柯薩奇病毒A6型VP1蛋白的生物信息學(xué)分析①

劉洪波 陽廣菲 歐維琳 沈關(guān)心

(桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，桂林541199)

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柯薩奇病毒A6型VP1蛋白的生物信息學(xué)分析①

劉洪波 陽廣菲②歐維琳③沈關(guān)心④

(桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，桂林541199)

目的：預(yù)測柯薩奇病毒A組6型(Coxsackievirus A6，CVA6)的衣殼蛋白VP1的基本理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能及線性B細(xì)胞表位。方法：應(yīng)用Bioedit軟件、SubLoc、TargetP和生物信息學(xué)資源門戶ExPASy中的多種在線工具對CVA6 VP1的氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果：CVA6 VP1為一親水性蛋白，其相對分子量為33.6 kD，等電點(diǎn)為7.92，含有24個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)，沒有信號肽、跨膜區(qū)和可能的脂?；稽c(diǎn)；其二級結(jié)構(gòu)中以無規(guī)則卷曲居多，有48.52%的氨基酸殘基暴露于溶液界面；該分子內(nèi)存在多個(gè)潛在的線性B細(xì)胞表位，其中的155～165位氨基酸殘基區(qū)域的抗原指數(shù)最高。結(jié)論：成功預(yù)測到CVA6 VP1的基本理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能特征及可能的線性B細(xì)胞表位，為該蛋白的進(jìn)一步研究及疫苗和免疫診斷試劑的研制打下基礎(chǔ)。

柯薩奇病毒A組6型；VP1蛋白；生物學(xué)信息；B細(xì)胞表位；理化性質(zhì)

手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是兒童常見傳染病，其病原包括柯薩奇病毒(Coxsackievirus,CV)、?？虏《竞托滦腿四c道病毒(Human enterovirus,HEV)的各部分成員，EV71型和CV A組(CVA)16型為最常見[1,2]。然而，近年其他HEV感染病例有增多趨勢[3]； CVA6型在多個(gè)國家和地區(qū)引起HFMD的暴發(fā)流行，也成為HFMD常見病原之一，并且可導(dǎo)致重癥發(fā)生[4]。目前，鮮有針對該病原的基礎(chǔ)性研究。

HEV的VP1具有與其血清型相對應(yīng)的遺傳多樣性[5]，是其中和表位存在的最主要區(qū)域[6]，也是其毒力可能相關(guān)的區(qū)域之一[7]，具有重要研究價(jià)值。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法，對CVA6代表株VP1的基本理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能特征和含有的線性B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測分析，為該病原的生物學(xué)特性研究以及疫苗和診斷試劑的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 CVA6 VP1氨基酸序列和生物信息學(xué)工具 從NCBI數(shù)據(jù)庫檢索并下載CVA6的全長VP1氨基酸序列，選擇Gdula株(protein ID為AAD17701.1)的VP1序列為代表進(jìn)行分析。除Bioedit軟件外，本研究主要利用SubLoc V1.0、TargetP 1.1和生物信息學(xué)資源門戶網(wǎng)站ExPASy(http://www.expa-sy.org/)提供的多種在線工具對VP1進(jìn)行分析。這些在線工具的網(wǎng)址鏈接、參考文獻(xiàn)和選擇的參數(shù)見表1。

1.2 CVA6 VP1的理化性質(zhì)預(yù)測 利用Bioedit對VP1的氨基酸組成進(jìn)行分析；利用ProtParam預(yù)測相關(guān)VP1的原子組成、等電點(diǎn)、消光系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)以及在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞、酵母和大腸桿菌中的半衰期等；利用ProtScale中Kyte和Doolittle方法預(yù)測共疏水性/親水性。

1.3 CVA6 VP1的結(jié)構(gòu)功能和B細(xì)胞表位等的預(yù)測 利用SignalP預(yù)測VP1蛋白的信號肽；利用Tmpred和TMHMM進(jìn)行跨膜螺旋預(yù)測；利用NetPhos預(yù)測磷酸化位點(diǎn)；利用Net-NGlyc和MotifScan預(yù)測糖基化、酯?；刃揎椢稽c(diǎn)，并用Big-PI Predictor預(yù)測糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)修飾位點(diǎn)；利用SubLoc V1.0和TargetP 1.1對VP1蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，并利用NetNES進(jìn)行核定位信號分析；利用InterProScan、SMART和PROSITE對VP1一級結(jié)構(gòu)中包含的結(jié)構(gòu)和功能域特征序列進(jìn)行分析；利用SOPMA和Predictprotein預(yù)測蛋白質(zhì)VP1的二級結(jié)構(gòu)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等；運(yùn)用Bepipred預(yù)測VP1中可能的B細(xì)胞線性表位。

