寧夏地區(qū)部分蛋雞場新城疫卵黃抗體效價的檢測與分析

張東濤，孟凡偉，周學章

（寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

寧夏地區(qū)部分蛋雞場新城疫卵黃抗體效價的檢測與分析

張東濤，孟凡偉，周學章

（寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

本研究旨在檢測寧夏地區(qū)部分蛋雞場新城疫卵黃抗體效價的水平及差異，通過血凝試驗檢測本實驗室制備的新城疫病毒抗原的效價并校正血凝單位，血凝抑制試驗檢測寧夏地區(qū)14個蛋雞場140枚雞蛋卵黃抗體的效價。試驗結(jié)果顯示，新城疫病毒的血凝效價為 8 log2，卵黃抗體效價平均在10 log2～13 log2。因此，寧夏地區(qū)蛋雞場新城疫卵黃抗體效價較高，研究結(jié)果為了解寧夏地區(qū)新城疫防治的效果提供了試驗數(shù)據(jù)。

寧夏；新城疫；卵黃抗體；血凝試驗；血凝抑制試驗

雞新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病,被世界動物衛(wèi)生組織（O IE）列為A類傳染病，是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病[1-2]。自20世紀80年代以來，我國對新城疫采取了全面免疫的防控策略，但不能忽視的是，新城疫仍然是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病，在某些地區(qū)仍然持續(xù)存在，個別地區(qū)呈地方性流行，在臨床上還出現(xiàn)了宿主范圍擴大、免疫帶毒現(xiàn)象普遍等新的流行特征[3]。

范文穎等[4]的研究表明，新城疫或禽流感疫苗二免21 d后（在有基礎免疫的情況下）卵黃抗體水平與血清抗體水平接近，卵黃抗體水平直接反映了血清抗體水平的高低。在蛋禽疾病防治中，為了及時掌握禽流感、新城疫、產(chǎn)蛋下降綜合征等疫苗的免疫效果，了解產(chǎn)蛋家禽抗體水平的高低，以便制定正確的免疫程序，臨床上需要對免疫家禽的卵黃抗體水平進行多次監(jiān)測。這在一定程度上避免了因采血測定血清抗體給家禽造成的應激反應，不致引起家禽產(chǎn)蛋量的下降。應用血凝抑制試驗（H I試驗）檢測禽蛋卵黃抗體水平是最簡便、經(jīng)濟、準確的血清學檢測方法。本試驗隨機檢測了寧夏地區(qū)14個蛋雞場140枚雞蛋卵黃抗體效價，為了解寧夏地區(qū)雞新城疫的防治效果提供了試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 待檢雞蛋分別來自寧夏銀川郊區(qū)、銀南地區(qū)、銀北地區(qū)等的14個蛋雞場。LasotaIV系弱毒株由寧夏大學生物制品中心保存，新城疫陽性血清購自北京華業(yè)寰宇化工有限公司，陰性血清和雞紅細胞由本試驗自制。

1.2 方法

1.2.1 雞紅細胞懸液的制備 采集3只健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用pH 7.2 0.01 m ol/L的PBS液洗滌3次，每次均以1 000 r/min離心10 min，用吸管吸去上清液和白細胞薄膜，將沉淀的紅細胞加PBS反復洗滌3次，上述PBS配成體積分數(shù)為0.8%紅細胞懸液，4℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 抗原制備 非免疫受精種蛋置37℃恒溫孵化箱中孵化至第10 d，剔除死胚，無菌條件下注入0.5%稀釋的新城疫病毒LasotaIV系弱毒株0.2 mL于尿囊腔內(nèi)，蠟封。置37℃恒溫孵化箱中，72 h后收獲病毒。尿囊液經(jīng)2 800 r/min低速離心60 min后沉淀病毒，沉淀物用pH 7.2 0.01 m ol/L PBS重懸，置-20℃保存?zhèn)溆?，臨用前解凍。

1.2.3 血凝試驗（HA）檢測新城疫病毒的血凝效價在微量反應板的1～12孔均加入25 μLPBS，吸取25 μL抗原加入第l孔，混勻后從第1孔吸取25 μL，病毒液加入第2孔，混勻后吸取25 μl加入第3孔，以此進行倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸取25 μL棄之，每孔再加入25 μL PBS，每孔均加入25 μL體積分數(shù)為1%雞紅細胞懸液，振蕩混勻后在室溫（20～25℃）下靜置40 min后觀察結(jié)果。以100%凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價，即為1個凝集單位。

