谷胱甘肽S-轉移酶P1基因多態(tài)性與支氣管肺發(fā)育不良的關系研究

齊 倩，胡曉琳

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·論著·

谷胱甘肽S-轉移酶P1基因多態(tài)性與支氣管肺發(fā)育不良的關系研究

齊 倩，胡曉琳

目的 探討谷胱甘肽S-轉移酶P1(GSTP1)基因多態(tài)性與支氣管肺發(fā)育不良(BPD)的關系。方法 選取2010年3月—2013年12月在武漢市第三醫(yī)院新生兒科及華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護室(NICU)住院的患有BPD的早產兒60例為BPD組(其中男38例，女22例)，及同期入住華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院NICU無肺部疾病的早產兒99例為對照組(其中男63例，女36例)。釆用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測GSTP1基因多態(tài)性。結果 兩組GSTP1基因型頻率均符合Hardy-Weinbery平衡，具有群體代表性。兩組GSTP1基因型頻率和等位基因頻率間差異均無統計學意義(P>0.05)。兩組男性GSTP1基因型頻率和等位基因頻率間差異均無統計學意義(P>0.05)。結論 GSTP1基因多態(tài)性與BPD易感性無關。

谷胱甘肽S-轉移酶P1；支氣管肺發(fā)育不良；多態(tài)性，單核苷酸；疾病易感性

齊倩，胡曉琳.谷胱甘肽S-轉移酶P1基因多態(tài)性與支氣管肺發(fā)育不良的關系研究[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(34)：4213-4215.[www.chinagp.net]

QI Q,HU X L.Relationship of gene polymorphisms of glutathione S-transferase P1 and bronchopulmonary dysplasia[J].Chinese General Practice，2016，19(34)：4213-4215.

支氣管肺發(fā)育不良(BPD)常見于早產兒，特別是胎齡小的早產兒。由于其對早產兒的存活率影響較大，目前已成為全球新生兒學研究的熱門課題。BPD可由包括遺傳易感性、氧中毒、氣壓傷/容量傷和感染/炎癥在內的多種因素誘發(fā)，各種因素導致的活性氧水平上升，進而引起細胞氧化損傷是其主要的病理學機制之一，而人體內的抗氧化酶可減少活性氧并調節(jié)炎癥瀑布，從而為機體提供一定的保護作用[1]。谷胱甘肽轉移酶系(GSTs)是一個Ⅱ相反應代謝的超家族酶系，其在肺部抗氧化過程中起重要作用。研究表明，GSTs的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與其酶的活性密切相關。其中谷胱甘肽S-轉移酶P1(GSTP1)亞群的第5外顯子存在SNP位點(A/G)，密碼子編碼的是纈氨酸(val)或異亮氨酸(ile)，而氨基酸序列的改變影響了酶的活性。研究顯示105val形式比105ile形式清除活性氧的效率高，且105ile是多種呼吸道疾病的易患基因[2-4]。鑒于GSTs廣泛的抗氧化效應，而GSTP1基因多態(tài)性與BPD的相關性在國內還罕見報道，故設計本研究旨在探討二者間的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2010年3月—2013年12月在武漢市第三醫(yī)院新生兒科及華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護室(NICU)住院的患有BPD的早產兒60例為BPD組，其中男38例，女22例；出生體質量1.10～1.70 kg，平均(1.30±0.22)kg；胎齡28～32周，平均(30.1±1.9)周。納入標準：(1)均符合BPD診斷標準[1]；(2)出生后持續(xù)用氧超過28 d。排除標準：中樞神經系統畸形、膈疝、呼吸系統畸形、嚴重先天性心臟病(室間隔缺損、房間隔缺損、動脈導管未閉)、染色體異常等致死性先天畸形者。另外選取同期入住華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院NICU無肺部疾病的早產兒99例為對照組，其中男63例，女36例；出生體質量1.10～2.00 kg，平均(1.37±0.20)kg；胎齡28～32周，平均(30.5±1.7)周。兩組性別(χ2=0.002，P=0.969)、出生體質量(t=2.060，P=0.401)和胎齡(t=1.370，P=0.460)間差異均無統計學意義，具有可比性。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，患兒家屬均知情同意并簽署同意書。

1.2 方法 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測GSTP1基因多態(tài)性。采集兩組患兒靜脈血2 ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用基因組DNA試劑盒(北京鼎國生物技術有限公司，中國)提取DNA。采用Primer Premier 5.0軟件設計引物序列。GSTP1上游引物：5′-GTAGTTTGCCCAAGGTCAAG-3′，下游引物：5′-AGCCACCTGAGGGGTAAG-3′，片段長度：433 bp。PCR反應體系20 μl：含10 μl 2×PCR Plus Mix(DBI公司)，1 μl DNA模板，上下游引物各0.5 μl，二次蒸餾水(ddH2O)8 μl。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃再延伸4 min。PCR產物7 μl，加入限制性核酸內切酶Alw26I(Fermentas公司，加拿大)11 μl，磷酸鹽緩沖液(PBS)2 μl，總反應體系20 μl。置于37 ℃水浴中消化2 h。消化完畢后取8 μl酶切產物在2%瓊脂糖凝膠加樣孔內，80 mA電泳30 min，Bio-Rad 凝膠成像系統分析電泳結果。隨機取上述PCR產物測序驗證PCR-RFLP的準確性和特異性。