2 結(jié)果

2.1 理化性質(zhì)

2.1.1 氨基酸的組成 應(yīng)用Bioedit軟件對CVA6 VP1的氨基酸組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，由305個(gè)氨基酸組成的VP1中Ala(28個(gè)，9.2%)、Ser(28個(gè)，9.2%)、Thr(28個(gè)，9.2%)和Val(25個(gè)，8.2%)含量較多；所含堿性氨基酸和酸性氨基酸總數(shù)分別為26和25，分別占總氨基酸數(shù)的8.5%和8.2%(見圖1)。

2.1.2 基本理化性質(zhì) 利用ProtParam工具預(yù)測了VP1蛋白的基本理化參數(shù)。該蛋白的原子組成為C1478H2269N415O461S12 ，相對理論分子量為33.6 kD，等電點(diǎn)為7.92。假設(shè)全部胱氨酸殘基以Cys形式形成二硫鍵，則其在水溶液中(A280nm)的摩爾消光系數(shù)為44 475 L/(mol·cm)；假設(shè)所有二硫鍵打開，其在水溶液中(A280nm)的摩爾消光系數(shù)則為44 350 L/(mol·cm)。若VP1 N端為Asn，其在哺乳動(dòng)物體外網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為1.4 h，在酵母體內(nèi)為3 min，在大腸桿菌內(nèi)大于10 h。其不穩(wěn)定系數(shù)為43.50，屬于不穩(wěn)定蛋白。

表1 本文使用工具

Tab.1 Tools used in this paper

ToolsnameWebsiteReferenceBig-PIPredictorhttp://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.htmlTrendsBiochemSci,2000,25(7):340-341[J].Bepipredhttp://tools.immuneepitope.org/bcell/ImmunomeRes,2006,2:2[J].InterProScanhttp://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html/Bioinformatics,2014,30(9):1236-1240[J].MotifScanhttp://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scanUnpublishedNetPhoshttp://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/JMolBiol,1999,294(5):1351-1362[J].Net-NGlychttp://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/UnpublishedNetNEShttp://www.cbs.dtu.dk/services/NetNESProteinEngDesSel,2004,17(6):527-536[J].ProtParamhttp://www.expasy.ch/tools/protparam.htmlTheProteomicsProtocolsHandbook,2005,571-607[M].ProtScalehttp://www.Expasy.org/cgi-bin/protscale.plTheProteomicsProtocolsHandbook,2005,571-607[M].Predictproteinhttps://www.predictprotein.org/homeNucleicAcidsRes,2014,42:W337-43[J].PROSITEhttp://au.expasy.org/prosite/NucleicAcidsRes,2006,34:W362-365[J].SOPMAhttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.htmlBMCBioinformatics,2006,7(1):255[J].SignalPV2.0.b2http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/#submis-sionProcIntConfIntellSystMolBiol,1998,6:122-130[C].SubLochttp://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/Bioinformatics,2001,17(8):721-728[J].SMARThttp://smart.embl-heidelberg.de/NucleicAcidsRes,2015,43:D257-D260[J].Tmpredhttp://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.htmlBiolChemHoppe-Seyler,1993,374:166[J].TMHMMhttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/Bioinformatics,2001,17(7):646-653[J].TargetP1.1http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/JMolBiol,2000,300(4):1005-1016[J].

Note：Tools are listed in alphabetical order;In this study,all tools were run in their default settings except MotifScan,which selected “mot_source:freq_pat” for application;The references for these tools were presented with some essential information for retrieval,but no publications are so far available for the two tools,MotifScan and Net-NGlyc.