1.2.4 4單位抗原的校正 配制4單位抗原并進行校正，向反應板的第2孔至第6孔加生理鹽水25 μ L，吸取4單位抗原25 μL分別加入第1孔、第2孔中，充分混合后吸出25 μL至第3孔，依次倍比稀釋到第5孔，棄去25 μL，再吸取1%紅細胞懸液依次加入1～6孔，每孔25 μL，振蕩1分鐘后室溫靜置30 min后觀察結(jié)果，如第1～3孔為完全凝集，第4孔紅細胞為50%沉淀，第5孔為對照完全沉淀，表明所配4單位抗原準確，校正成立，4單位抗原現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.5 雞卵黃提取液的制備 將被檢雞蛋消毒，在氣室端開窗，棄凈卵清，只留卵黃，攪開，取2 mL卵黃，于試管加等量的PBS，混合后再按混合液的2倍量加入氯仿，振勻，見卵黃凝結(jié)成腦樣為宜，室溫下靜止1 h后，1 500 r/min離心20 min，吸出上清液-20℃保存?zhèn)溆脗洹?/p>

1.2.6 血凝抑制（HI）試驗 在96孔微量反應板上，每排第2～12孔各加入25 μL稀釋液，每排第1孔和第2孔各加入25 μL卵黃抗體上清液，從第2～10孔開始進行倍比稀釋，第11孔為抗原對照，第12孔為稀釋液對照。另設1排1～11孔倍比稀釋的陽性血清對照。然后在1～11孔各加入25 μL 4單位抗原，最后1排加入25 μL稀釋液，充分震蕩1 min后室溫放置20～30 min，每孔加入25 μL配置好并充分混勻的0.8%紅細胞懸液，充分震蕩后室溫放置20～30 min后，觀察結(jié)果并讀數(shù)。結(jié)果判定，以完全抑制4單位抗原的卵黃抗體最高稀釋倍數(shù)作為H I效價[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 血凝試驗結(jié)果 對自制新城疫病毒抗原進行血凝試驗，不同時間3個批次的9份尿囊液H A血凝效價均值為8 l og2，結(jié)果如表1所示。

2.2 44單位抗原校正結(jié)果 血凝試驗測得新城役病毒H A效價平均為1:28，則單位抗原為1:64，四單位抗原校正結(jié)果顯示，前3孔為紅細胞完全凝集，第4孔為紅細胞50%凝集，第5孔為紅細胞完全沉淀，說明抗原校正成功。

2.3 血凝抑制試驗結(jié)果 通過血凝抑制試驗對寧夏地區(qū)雞卵黃抗體進行檢測，結(jié)果顯示各地區(qū)雞卵黃體抗體效價均大于10 l og2，平均為10～13 l og2之間，結(jié)果如表2所示。

表1 各組血凝試驗HA效價均值Table1 The average value of HA in each group

表2 寧夏地區(qū)部分蛋雞場卵黃抗體HI效價平均值Table2 The average value of IgY HI titer in Some Layer Farm of Ningxia Area

3 討論

卵黃抗體是雞受到外界特異性抗原的刺激后，體內(nèi)發(fā)生免疫應答反應，產(chǎn)生免疫球蛋白，并通過卵泡膜進入卵黃，并在卵黃中大量蓄積，形成卵黃抗體，也稱卵黃免疫球蛋白[6]，由于卵黃抗體的累積作用，使卵黃中的抗體明顯高于血清中的含量，為雛雞提供母源保護[7]。用特異的抗原多次免疫母禽后，所產(chǎn)的蛋黃中針對抗原的抗體含量會明顯增加，特異的、高效價的卵黃抗體可以應用生物化學技術從蛋黃中提出[8]。卵黃抗體與哺乳動物初乳中的抗體一樣，都是由母體產(chǎn)生，通過特殊機制從血液中轉(zhuǎn)運而來。曹丹的[9]研究表明新城疫卵黃抗體與血清抗體間存在很高的相關性，雞新城疫疫苗免疫蛋雞后不同時期血清抗體和卵黃抗體效價基本一致，升降趨勢相同。類似報道都證實卵黃抗體的檢測可以很好地反映血清中的抗體[10-12]。卵黃抗體的檢測方法更加簡易，還能避免采血時雞群對的應激反應，節(jié)省人力和時間。因此，通過檢測卵黃抗體也可以推測雞群的免疫狀況。