2 結果

2.1GSTP1基因PCR-RFLP檢測結果 經PCR擴增后得到GSTP1基因PCR產物，經限制性核酸內切酶Alw26I切后，其純合野生型(AA)的PCR產物被水解為329bp和104bp兩個片段；由于A→G變異導致一個新的酶切位點形成，故GSTP1基因純合變異型(GG)的PCR產物被水解為222bp、107bp和104bp3個片段；而其雜合型(AG)的PCR產物經酶切后則水解為329bp、222bp、107bp、104bp4個片段。由于107bp和104bp不易區(qū)分，因此在顯色后表現為1個條帶(見圖1)。

2.2 兩組GSTP1基因型頻率和等位基因頻率比較 兩組GSTP1基因型頻率均符合Hardy-Weinbery平衡，具有群體代表性。兩組GSTP1基因型頻率和等位基因頻率間差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)。

2.3 兩組男性GSTP1基因型頻率和等位基因頻率比較 兩組男性GSTP1基因型頻率和等位基因頻率間差異均無統計學意義(P>0.05，見表2)。

注：1、2、4、5、9為AA基因型，3、6、10為GG基因型，7、8為AG基因型；GSTP1=谷胱甘肽S-轉移酶P1

表1 兩組GSTP1基因型頻率和等位基因頻率比較〔n(%)〕

注：GSTP1=谷胱甘肽S-轉移酶P1，BPD=支氣管肺發(fā)育不良

表2 兩組男性GSTP1基因型頻率和等位基因頻率比較〔n(%)〕

3 討論

BPD的本質是在遺傳易感性基礎上由各種有害環(huán)境因素對不成熟肺造成損傷，以及損傷后的異常修復過程所致[5]。在BPD長達數十年的發(fā)病機制研究中，肺氧中毒被確定為重要致病因素之一，由其導致的過量活性氧可氧化蛋白質、脂質或DNA，進而損傷肺部組織細胞并誘導細胞死亡[6]。有報道證實患BPD的早產兒臍血中過氧化物的含量較未患BPD的患兒明顯增多[7]；而早產兒缺乏抗氧化能力也是過氧化物造成肺損傷的主要原因之一[8]。

GSTs可催化谷胱甘肽(GSH)的巰基與過氧化物的結合，從而保護DNA及一些蛋白質免受氧化損傷。GSTs主要分為alpha(α)、mu(μ)、pi(π)、theta(θ)和sigma(σ)五類水溶性GSTs，另外還有一類是脂溶性的微粒體同工酶。其中GSTP1在肺臟中含量最高，尤其多分布于肺泡巨噬細胞和肺泡、呼吸性細支氣管等肺臟外周部位[9]。GSTP1編碼序列中第5外顯子內的105位氨基酸殘基位于其酶蛋白的疏水性底物結合部點(H-site)，在這一位點上發(fā)生氨基酸殘基的替換將會改變酶分子的空間構象，進而影響酶與親電子底物結合的特異性、穩(wěn)定性及催化活性，并改變蛋白酶的抗氧化能力[10]。所以GSTP1第5外顯子基因多態(tài)性可能是肺組織抗氧化防御能力個體差異的分子遺傳基礎之一。在非裔美國人的研究中，發(fā)現GSTP1 105ile是BPD的易患基因[11]。試管內的研究證實了105val的解毒效率高于105ile[12]。另有相關研究報道，105ile增加哮喘和特異反應性疾病的易感性[13]。本研究結果顯示，兩組GSTP1基因型頻率和等位基因頻率間均無差異，同時考慮到BPD在男性患兒中多見，所以將兩組男性GSTP1基因型頻率和等位基因頻率進一步比較，結果發(fā)現兩組男性間亦無差異。說明GSTP1基因多態(tài)性與BPD易感性無關，分析原因可能為等位基因A在各種族中分布頻率不同，基因易患性可能存在種族差異[14]。

BPD的發(fā)病原因較為復雜，且有多種病理學改變。單一基因與疾病的相關性鑒定起來非常困難。本課題組將進一步針對肺部氧化-抗氧化機制中的其他抗氧化酶進行多態(tài)性研究，并探索多態(tài)性位點間的相互作用。目前BPD的預防和治療效果進入一個平臺期，如能識別其“高危基因”，進行有針對的預防和治療，將使BPD的防治得到突破。

作者貢獻：齊倩進行試驗設計與實施、撰寫論文并對文章負責；胡曉琳進行資料及部分樣本的收集。

本文無利益沖突。

[1]JOBE A H.The new bronchopulmonary dysplasia[J].Curr Opin Pediatr,2011,23(2):167-172.

