二十五味珊瑚丸的微生物限度檢查方法驗(yàn)證

王瑋　古桑德吉　德吉卓嘎

【摘 要】 目的：建立二十五味珊瑚丸微生物檢查方法。 方法：分別采用傾注法和薄膜過(guò)濾法對(duì)4種陽(yáng)性菌株進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：二十五味珊瑚丸有較強(qiáng)的抑菌作用，采用薄膜過(guò)濾法才能徹底消除其抑菌作用，3種菌株回收率均能達(dá)到50%。結(jié)論：采用薄膜過(guò)濾法測(cè)定二十五味珊瑚丸中的需氧菌，霉菌和酵母菌可按傾注法測(cè)定，控制菌可按常規(guī)法測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】 二十五味珊瑚丸；傾注法；薄膜過(guò)濾法

【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）20-0027-03

藏藥二十五味珊瑚丸（藏藥名：球瑪爾尼阿日布）由公元18世紀(jì)著名藏醫(yī)藥學(xué)家帝瑪爾·丹增彭措研制，轉(zhuǎn)載于公元19世紀(jì)藏醫(yī)藥學(xué)家迷旁·朗杰加措編撰的《集藥利樂(lè)庫(kù)》，該書記載了二十五味珊瑚丸的配方及功能主治，并沿用至今[1]，現(xiàn)收載于1995年版中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（藏藥第1冊(cè)）中。該藏藥由珊瑚、珍珠、訶子、木香、青金石、麝香、紅花等25味藏藥材組成的復(fù)方制劑，具有開(kāi)竅、通絡(luò)、止痛等功效。用于“白脈病”神志不清、身體麻木、頭昏目眩、腦部疼痛、血壓不調(diào)、頭痛、癲癇及各種神經(jīng)性疼痛。此標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有規(guī)定具體的微生物限度檢查方法，為確保微生物檢查方法的科學(xué)性和結(jié)果的準(zhǔn)確性，研究按照《中國(guó)藥典》2015年版第四部的規(guī)定對(duì)其微生物限度檢查進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。

1儀器與材料

11 樣品 二十五味珊瑚丸（A企業(yè)，批號(hào)141104；B企業(yè)，批號(hào)20150506；C企業(yè)，批號(hào)20150407；D企業(yè)，批號(hào)150401）。

12 試驗(yàn)用培養(yǎng)基 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號(hào)：151228）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號(hào)：151230）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)：151219）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：151219）、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（批號(hào)：150916）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：151210）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)：151204）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：141016）均為北京陸橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

13 試驗(yàn)菌株 大腸埃希菌（CMCC（B）44 102）、金黃色葡萄球菌（CMCC（B）26 003）、枯草芽孢桿菌（CMCC（B）63 501）、白色念珠菌（CMCC（F）98 001）、乙型副傷寒沙門菌（CMCC（B）50 094）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

14 儀器 BPG-9200BH型高溫鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科技有限公司）；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；PYX-PHS-60×75-BS-Ⅱ型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；1300系列Ⅱ級(jí)A2型生物安全柜（美國(guó)熱電公司）；HTV-200型集菌儀（杭州泰林醫(yī)療器械廠）；2H-2型自動(dòng)漩渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；PL202-S電子天平（梅特勒-托多儀器（上海）有限公司）；YXQ-LS-50S11型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

2 方法與結(jié)果

21 菌液的制備 按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015版）四部非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查[2]。

211 菌液制備 接種大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門菌和金黃色葡萄球新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)液中，30～35℃培養(yǎng)36h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)36h。乙型副傷寒沙門菌為控制菌檢查用菌，不用于菌株回收率測(cè)定。

212 供試液制備 稱取樣品10g，加入pH70氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，制成1∶10供試液；吸取1∶10供試液1mL，加入pH70氯化鈉-蛋白胨緩沖液至10mL，制成1∶100供試液。

213 試驗(yàn)組 取上述制備好的供試液，加入制備好的菌液，混勻，分別制成每1mL含菌數(shù)為10～100CFU的試驗(yàn)菌液。

214 供試液對(duì)照組 取“212”制備好的供試液，以稀釋液代替菌液其他同試驗(yàn)組。

215 菌液對(duì)照組 取pH70氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入菌液來(lái)進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

22 傾注法

221 試驗(yàn)組 取1∶10試驗(yàn)菌液1mL注入平皿中，含白色念珠球菌組傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基15～20mL，除含白色念珠球菌組外傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基15～20mL，待凝固后，含白色念珠菌組置于25～28℃培養(yǎng)5d，除白色念珠菌組外置于30～35℃培養(yǎng)72h，觀察結(jié)果測(cè)定菌落數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)菌株平行制作2個(gè)平皿。

222 供試品對(duì)照組 取“214”試液1mL注入平皿中，按傾注法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

