擬盤(pán)多毛孢屬真菌侵染藍(lán)莓的一個(gè)新紀(jì)錄種:Pestalotiopsis kenyana

曹 瑩,張 爽,齊鷹博,張 娟,劉 闖,嚴(yán)雪瑞

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽(yáng),110866)

藍(lán)莓(Blueberry)是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacinium)植物。藍(lán)莓為一種新興小漿果,其富含多種對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)成分,具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,已經(jīng)引起廣泛關(guān)注,產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢(shì)頭迅猛。截至2020年底,全國(guó)藍(lán)莓栽培面積已達(dá)到6.64萬(wàn)hm2,總產(chǎn)量34.72萬(wàn)t[1]。類(lèi)擬盤(pán)多毛孢真菌是為害藍(lán)莓引起枝枯及葉斑病的主要致病菌類(lèi)群,其包含3個(gè)屬,分別為Pestalotiopsis、Neopestalotiopsis和Pseudopestalotiopsis,這3個(gè)屬形態(tài)特征相似,直到2014年Neopestalotiopsis和Pseudopestalotiopsis才從Pestalotiopsis中正式區(qū)分出來(lái),成立新屬。屬間的差異可利用核糖體大亞基(Ribosomal Large Subunit,LSU)基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)區(qū)分,種間的差異可利用核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer,ITS)、β-微管蛋白(Bete-tubulin,TUB)和轉(zhuǎn)錄延伸因子-1(Transcription elongation factor-1,tef1)基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)區(qū)分[2]。截至目前,國(guó)內(nèi)外已報(bào)道為害藍(lán)莓的類(lèi)擬盤(pán)多毛孢真菌有8個(gè)種,分別屬于Pestalotiopsis屬和Neopestalotiopsis屬,目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Pseudopestalotiopsis屬真菌為害藍(lán)莓的情況。其中,Pestalotiopsisguepini可引致阿根廷藍(lán)莓莖枯病,主要為害“密斯提”“夏普藍(lán)”“藍(lán)豐”品種[3];P.clavispora(現(xiàn)已更名為Neopestalotiopsisclavispora)和P.neglecta在智利為害北高叢和南高叢藍(lán)莓,造成潰瘍病和枝枯病[4];P.photiniae引起吉林產(chǎn)地矮叢藍(lán)莓葉斑病[5];P.trachicarpicola為害廣西兔眼藍(lán)莓引起葉斑病,同年還發(fā)現(xiàn)福建兔眼藍(lán)莓枝枯病是由N.chrysea為害引起的[6-7];貴州藍(lán)莓枝枯病由P.vismiae[8]為害引起;N.rosae引起了秘魯藍(lán)莓枯萎病[9]。

本實(shí)驗(yàn)室前期在福建、四川和云南等地區(qū)采集了藍(lán)莓枝枯病樣,發(fā)病枝條上的病斑褐色,邊緣有深褐色暈圈,嚴(yán)重時(shí)整枝枯死,后期病斑上著生黑色小顆粒。對(duì)這些病樣進(jìn)行組織分離,其后進(jìn)行單孢分離和純化,獲得供試菌株,并通過(guò)形態(tài)觀(guān)察和ITS序列比對(duì)初步確定其屬水平的分類(lèi)地位。其后,將其與所在屬內(nèi)的已報(bào)道為害藍(lán)莓的種群進(jìn)行比對(duì)。在進(jìn)行擬盤(pán)多毛孢屬供試菌株與已報(bào)道菌株比對(duì)時(shí),發(fā)現(xiàn)了5株菌疑似為為害藍(lán)莓的新紀(jì)錄種或新種。為明確這5株菌的分類(lèi)地位,采用核糖體大亞基(LSU)、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、β-微管蛋白(TUB)和轉(zhuǎn)錄延伸因子-1(tef1)4段基因分別進(jìn)行了屬水平、骨架樹(shù)水平和近緣種水平等三層次的系統(tǒng)發(fā)育分析,并結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)對(duì)其進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株編號(hào)分別為FZXM0222A、SCCD01Ch、SCCD01Ck、YN06E2和YN06F,分別來(lái)自福建、四川和云南,于-80 ℃條件下備用保存。

