠模型，正常組不予任何干預(yù)。雷帕霉素組給予雷帕霉素治療，模型組、正常組給予等量的0.9%氯化鈉溶液。干預(yù)治療14 d后，收集各組大鼠血清、肺泡灌洗液(BALF)、肺組織標(biāo)本；取部分右側(cè)肺組織行HE染色，剩余右側(cè)肺組織行Masson染色與免疫組化染色，分別計(jì)算小氣道基底膜單位長度的膠原厚度(WAc/Pbm)、細(xì)支氣管VEGF陽性表達(dá)面積占?xì)夤芄鼙诳偯娣e的百分比(Aim/WAt)；采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)血清、BALF及肺組織中VEGF水平。結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，與模型組比較，雷帕霉素組大鼠細(xì)支氣管、肌性動(dòng)脈形態(tài)及肺組織病理改變有所改善；Masson染色結(jié)果顯示，模型組、雷帕霉素組大鼠WAc/Pbm大于正常組，雷帕霉素組大鼠WAc/Pbm小于模型組(P<0.05)。免疫組化染色結(jié)果顯示，模型組、雷帕霉素組大鼠Aim/WAt大于正常組，雷帕霉素組大鼠Aim/WAt小于模型組(P<0.05)。ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組、雷帕霉素組大鼠血清、BALF、肺組織中VEGF水平高于正常組，雷帕霉素組大鼠血清、BALF、肺組織中VEGF水平低于模型組(P<0.05)。結(jié)論 雷帕霉素可以改善COPD大鼠氣道重塑，這可能與雷帕霉素干預(yù)治療減少了COPD大鼠氣道重塑中VEGF水平，進(jìn)而抑制血管新生有關(guān)。

肺疾病,慢性阻塞性；氣道重塑；雷帕霉素；血管內(nèi)皮生長因子A

童衛(wèi)泉，楊宏寬，夏婷婷，等.雷帕霉素對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道重塑中血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)作用的研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(36)：4484-4488,4494.[www.chinagp.net]

TONG W Q,YANG H K,XIA T T,et al.Effect of rapamycin on the expression of vascular endothelial growth factor in airway remodeling of rats with chronic obstructive pulmonary disease[J].Chinese General Practice，2016，19(36)：4484-4488,4494.

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣流受限為特征的疾病，其氣流受限不完全可逆，呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺部對(duì)香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒物的異常炎性反應(yīng)有關(guān)[1]。氣道重塑是COPD的主要病理特征，以氣道壁組織結(jié)構(gòu)改變、管腔狹窄、氣流受限等為主要表現(xiàn)。近年來，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在COPD氣道重塑中的作用日益受到關(guān)注[2]。VEGF又名血管通透性因子，是目前研究最深入、作用最強(qiáng)的促血管生長因子，在生理、病理性血管增生中具有重要的調(diào)節(jié)作用，其在氣道和血管平滑肌細(xì)胞、氣道與肺泡上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞中等均有表達(dá)[3]。VEGF合成增多能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生和遷移，誘導(dǎo)氣道血管增殖，加重氣道纖維化[4]，最終導(dǎo)致氣道壁增厚，氣流受限。已有研究表明，COPD氣道重塑的形成與氣道血管體積增加使氣道壁增厚有關(guān)，所以通過抑制VEGF表達(dá)從而干預(yù)血管新生對(duì)延緩和改善COPD氣道重塑有積極作用[5]。本研究采用氣道內(nèi)滴入脂多糖(LPS)加煙熏雙重刺激法建立COPD氣道重塑大鼠模型，并進(jìn)行雷帕霉素干預(yù)治療，檢測(cè)血清、肺泡灌洗液(BALF)及肺組織中VEGF水平，初步探討雷帕霉素在COPD大鼠氣道重塑過程中抑制血管新生的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)：2012-0002，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、雷帕霉素組，每組10只。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 雷帕霉素購于美國Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 雄獅牌香煙購于浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司(焦油量8 mg/支，煙氣煙堿量0.7 mg/支，一氧化碳量10 mg/支)；LPS購于美國Sigma公司；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒購于武漢新啟迪生物科技有限公司；免疫組化VEGF檢測(cè)試劑盒購于丹麥DAKO公司。

1.4 方法

1.4.1 建立COPD氣道重塑大鼠模型 2015年6月—2016年3月，采用氣道內(nèi)滴入LPS加煙熏雙重刺激法建立COPD氣道重塑大鼠模型，即模型組與雷帕霉素組在第1天與第28天氣道內(nèi)滴入LPS，除當(dāng)日不予煙熏外，余時(shí)間在自制煙熏箱內(nèi)煙熏24周，早晚各1次，每次點(diǎn)燃香煙30支，煙熏40 min，間隔8 h；正常組不予任何干預(yù)。通過觀察肺組織病理變化判斷造模是否成功[6]。