本試驗隨機收集了寧夏銀川郊區(qū)、銀南地區(qū)和銀北地區(qū)14個蛋雞場共140枚雞蛋，進行了卵黃抗體的檢測。試驗檢測結(jié)果顯示，新城疫Lasota抗原的血凝效價為1:28，4四單位抗原為1:64。寧夏地區(qū)部分蛋雞場卵黃抗體H I效價平均值在10～13 l og2之間，個別地區(qū)卵黃抗體效價達到15 l og2，最低也在9 l og2。研究報道[13-15]，如果雞群經(jīng)新城疫疫苗免疫后，其抗體滴度平均達到6 l og2以上，雞群就可以抵御新城疫強毒的感染。但當前情況是，即使是雞群的抗體滴度平均達到8～9 l og2，疫病仍然會發(fā)生，且發(fā)病率和致死率非常高，即使利用傳統(tǒng)疫苗如 LaSota、Cl one-30甚至I系苗緊急免疫效果也較差，甚至無效?？贵w的總體水平高于10 l og2以上,則需要對雞群進行仔細檢測,看是否有強毒感染。為此，筆者對試驗中的14個蛋雞場進行了回訪，近5年上述蛋雞場并無新城疫的發(fā)病，隨機血清抗體檢測平均滴度在10～12 l og2之間，這與我們的試驗結(jié)果較為一致。劉華雷等[16]人的研究結(jié)果顯示寧夏地區(qū)新城疫的流行率為5.83%，同源性分析表明寧夏分離株與疫苗株LaSota同源性較低,但研究證實LaSota疫苗能夠抵抗基因Ⅶ型野毒株的攻擊,只是免疫保護所需要的抗體閾值越來越高[17]，這可能是導致寧夏地區(qū)新城疫卵黃抗體效價較高的原因之一。本研究結(jié)果表明，寧夏地區(qū)部分蛋雞場新城疫卵黃抗體效價較高，寧夏部分地區(qū)新城疫防治效果較好，但由于影響血凝試驗及血凝抑制試驗的因素多，樣本量及試驗條件所限，新城疫在寧夏地區(qū)的流行、發(fā)病率以及LaSota疫苗保護效率還需更多的研究。

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Analasis and Detection on Egg Yolk Antibody Titer of Newcastle Disease in Layer Farm of Ningxia Area

Zhang Dongtao;Meng Fanwei;Zhou Xuezhang
(Key Laboratory of Ministry of Education for Protection and Utilization of Special Biological Resources in theWestern China, Ning xia University, Ningxia Yinchuan 750021)

The purpose of this study is to detect and analasize the difference and level of eggyolk antibody titer of Newcastle Disease in some layers of Ningxia area. The titer of Newcastledisease virus antigen prepared in our lab was detected by blood hemagglutination assay, and hemagglutinationunits was correct. HA titer of Newcastle disease virus antigen is detected by， andegg yolk antibody titers of 140 eggs in 14 region of Ningxia is detected by hemagglutination inhibitionassay. The results that HA titer of Newcastle disease virus antigen is 8log2, titer ofyolk antibody keep higher level ranged from 10log2～13log2 averagely. Therefore，it is higher levelthat egg yolk antibody titer of Newcastle disease in Ningxia area, and this results providesexperimental data for the prevention and control of Newcastle disease in Ningxia area.

Ningxia; Newcastle Disease; Egg Yolk Antibody; Hemagglutination Assay; HemagglutinationInhibition Assay

S858.31

B

1672-9692(2016)03-0039-04

2016-01-22

張東濤(1970-)，男，副教授，碩士，研究方向為天然活性產(chǎn)物藥理學。

周學章(1969-)，男，教授，博士，主要從事分子病毒學和細菌耐藥性及生物制藥等領域的研究。