1.2 致病性測(cè)定方法

采用活體枝條回接法測(cè)定分離菌株的致病性。在長(zhǎng)勢(shì)均勻的盆栽2年生健康藍(lán)莓中,選取粗細(xì)及軟硬程度一致的枝條進(jìn)行摘葉處理,用酒精棉輕輕擦拭枝條進(jìn)行消毒;之后用無(wú)菌解剖刀劃傷枝條造成傷口。接種培養(yǎng)3 d的供試菌株的菌餅(直徑5 mm),把菌餅帶菌面貼在枝條傷口處,用無(wú)菌脫脂棉與無(wú)菌水進(jìn)行保濕處理,重復(fù)3次。以5 mm PDA圓餅作為對(duì)照,其他步驟同上。將處理后的枝條放置在28 ℃下,48 h后摘除菌餅和對(duì)照PDA圓餅,10 d后測(cè)定病斑擴(kuò)展長(zhǎng)度,并從病斑處分離病原菌。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定方法

觀(guān)察供試菌株的菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢情況等。待供試菌株產(chǎn)孢后,用Olympus BX43顯微鏡觀(guān)察其分生孢子的形態(tài),測(cè)量分生孢子大小及頂端附屬絲長(zhǎng)度、基部附屬絲長(zhǎng)度等,拍攝分生孢子照片。每個(gè)供試菌株觀(guān)察30個(gè)分生孢子。

1.4 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序方法

DNA提取:供試菌株放置在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)中,在回旋振蕩器(125 轉(zhuǎn)/min)上震蕩培養(yǎng)6 d左右,用紗布濾掉多余的培養(yǎng)基后,清洗,烘干,收集菌絲;利用DNA提取試劑盒提取供試菌株DNA。

PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序:LSU、ITS、TUB和tef1各段基因的擴(kuò)增引物、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序均參考石凌波[10]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)以后,送至上海生工生物公司進(jìn)行純化和雙向測(cè)序。

1.5 分子系統(tǒng)發(fā)育分析方法

采用三層次系統(tǒng)發(fā)育分析方法。

屬水平系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立:將供試菌株的LSU基因與類(lèi)擬盤(pán)多毛孢真菌不同屬代表菌株的LSU基因進(jìn)行建樹(shù),從而將供試菌株鑒定到屬級(jí)別。

骨架樹(shù)水平系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立:采用ITS、TUB和tef1 等3段基因聯(lián)合建樹(shù),將供試菌株與上一步確定的屬中種群代表菌株進(jìn)行建樹(shù)(為簡(jiǎn)化操作,近緣分支只選一個(gè)種群作為代表),從而確定供試菌株的近緣種分支。代表菌株的挑選參照Maharachchikumbura等[2]和Wang等[11]的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),具體代表菌株信息見(jiàn)表1。

表1 已知代表菌株信息及基因登錄號(hào)

近緣種水平系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立:采用ITS、TUB和tef1 等3段基因聯(lián)合建樹(shù),將供試菌株與近緣種分支中的所有菌株進(jìn)行建樹(shù)分析,從而確定供試菌株的分類(lèi)地位。

使用MAFFT v.7對(duì)基因序列進(jìn)行比對(duì)。使用MEGA X 軟件[12]構(gòu)建不同層次的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),采用最大似然法ML,Bootstrap值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的致病性及形態(tài)學(xué)特征

供試菌株在PDA上25 ℃培養(yǎng)15 d后,菌落直徑達(dá)到90 mm,菌落正面為白色,背面乳白色至淡黃色;菌落呈放射狀生長(zhǎng),生長(zhǎng)較為旺盛,輪紋不明顯(見(jiàn)圖1A和B)。后期產(chǎn)孢,且有黑色稀疏的子實(shí)體(見(jiàn)圖1D)。其分生孢子大小為(20.7 ～28.8)μm×(4.7～7.2)μm;具2～3根頂端附屬絲,長(zhǎng)度為10.3～20.5 μm;基部附屬絲長(zhǎng)度為 3.5～7.0 μm;中間三色細(xì)胞同淺棕色,長(zhǎng)度為13.2～18.0 μm(見(jiàn)圖1 C)。該形態(tài)特征與P.kenyana相似。將供試菌株接種到健康的藍(lán)莓枝條上,接種部位出現(xiàn)病斑并迅速擴(kuò)展,對(duì)照組不發(fā)病。部分枝條接種后期病斑上產(chǎn)生黑色分生孢子盤(pán),與采集到的藍(lán)莓病樣癥狀一致(見(jiàn)圖1E、F和G)。