1.4.2 干預(yù)治療 煙熏24周確定造模成功后開始進(jìn)行雷帕霉素干預(yù)治療，共14 d。雷帕霉素組腹腔注射雷帕霉素0.2 mg·kg-1·d-1；模型組、正常組腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液。

1.4.3 標(biāo)本收集 干預(yù)治療14 d后，腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠，取腹主動(dòng)脈血8 ml，靜置30 min，3 000 r/min離心15 min(離心半徑6 cm)，取上清液(血清)分裝到EP管中，-20 ℃冰箱保存。結(jié)扎大鼠右肺，對(duì)其左肺進(jìn)行肺泡灌洗3次，回收BALF，3 000 r/min離心10 min(離心半徑6 cm)，去細(xì)胞沉淀后分裝，-80 ℃保存。取下右肺，灌注4%甲醛溶液固定24 h，分別行HE染色、Masson染色和免疫組化染色；取左肺，一分為二放入凍存管液氮速凍，-80 ℃保存，用于ELISA檢測(cè)。

1.4.4 病理分析 取部分右側(cè)肺組織行HE染色，觀察小氣道及周圍小動(dòng)脈病理改變；剩余右肺組織行Masson染色與免疫組化染色，采用Image-pro-plus 6.0圖像分析軟件分別計(jì)算小氣道基底膜單位長度的膠原厚度(WAc/Pbm)、細(xì)支氣管VEGF陽性表達(dá)面積占?xì)夤芄鼙诳偯娣e的百分比(Aim/WAt)，以評(píng)估氣道重塑情況和VEGF表達(dá)情況。其中Masson染色陽性膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色；免疫組化染色陽性VEGF呈棕黃色，表達(dá)在氣道上皮及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)。

1.4.5 ELISA法檢測(cè)血清、BALF及肺組織中VEGF水平 按ELISA試劑盒說明書要求，將保存的血清、BALF、部分左肺組織標(biāo)本常溫解凍后置于超凈臺(tái)上，采用ELISA試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清、BALF及肺組織中VEGF水平。

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果

2.1.1HE染色結(jié)果 正常組大鼠肺組織細(xì)支氣管、血管及肺泡結(jié)構(gòu)完整，細(xì)支氣管與血管管壁未見明顯組織學(xué)改變；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁擴(kuò)張、破裂，融合形成肺大泡，細(xì)支氣管管壁增厚明顯且周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，伴小動(dòng)脈平滑肌增厚；雷帕霉素組大鼠較模型組肺泡壁仍有擴(kuò)張，部分肺泡腔融合，細(xì)支氣管與血管周圍可見少量炎性細(xì)胞，氣管及血管壁略有增厚，肺組織結(jié)構(gòu)改變有所改善(見圖1，本文圖1～3彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

2.1.2Masson染色結(jié)果 正常組大鼠肺組織含有少量膠原纖維，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分；模型組大鼠肺組織可見炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚纖維化，氣道壁膠原纖維增多；雷帕霉素組大鼠肺組織膠原纖維略有增多，但比模型組有所減少(見圖2)。3組大鼠WAc/Pbm比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；其中模型組、雷帕霉素組大鼠WAc/Pbm大于正常組，雷帕霉素組大鼠WAc/Pbm小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.1.3 免疫組化染色結(jié)果 正常組大鼠氣道及周圍僅見少量VEGF陽性顆粒；模型組大鼠氣道及周圍有大量VEGF陽性顆粒浸潤；雷帕霉素組大鼠氣道及周圍VEGF陽性顆粒較模型組有所減少(見圖3)。3組大鼠Aim/WAt比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；其中模型組、雷帕霉素組大鼠Aim/WAt大于正常組，雷帕霉素組大鼠Aim/WAt小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.2 血清、BALF及肺組織中VEGF水平 3組大鼠血清、BALF及肺組織中VEGF水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；其中模型組、雷帕霉素組大鼠血清、BALF、肺組織中VEGF水平高于正常組，雷帕霉素組大鼠血清、BALF、肺組織中VEGF水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

表1 各組大鼠WAc/Pbm比較

注：WAc/Pbm=膠原厚度；與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

表2 各組大鼠Aim/WAt比較

注：Aim/WAt=細(xì)支氣管VEGF陽性表達(dá)面積占?xì)夤芄鼙诳偯娣e的百分比；與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

Table 3 Comparison of VEGF level in serum,BALF and lung tissues of rats in each groups