2.1.3 疏水性分析 使用ProtParam預(yù)測VP1 氨基酸序列平均親水性，其脂肪指數(shù)61.08，GRAVY值為-0.459(范圍介于2和-2之間，正值表明為疏水性強(qiáng)，負(fù)值表明為親水性強(qiáng))。運(yùn)用ProtScale 中Kyte和Doolittle法預(yù)測VP1氨基酸序列的疏水性，從結(jié)果(圖2)可以看出，在整個(gè)肽鏈中，親水性氨基酸均勻分布，遠(yuǎn)多于疏水性氨基酸；多肽鏈第161位的Arg分值-2.600最低(親水性最強(qiáng))，第87位的Gly分值2.011最高(疏水性最強(qiáng))。這些結(jié)果提示，VP1蛋白脂溶性差，親水性好，為一可溶的親水性蛋白。

2.2 功能相關(guān)序列/結(jié)構(gòu)分析

圖1 CVA6 VP1的氨基酸組成分布圖Fig.1 Amino acid composition of CVA6 VP1

圖2 CVA6 VP1的疏水性分析Fig.2 Hydrophobicity analysis of CVA6 VP1

2.2.1 信號肽 應(yīng)用Signal P對VP1蛋白進(jìn)行信號肽分析，信預(yù)測值為0.002，遠(yuǎn)低于cutoff值0.5(圖3)，提示VP1為非分泌性蛋白。

2.2.2 跨膜螺旋 使用Tmpred預(yù)測，其分值小于0，沒有發(fā)現(xiàn)可能的模型；用TMHMM預(yù)測，VP1整條肽鏈均處于膜外(圖4)。據(jù)此推測，VP1不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。

圖3 SignalP預(yù)測CVA6 VP1信號肽Fig.3 Prediction of CVA6 VP1 signal peptide by SignalP

圖4 CVA6 VP1的跨膜螺旋預(yù)測Fig.4 Prediction of transmembrane helices in CVA6 VP1

圖5 CVA6 VP1的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.5 Prediction of phosphorylation sites in CVA6 VP1

圖6 CVA6 VP1的糖基化修飾位點(diǎn)預(yù)測Fig.6 Prediction of glycosylation sites in CVA6 VP1

圖7 CVA6 VP1的核定位信號分析Fig.7 Analysis of nuclear localization signal in CVA6VP1

2.2.3 磷酸化位點(diǎn) 應(yīng)用NetPhos對VP1進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，VP1蛋白中共有24個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)，13個(gè)位于Ser，6個(gè)位于Thr，5個(gè)位于Tyr 殘基(見圖5)。

2.2.4 酯酰化和糖基化位點(diǎn) 用MotifScan預(yù)測，在VP1中沒有找到可能的脂?；揎椢稽c(diǎn)；以Big-PI預(yù)測也證實(shí)，VP1中無可能的GPI錨定位點(diǎn)。用Net-NGlyc預(yù)測，在VP1中發(fā)現(xiàn)可能的糖基化位點(diǎn)有3個(gè)，分別位于第53、137、171位氨基酸殘基(見圖6)。然而，由于VP1不含信號肽序列，因此幾乎不可能產(chǎn)生糖基化修飾。

2.2.5 亞細(xì)胞定位 利用SubLoc預(yù)測，結(jié)果顯示VP1可能定位在細(xì)胞核上。而利用TargetP預(yù)測，結(jié)果顯示VP1 線粒體靶向肽(mTP)和分泌通路信號肽(SP)數(shù)值都不高，定位于其他任何位置均有可能。以NetNES進(jìn)行核定位信號分析，各值均未超過閾值，提示該蛋白不含核定位信號(見圖7)。各工具預(yù)測結(jié)果不同，可能是不同工具利用的數(shù)據(jù)庫不同而產(chǎn)生的差異，說明針對病毒蛋白亞細(xì)胞定位的數(shù)據(jù)庫或預(yù)測工具尚不成熟，其亞細(xì)胞定位需以實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖8 InterProScan預(yù)測CVA6 VP1蛋白一級結(jié)構(gòu)中的保守功能域Fig.8 Prediction of conserved function domains in primary structure of CVA6 VP1 by InterProScan

圖9 CVA6 VP1的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和親水性特征Fig.9 Characteristics of topological structure,secondary structure and hydrophilicity of CVA6 VP1

圖10 Bepipred工具預(yù)測CVA6 VP1的線性B細(xì)胞表位Fig.10 Prediction of linear B-cell epitope of CVA6 VP1 by tool Bepipred

圖11 CVA6 VP1 潛在的線性B細(xì)胞表位位點(diǎn)Fig.11 Potential linear B-cell epitope sites on CVA6 VP1