注:A-B:在PDA上25 ℃培養(yǎng)15 d的菌落正面和背面,C:分生孢子,D:菌落上產(chǎn)生的子實(shí)體,E:枝枯癥狀,F:致病性測(cè)定中接種菌株10 d后發(fā)病的枝條,G:致病性測(cè)定中10 d后的對(duì)照枝條。

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

屬水平系統(tǒng)發(fā)育樹(shù):采用5株供試株與篩選所得的21株已知屬代表菌株(表1)的LSU序列,以Monochaetiakansensis為外群,構(gòu)建屬水平的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示,5株供試菌株都屬于Pestalotiopsis屬,且自展值為99(見(jiàn)圖2)。

圖2 供試菌株與屬級(jí)別代表菌株基于LSU序列采用ML法構(gòu)建的屬水平系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

骨架樹(shù)水平系統(tǒng)發(fā)育樹(shù):按照Maharachchikumbura等[2]的骨架樹(shù)分支以及分支相近取其一的原則挑選出30個(gè)種的代表菌株(見(jiàn)表1)。采用ITS、TUB 和 tef1等3段基因進(jìn)行聯(lián)合建樹(shù),對(duì)5株供試菌與30株代表菌進(jìn)行分析,以Neopestalotiopsisclavispora為外群。結(jié)果表明,5株供試菌單獨(dú)形成一支,并與P.oryzae分支互為姐妹群,自展值為94(見(jiàn)圖3)。

圖3 供試菌株與種級(jí)別骨架樹(shù)挑選代表菌株基于ITS、β-tubulin和tef1序列采用ML法構(gòu)建的Pestalotiopsis屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

近緣種水平系統(tǒng)發(fā)育樹(shù):根據(jù)Maharachchikumbura等[2]和Wang等[11]構(gòu)建的Pestalotiopsis屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),P.oryzae分支上的近緣種有P.rhodomurtus、P.kenyana、P.trachicarpicola、P.australasiae、P.macadamiae、P.doitungensis、P.menhaiensis和P.telopeae。采用ITS、TUB 和tef1等3段基因進(jìn)行聯(lián)合建樹(shù),將5株供試菌株與18株近緣種代表菌株進(jìn)行對(duì)比分析,以Neopestalotiopsis.saprophyta為外群。結(jié)果顯示,5株供試菌株與P.kenyana同屬一支,自展值為83,因此確認(rèn)5株供試菌株為P.kenyana(見(jiàn)圖4)。

圖4 供試菌株與所有近緣種代表菌株基于ITS、TUB、tef1序列采用ML法構(gòu)建的近緣種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

本研究通過(guò)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和三層次系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)侵染藍(lán)莓的新紀(jì)錄種進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表明該種為P.kenyana,這是其為害藍(lán)莓的首次報(bào)道。P.kenyana在我國(guó)還可引起茶樹(shù)灰斑病[13]。截至目前,為害我國(guó)藍(lán)莓的類(lèi)擬盤(pán)多毛孢病原菌上升為6個(gè)種群,分別為P.photiniae、P.trachicarpicola、P.vismiae、P.kenyana、N.chrysea和N.clavispora。其中,N.clavispora在國(guó)內(nèi)外均被報(bào)道可為害藍(lán)莓。P.guepini、P.neglecta和N.rosae等3個(gè)種群目前在國(guó)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)。

該新紀(jì)錄種(P.kenyana)與Pestalotiopsis屬為害我國(guó)藍(lán)莓的其他3個(gè)種在系統(tǒng)發(fā)育分析中容易區(qū)分;但在形態(tài)學(xué)上容易混淆,它們的分生孢子相近,只是附屬絲特征上略有不同。P.kenyana的基部附屬絲長(zhǎng)度為3.5 ～7.0 μm,而P.photiniae和P.vismiae的基部附屬絲稍短,分別為1.2～5.2 mm和2.8～5.2 mm。P.kenyana與P.trachicarpicola在頂端附屬絲數(shù)量上略有差異,前者一般具有2～3根,后者通常有3根[13,14]。

本研究對(duì)來(lái)自福建、四川和云南等省份引起藍(lán)莓枝枯病的5株類(lèi)擬盤(pán)多毛孢病原菌進(jìn)行了種的鑒定,今后還需進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)不同藍(lán)莓品種的致病性及對(duì)常規(guī)防控藥劑的抗藥性,進(jìn)而為田間防控提供參考。