組別只數(shù)血清BALF肺組織正常組108358±28210529±52812358±413模型組109450±266a12601±531a15002±507a雷帕霉素組108889±220ab11024±389ab14396±673abF值450504929965313P值<0001<0001<0001

注：BALF=肺泡灌洗液；與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

注：A為正常組，B為模型組，C為雷帕霉素組

圖1 各組大鼠肺組織病理HE染色結(jié)果(×100)

Figure 1 Pathological results of HE staining of lung tissue of rats in each group

注：A為正常組，B為模型組，C為雷帕霉素組

圖2 各組大鼠肺組織病理Masson染色結(jié)果(×100)

Figure 2 Pathological results of Masson staining of lung tissue of rats in each group

注：A為正常組，B為模型組，C為雷帕霉素組

圖3 各組大鼠肺組織免疫組化染色結(jié)果(×100)

Figure 3 Immunohistochemical staining results of lung tissue of rats in each group

3 討論

COPD氣道重塑是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，多種因素參與其中，目前的主要觀點(diǎn)認(rèn)為，氣道的慢性炎癥是誘發(fā)COPD氣道重塑的主要原因，氣道在慢性致炎因素的反復(fù)刺激下，氣道上皮充血、水腫、脫落，氣道壁血管裸露，血管內(nèi)容物滲漏，血管生成，氣道上皮化生，管壁纖維組織增生，氣道壁增厚，氣道重塑，管腔狹窄，最終導(dǎo)致不可逆的氣流受限[7]。近年來，血管新生在COPD氣道重塑中的作用日益受到重視[8]。氣道的血管系統(tǒng)具有較強(qiáng)的可塑性和擴(kuò)展能力，在致炎因素的作用下，出現(xiàn)血管壁的通透性增加、體液滲出、氣道壁水腫、黏膜下新生血管形成、血管增多等改變，進(jìn)而使得氣道壁組織結(jié)構(gòu)改變，氣道重塑[9-10]。

VEGF是有效的作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，通過與血管內(nèi)皮上的特異性受體結(jié)合，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加微血管通透性、誘導(dǎo)血管生成的功能[11]，并且VEGF還能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生長、移位及血管滲漏，參與血管生成，在氣道重塑中起重要作用。既往研究表明，VEGF與COPD關(guān)系密切[12]。SOLTANI等[13]研究顯示，在COPD患者及正在吸煙的人群中存在VEGF的高表達(dá)，且COPD患者在戒煙后仍存在血管生成活躍的現(xiàn)象。另外，KRANENBURG等[14]研究表明，COPD患者細(xì)支氣管、氣道平滑肌細(xì)胞VEGF及其受體表達(dá)水平明顯增加，同時(shí)指出VEGF及其受體參與COPD氣道重塑并與氣流受限的形成有關(guān)。此外，F(xiàn)ARID等[15]采用ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，COPD患者血清中VEGF水平明顯高于正常對(duì)照組，且血清VEGF可以作為評(píng)估COPD嚴(yán)重程度及預(yù)后的指標(biāo)。PAVLISA等[16]提出，上調(diào)VEGF水平可改善組織灌注和氧合，進(jìn)而刺激血管新生。因而可以通過觀察氣道VEGF的陽性表達(dá)面積及檢測(cè)血清、BALF、肺組織中的VEGF水平來評(píng)價(jià)COPD氣道重塑過程中血管新生的情況。本研究HE染色結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁擴(kuò)張、破裂，融合形成肺大泡，細(xì)支氣管管壁明顯增厚且周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，伴行小動(dòng)脈平滑肌亦有顯著增厚；Masson染色結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織可見炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚纖維化，氣道壁膠原纖維增多，模型組WAc/Pbm大于正常組；免疫組化染色結(jié)果顯示，模型組大鼠氣道及周圍有大量VEGF陽性顆粒浸潤，模型組Aim/WAt大于正常組；ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清、BALF、肺組織中VEGF水平高于正常組。說明VEGF在COPD氣道重塑大鼠的肺部高表達(dá)，表明COPD氣道重塑組大鼠存在血管新生活躍的現(xiàn)象。