2.2.6 一級結(jié)構(gòu)中所含結(jié)構(gòu)和功能域特征序列分析 對VP1序列使用InterProScan分析的結(jié)果顯示，VP1含有2個(gè)結(jié)構(gòu)和功能域，一個(gè)是位于VP1中間與RhV具有同源性的小RNA病毒蛋白結(jié)構(gòu)域，另一個(gè)是與DUF3724具有同源性的未知功能的RNA病毒蛋白結(jié)構(gòu)域； 除VP1左端外的大部分序列屬于SSF88633超家族，含有非整合信號(見圖8)。以SMART預(yù)測發(fā)現(xiàn)，VP1序列第56～217位區(qū)域與Pfam數(shù)據(jù)庫中RhV結(jié)構(gòu)域相似，第262～284位與DUF3724結(jié)構(gòu)域相似。而運(yùn)用PROSITE預(yù)測，未發(fā)現(xiàn)存在特異性的結(jié)構(gòu)和功能域。

2.3 二級結(jié)構(gòu)特征 以SOPMA預(yù)測，VP1中α-螺旋比例為27.87%，β-折疊為24.92%，β-轉(zhuǎn)角為8.52%，無規(guī)則卷曲為38.69%。以Predictprotein預(yù)測，α-螺旋比例為9.84%，β-折疊為25.90%，無規(guī)則卷曲為64.26%(見圖9)。結(jié)合兩種方法預(yù)測的結(jié)果可知，α-螺旋和β-折疊散布于整個(gè)VP1蛋白，成為蛋白的剛性支撐；而無規(guī)則卷曲為其中比例最高的結(jié)構(gòu)元件，間雜少量的β-轉(zhuǎn)角，為蛋白的柔性區(qū)域，是抗原表位存在的可能部位。Predictprotein預(yù)測也顯示了VP1中每個(gè)氨基酸的溶劑可及性，其中48.52%的氨基酸殘基暴露于溶液界面，44.26%的氨基酸殘基包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部，其余7.21%的氨基酸處于中間態(tài)(見圖9)。

2.4 線性B細(xì)胞表位 運(yùn)用Bepipred 法預(yù)測B細(xì)胞線性表位，結(jié)果顯示VP1 蛋白平均抗原性指數(shù)為0.442，分子內(nèi)共有多個(gè)可能的抗原表位區(qū)域(圖10)。其中，分值最高的表位區(qū)域?yàn)榈?51-173位氨基酸殘基區(qū)段，分值達(dá)2.82(閾值0.350)；其次為第177-188，91-103，203-222和25-58位氨基酸區(qū)段(按分值高低排列)，其余位點(diǎn)見圖11。

3 討論

在基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)代，運(yùn)用生物信息學(xué)工具分析蛋白質(zhì)序列已成為蛋白質(zhì)研究的重要手段[8]。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測可以用于蛋白質(zhì)分離鑒定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等，如分子量、凈電荷和親和力數(shù)據(jù)為蛋白質(zhì)色譜分離提供先驗(yàn)信息；蛋白質(zhì)序列比對分析可以了解其進(jìn)化和可能的結(jié)構(gòu)和功能特征等。這些為蛋白質(zhì)的進(jìn)一步研究提供諸多信息，可大大提高蛋白質(zhì)相關(guān)研究的工作效率。CVA6與EV71同屬于HEV A組成員，親緣關(guān)系很近，它們的VP1有著較高的序列一致性[9]，因此已有的諸多EV71 VP1相關(guān)研究可為CVA6 VP1的生物信息學(xué)分析提供預(yù)示信息[6,10-12]。比較俞海洋等[10]的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，CVA6和EV71的VP1蛋白具有很多相同或相似的理化和結(jié)構(gòu)特征，例如，兩者均為可溶的親水性蛋白，無信號肽和跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，均存在與RhV相似的結(jié)構(gòu)域，約50%氨基酸殘基暴露于溶液界面，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主等。這些相同或相似的理化和結(jié)構(gòu)也預(yù)示它們VP1可能存在相似的功能。蛋白質(zhì)的可逆磷酸化被認(rèn)為是細(xì)胞調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的最頻繁和通用的機(jī)制[13]。病毒蛋白可以通過磷酸化/去磷酸化過程干擾宿主細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，也使自身的生物學(xué)功能發(fā)生改變[14,15]。有研究證實(shí)，EV71可通過VP1激活細(xì)胞鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶II而對宿主細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和EV71自身的復(fù)制產(chǎn)生影響[11]。本研究預(yù)測發(fā)現(xiàn)，與EV71 VP1相似[10]，CVA6的VP1中也存在較多的磷酸化位點(diǎn)。因此我們推測，CVA6 VP1也是影響其自身復(fù)制循環(huán)和致病的重要分子。