[2]REDDY P,NAIDOO R N,ROBINS T G,et al.GSTM1,GSTP1,and NQO1 polymorphisms and susceptibility to atopy and airway hyperresponsiveness among South African schoolchildren[J].Lung,2010,188(5):409-414.

[3]MALO J L,CHAN-YEUNG M.Agents causing occupational asthma[J].J Allergy Clin Immunol,2009,123(3):545-550.

[4]MINELLI C,WEI I,SAGOO G,et al.Interactive effects of antioxidant genes and air pollution on respiratory function and airway disease:a HuGE review[J].Am J Epidemiol,2011,173(6):603-620.

[5]軒哲，薛辛東，富建華.早產兒支氣管肺發(fā)育不良的防治新進展[J].中國當代兒科雜志,2010,12(5):412-416. XUAN Z,XUE X D,FU J H.Research advance in prevention and treatment of bronchopulmonary dysplasia in premature infants[J].Chinese Journal of Contemporary Pediatrics,2010,12(5):412-416.

[6]PARK H S,KIM S R,LEE Y C.Impact of oxidative stress on lung diseases[J].Respirology,2009,14(1):27-38.

[7]PERRONE S,TATARANNO M L,NEGRO S,et al.Early identification of the risk for free radical-related diseases in preterm newborns[J].Early Hum Dev,2010,86(4):241-244.

[8]LEE J W,DABIS J M.Future applications of antioxidants in premature infants[J].Curr Opin Pediatr,2011,23(2):161-166.

[9]CANTLAY A M,SMITH C A,WALLACE W A,et al.Heterogeneous expression and polymorphic genotype of glutathione S-transferases in human lung[J].Thorax,1994,49(10):1010-1014.

[10]GINSBERG G,SMOLENSKI S,HATTIS D,et al.Genetic polymorphism in glutathione transferases(GST):population distribution of GSTM1,T1,and P1 conjugating activity[J].J Toxicol Environ Health B Crit Rev,2009,12(5/6):389-439.

[11]MANAR M H,BROWN M R,GAUTHIER T W,et al.Association of glutathione-S-transferase-P1(GST-P1) polymorphisms with bronchopulmonary dysplasia[J].J Perinatol,2004,24(1):30-35.

[12]HAYES J D,STRANGE R C.Glutathione S-transferase polymorphisms and their biological consequences[J].Pharmacology,2000,61(3):154-166.

[13]BARALDI E,CARRARO S,FILIPPONE M.Bronchopulmonary dysplasia:definitions and long-term respiratory outcome[J].Early Hum Dev,2009,85(10 Suppl):S1-3.

[14]ISHII T,MATSUSE T,TERAMOTO S,et al.Glutathione S-Transferase P1(GSTP1) polymorphism in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].Thorax,1999,54(8):693-696.

(本文編輯：崔沙沙)

Relationship of Gene Polymorphisms of Glutathione S-Transferase P1 and Bronchopulmonary Dysplasia

QIQian,HUXiao-lin.

DepartmentofPediatrics,WuhanThirdHospital,Wuhan430060,China

Correspondingauthor:QIQian,DepartmentofPediatrics,WuhanThirdHospital,Wuhan430060,China;E-mail:125956514@qq.com

Objective To investigate the relationship of gene polymorphisms of glutathione S-transferase P1(GSTP1) and bronchopulmonary dysplasia.Methods 60 hospitalized premature infants with BPD in Neonatology Department in Wuhan Third Hospital,and Neonatal Intensive Care Unit(NICU) of Tongji Hospital,Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology from March 2010 to December 2013 were selected as BPD group(38 boys,22 girls),and 99 hospitalized premature infants without pulmonary disease in NICU of Tongji Hospital,Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology at the same period were enrolled as control group(63 boys,36 girls).The gene polymorphism of GSTP1 was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Results The genotype frequencies of GSTP1,with representativeness of the groups,were consistent with Hardy-Weinbery equilibrium.There was no significant difference in genotype frequency and allele frequency of GSTP1 between the two groups(P>0.05).There was no significant difference in genotype frequency and allele frequency of GSTP1 genotype between males in the two groups(P>0.05).Conclusion The gene polymorphism of GSTP1 is not associated with the susceptibility BPD.

Glutathione S-transferase P1;Bronchopulmonary dysplasia;Polymorphism,single nucleotide;Disease susceptibility

430060湖北省武漢市第三醫(yī)院兒科(齊倩)；華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院兒科(胡曉琳)

齊倩，430060湖北省武漢市第三醫(yī)院兒科；

E-mail：125956514@qq.com

R 726.553

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.34.013

2016-07-07；

2016-10-25)