雷帕霉素是從鏈酶素培養(yǎng)液中提取的三烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素，能抑制T淋巴細(xì)胞分化，抑制氣道平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[17]，兼有免疫抑制和抗新生血管增生的作用。有研究顯示，雷帕霉素可以顯著減少VEGF的分泌，抑制血管新生[18]；對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的研究表明，雷帕霉素能降低VEGF水平，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而抑制新生血管的生成[19]。因而，本研究采用雷帕霉素干預(yù)COPD大鼠氣道重塑中的血管新生，HE染色結(jié)果顯示，雷帕霉素組大鼠較模型組肺泡壁仍有擴(kuò)張，部分肺泡腔融合，細(xì)支氣管與血管周圍可見少量炎性細(xì)胞，氣管及血管壁略有增厚，肺組織結(jié)構(gòu)改變有所改善；Masson染色結(jié)果顯示，雷帕霉素組大鼠肺組織膠原纖維略有增多，但比模型組有所減少，雷帕霉素組大鼠WAc/Pbm大于正常組，小于模型組；免疫組化染色結(jié)果顯示，雷帕霉素組大鼠氣道及周圍VEGF陽性顆粒較模型組有所減少，雷帕霉素組大鼠Aim/WAt大于正常組，小于模型組；ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，雷帕霉素組大鼠血清、BALF、肺組織中VEGF水平高于正常組，低于模型組。表明雷帕霉素能通過降低COPD氣道重塑大鼠VEGF水平抑制血管新生，緩解氣道重塑。

綜上所述，雷帕霉素能降低COPD大鼠氣道重塑中VEGF水平，抑制血管新生、改善COPD氣道重塑。當(dāng)然，本研究仍有許多不完善之處，如未能對(duì)VEGF的受體進(jìn)行檢測(cè)；再者，促進(jìn)血管新生的因子眾多，VEGF僅是其中之一，雷帕霉素是否通過其他途徑抑制血管新生尚待今后進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：童衛(wèi)泉、陳芳進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、撰寫論文；陳芳進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；楊宏寬、夏婷婷、陳彬進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；童衛(wèi)泉、陳芳進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；夏婷婷、劉賢忠、陳芳進(jìn)行論文的修訂；陳芳負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Effect of Rapamycin on the Expression of Vascular Endothelial Growth Factor in Airway Remodeling of Rats with Chronic Obstructive Pulmonary Disease

TONG Wei-quan,YANG Hong-kuan,XIA Ting-ting,LIU Xian-zhong,CHEN Bin,CHEN Fang.

The First Clinical Medical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China

CHEN Fang,Respiratory Physiology Laboratory,Zhejiang Provincial Hospital of TCM,the First Clinical Medical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310006,China;E-mail:funchen@163.com

Objective To explore the role of rapamycin on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in airway remodeling of rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD).Methods From June 2015 to March 2016,30 SPF grade male Wistar rats were randomly divided into three groups (normal group,model group and rapamycin group) by random number table method,and each group had 10 rats.The dual stimulation way of lipopolysaccharide (LPS) through the airway plus fumigation was conducted to rats in model group and rapamycin group to construct COPD rats′ model of airway remodeling,while no intervention was given to rats in normal group.Rats in rapamycin group received treatment of rapamycin,while rats in model group and normal group received the same amount of 0.9% solution of sodium chloride.After 14-day intervention,the serum,bronchial alveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue specimens of rats in each group were collected;part of the right lung tissue was taken to perform HE staining and Masson staining and immunohistochemical staining were given to the remaining tissue,collagen thickness(WAc/Pbm) per unit length of small airway basement membrame,and the percentage of bronchioles VEGF positive expression area in the total area of the corresponding tracheal tube wall (Aim/WAt) were calculated respectively;the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect VEGF expression level in serum,BALF and lung tissue.Results The HE staining results showed that compared with model group,the pathologic change of bronchiole,muscular artery morphology and lung tissue of rats in rapamycin group had improved;Masson staining results showed that the WAc/Pbm of rats in model group and rapamycin group was greater than that in normal group,while WAc/Pbm of rats in rapamycin group was less than that in model group (P<0.05).Immunohistochemical staining results showed that Aim/WAt of rats in model group and rapamycin group was greater than that in normal group,while Aim/WAt of rats in rapamycin group was less than that in model group (P<0.05).ELISA testing results showed that the VEGF expression level of serum,BALF and lung tissue in rapamycin group and model group was higher than that in normal group,while the VEGF expression level of serum,BALF and lung tissue in rapamycin group was lower than that in model group (P<0.05).Conclusion Rapamycin can improve the airway remodeling of COPD rats,which may be related to the intervention treatment of rapamycin on decreasing of VEGF level in airway remodeling of COPD rats and thus inhibiting angiogenesis in rats.

Pulmonary disease,chronic obstructive;Airway remodeling;Rapamycin;Vascular endothelial growth factor A

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302934)；浙江省博士后科研項(xiàng)目(BSH1402070)

310053 浙江省杭州市，浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(童衛(wèi)泉，楊宏寬，夏婷婷，劉賢忠)；浙江省中醫(yī)院 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院呼吸生理研究室(陳彬，陳芳)

陳芳，310006 浙江省杭州市，浙江省中醫(yī)院 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院呼吸生理研究室；E-mail：funchen@163.com

R 563.9

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.36.016

2016-04-25；

2016-10-26)