運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測蛋白質(zhì)的抗原優(yōu)勢表位，并通過體外合成肽段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)抗原表位的鑒定[16]。通過該方法，已成功鑒定出包括EV71病毒在內(nèi)的多種病原體抗原表位[6,16]。Bepipred方法是結(jié)合線性B細(xì)胞表位預(yù)測的一種經(jīng)典算法和最佳預(yù)測模型-隱馬爾科夫模型發(fā)展的一種改良的傾向量表法；以HIV數(shù)據(jù)集驗(yàn)證，其曲線下面積優(yōu)于多種傳統(tǒng)方法[17]。本研究利用該方法預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CVA6 VP1分子的抗原性很強(qiáng)(抗原性指數(shù)為0.442)，可能的線性B細(xì)胞表位分布于各個(gè)區(qū)段。與本文的其他預(yù)測結(jié)果非常相符，如較高的極性氨基酸比例、較強(qiáng)的親水性和較多的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)等。另外，本研究預(yù)測到CVA6的可能B細(xì)胞表位25-58和203-222區(qū)段與已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的EV71的SP12和SP70表位核心區(qū)域重疊且存在較多保守性氨基酸殘基[12]。結(jié)果提示，該兩肽段含B細(xì)胞表位的可能性較大，且EV71和CVA6之間可能存在交叉反應(yīng)性；另一方面，這些表位中氨基酸殘基變異亦可能是導(dǎo)致這些病原抗原性轉(zhuǎn)變或其抗體親合力下降的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[18]，這些值得進(jìn)一步研究。

總之，本研究對CVA6的主要衣殼蛋白VP1的生物信息學(xué)分析，成功預(yù)測到其基本的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能特征以及潛在的線性B細(xì)胞表位，這將有助于對其VP1蛋白的深入研究以及為疫苗和免疫診斷試劑的研制奠定理論基礎(chǔ)。

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[收稿2015-09-06 修回2015-09-15]

(編輯 許四平)

Bioinformatics analysis of VP1 protein of coxsackievirus A6

LIU Hong-Bo,YANG Guang-Fei,OU Wei-Lin,SHEN Guan-Xin.Department of Laboratory Medicine,the Second Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541199，China

Objective:To predict the basic physicochemical properties,structure and function,and linear B-cell epitopes of the capsid protein VP1 of coxsackievirus A6(CVA6).Methods: The amino acid sequence of the CVA6 VP1 was analyzed using Bioedit software and various online tools including SubLoc，TargetP and the others from ExPASy Bioinformatics Resource Portal.Results: The CVA6 VP1 protein was a hydrophilic protein with a relative molecular weight of 33.6 kD and an isoelectric point of 7.92.This protein containsed 24 phosphorylation sites,but no signal peptide,transmembrane domains and possible fatty acylation sites.Its secondary structure was characterized by the richest random coils,and 48.52 percent of its amino acid residues exposed at the solution interface.Epitope prediction by Bepipred showed a number of potential B cell epitopes in the protein,the highest antigenicity index among them located in the region of amino acids residue 155-165.Conclusion: The basic physicochemical properties,structure and function characteristics,and potential linear B-cell epitopes of CVA6 VP1 were successfully predicted,which laid foundations for the further study on the protein and the preparation of vaccines and immunological diagnostic reagents for CVA6 infection.

Coxsackievirus A6；VP1 protein；Bioinformatics；B-cell epitope；Physicochemical property

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.019

①本文為國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81460304；81360248)和廣西自然科學(xué)基金(2015GXNSFDA139020)和廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳科研課題(Z2014298)。

劉洪波(1973年-)，男，博士，副主任技師，碩士生導(dǎo)師，主要從事新型疫苗、分子流行病學(xué)和分子診斷技術(shù)研究，E-mail:hbliu@glmc.edu.cn。

R373.2+3

A

1000-484X(2016)04-0536-06

②并列第一作者，桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院臨床藥學(xué)， 桂林541004。

③桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，桂林528403。

④華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，武漢430030。

指導(dǎo)教師：沈關(guān)心(1952年-)，男，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子免疫與免疫相關(guān)疾病研究。