223 菌液對(duì)照組 取“215”試液1mL注入平皿中，其他同試驗(yàn)組。

224 稀釋劑對(duì)照組 取稀釋液1mL注入平皿中，其他同試驗(yàn)組。

225 結(jié)果 經(jīng)試驗(yàn)，表1中選取的4個(gè)廠家樣品均對(duì)白色念珠球菌無(wú)明顯抑制作用，回收率在50%以上，采用傾注法即可滿足對(duì)樣品中霉菌及酵母菌的檢查。樣品對(duì)大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌無(wú)明顯抑制作用，回收率在50%以上，但對(duì)枯草芽孢桿菌有明顯抑制作用，回收率大部分在50%以下。表2采用1∶100供試液測(cè)定了菌株的回收率，回收率大部分在50%以下。結(jié)果表明采用傾注法可能無(wú)法滿足對(duì)樣品中需氧菌的檢查，故接下來(lái)采用薄膜過(guò)濾法法對(duì)谷草芽孢桿菌回收率進(jìn)行測(cè)定。

23 薄膜過(guò)濾法

231 試驗(yàn)組 取1∶10試驗(yàn)菌液2mL注入薄膜過(guò)濾器中，用100mL pH70氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，使分散均勻，全量過(guò)濾，再以pH70氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100mL沖洗4次，全量濾過(guò)，轉(zhuǎn)帖至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上。由表1中看出樣品對(duì)于枯草芽孢桿菌的抑制作用比較強(qiáng)，先進(jìn)行枯草芽孢桿菌回收率的測(cè)定。

232 供試品對(duì)照組 取“214”制備的試液2mL加入薄膜過(guò)濾器中，不加試驗(yàn)菌液，其它同試品驗(yàn)組。

233 菌液對(duì)照組 取“215”制備的試驗(yàn)液2mL加入薄膜過(guò)濾其中，用100mL pH70氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，使分散均勻，全量過(guò)濾，轉(zhuǎn)帖至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上。

234 稀釋劑對(duì)照組 取稀釋液2mL薄膜過(guò)濾器中，用100mL pH70氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，使分散均勻，全量過(guò)濾，轉(zhuǎn)帖至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上。

235 結(jié)果 表4中，1∶10供試液任對(duì)試驗(yàn)菌有一定的抑制作用。表5為稀釋液對(duì)照組實(shí)驗(yàn)菌株的回收率。表6中，用同樣薄膜過(guò)濾法法取1∶100供試液測(cè)定了菌株的回收率，結(jié)果表明，各試驗(yàn)菌株回收率均大于50%，故采用1∶100供試品溶液進(jìn)行薄膜過(guò)濾法，適用于二十五味珊瑚丸的細(xì)菌的微生物限度測(cè)定試驗(yàn)。

24 控制菌檢查法的驗(yàn)證 本品為含藥材原粉的固體口服藥，因此以大腸埃希菌和沙門菌為控制菌進(jìn)行驗(yàn)證。

241 試驗(yàn)組 取1∶10供試液10mL及大腸埃希試驗(yàn)菌液1mL加入100mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中；直接稱取供試品10g及乙型副傷寒沙門菌液1mL加入200mL胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)液中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。試驗(yàn)菌液溶度均在10～100CFU。

242 供試品對(duì)照組 其他同供試品組但不加入試驗(yàn)菌液。

243 稀釋劑對(duì)照組 取pH70氯化鈉-蛋白胨緩沖液1mL加入10mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

244 結(jié)果 采用常規(guī)控制菌檢查法，均能檢出試驗(yàn)菌，表明此法可適用于二十五珊瑚丸的控制菌檢查。

3 討論

二十五味珊瑚丸是含有多種成分的復(fù)合制劑，通過(guò)傾注法不難發(fā)現(xiàn)二十五味珊瑚丸是一種抑菌作用較強(qiáng)的藥品，在本次驗(yàn)證過(guò)程中首先考慮增加稀釋液和薄膜過(guò)濾法聯(lián)用來(lái)去除藥品中的抗菌活性。薄膜過(guò)濾法能很好的把外界影響和操作者的主觀因素減少到最低，所以該方法更為客觀，能夠全面反映藥品的染菌情況[3]。

由于西藏自然環(huán)境特殊，海拔高，含氧量?jī)H為平原地區(qū)的60%左右，在制備金黃色葡萄球菌和其他試驗(yàn)用菌時(shí)，需將培養(yǎng)時(shí)間由《中國(guó)藥典》2015年版第四部中規(guī)定的18～24h延長(zhǎng)至36h，才能良好生長(zhǎng)，故將試驗(yàn)用菌培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至36h。

參考文獻(xiàn)

[1] 杜文兵，黃福開(kāi)，羅遠(yuǎn)帶，等. 二十五味珊瑚丸藥理及臨床研究進(jìn)展[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，8（5）：537-540.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典（四部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：1105-1106.

[3]王亞婷. 薄膜過(guò)濾法在藥品微生物限度檢查中的應(yīng)用[J].河北化工，2013，36（4）：8-9.

（編輯：程鵬飛）