地被銀樺試管苗增殖培養(yǎng)研究

李湘陽(yáng)　曾炳山　裘珍飛

摘 要 地被銀樺是雜交品種，無(wú)性繁殖對(duì)保持地被銀樺的品種特性至關(guān)重要。本研究以組織培養(yǎng)為繁殖方法，從激素的濃度、種類、大量元素及糖等方面對(duì)地被銀樺的增殖培養(yǎng)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明，6-BA的濃度對(duì)增殖苗的高度有顯著影響，6-BA和IBA對(duì)試管苗的玻璃化比例均有顯著影響，NH4NO3和KH2PO4的濃度也顯著影響增殖苗的高度。最適增殖培養(yǎng)基配方為：改良MS培養(yǎng)基（NH4NO3 412.5 mg/L ，KH2PO4 85 mg/L）+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.1 mg/L+糖35 g/L。

關(guān)鍵詞 地被銀樺 ；組織培養(yǎng) ；增殖

中圖分類號(hào) Q813.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.10.007

Abstract Grevillea Billy Bonkers is a hybrid Grevillea. Vegetative propagation plays an important role in keeping varietal characteristics of Billy Bonkers. Billy Bonkers was mass proliferated via tissue culture， and the hormones and their concentrations， macro-elements and sugar were modified to develop an optimal MS medium for tissue culture of Billy Bonkers. The results indicated that the concentrations of 6BA， NH4NO3 and KH2PO4 had significant effect on plantlet height growth of Billy Bonkers. The 6BA and IBA had significant effect on plantlet vitrification ratio. The optimal medium for tissue culture is （NH4NO3 412.5 mg/L， KH2PO4 85 mg/L） + 6BA 0.3 mg/L + IBA 0.1 mg/L + sugar 35 g/L.

Keywords Grevillea Billy Bonkers ； tissue culture ； proliferation

銀樺屬植物（Grevillea）是山龍眼科（Proteaceae）能綻放大型花序的植物，原產(chǎn)于澳大利亞、新幾內(nèi)亞、新喀里多尼亞島和印度尼西亞中部的蘇拉威西島。地被銀樺不僅花型好看、顏色艷麗、花期長(zhǎng)、具有很高的觀賞價(jià)值，而且耐旱能力強(qiáng)，應(yīng)用于庭院綠化和景觀工程的管護(hù)成本低，具有較好的市場(chǎng)前景。然而地被銀樺是一個(gè)雜交種，難以獲得正常種子，而且種子繁殖也難以保持雜交品種的優(yōu)良特性，只有通過(guò)無(wú)性繁殖方式（如組織培養(yǎng)、扦插繁殖）獲得的種苗才能保證母本植物的優(yōu)良特性。目前已有部分銀樺屬觀賞植物的組織培養(yǎng)取得成功，如白翅銀樺（G. leucopteris）[1]、綿毛銀樺（G. lanigera）[2]、莫麗銀樺（G. molly）[3]、月光銀樺（G. moonlight）[4]等，但地被銀樺的組織培養(yǎng)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組開(kāi)展了地被銀樺的組織培養(yǎng)研究，建立了一套成熟的試管苗繁殖體系，為地被銀樺的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來(lái)源于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所苗圃。

1.2 方法

1.2.1 采集外植體

選降雨量較少的6～9月取材，在天氣持續(xù)晴朗5天后，于上午9點(diǎn)～10點(diǎn)，采集新萌條的頂梢25～30 cm，剪去葉片后將其放入干凈保鮮袋中，并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行消毒處理。

1.2.2 外植體消毒

用洗衣粉溶液浸泡枝條30 min，然后在自來(lái)水下沖洗干凈；將枝條切成3～4 cm長(zhǎng)、帶1～2個(gè)葉腋的莖段，在超凈工作臺(tái)上用0.1%的HgCl2浸泡消毒3～7 min，期間不斷搖動(dòng)確保消毒液與枝條充分接觸；然后用無(wú)菌水清洗4次，每次5 min。

1.2.3 叢芽誘導(dǎo)與繼代增殖培養(yǎng)

將莖段兩端各切去0.5 cm，留下中間含葉腋的莖段作為無(wú)菌外植體，將其接種到叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；誘導(dǎo)3～5個(gè)月，形成叢芽后，將其轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖和擴(kuò)繁。

1.2.4 激素對(duì)增殖苗的影響

將地被銀樺試管苗分別接種于8種含不同濃度6-BA和IBA的培養(yǎng)基中（1）：6-BA 0.2 mg/L；（2）：6-BA 0.3 mg/L；（3）：6-BA 0.4 mg/L；（4）：6-BA 0.5 mg/L；（5）6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L；（6）6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.1 mg/L；（7）6-BA 0.4 mg/L+IBA 0.1 mg/L；（8）6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L。每種培養(yǎng)基中NH4NO3的濃度均為1/4 MS，KH2PO4的濃度均為1/2 MS，每個(gè)處理重復(fù)10瓶，每瓶接4株試管苗。

1.2.5 NH4NO3對(duì)增殖苗的影響

將地被銀樺試管苗分別接種于含不同濃度NH4NO3（0 MS、1/4 MS、1/2 MS、1 MS）的增殖培養(yǎng)基中，每個(gè)處理重復(fù)6瓶，每瓶接4株試管苗。

1.2.6 KH2PO4對(duì)增殖苗的影響

將地被銀樺試管苗分別接種于含不同濃度KH2PO4（1/4 MS、1/2 MS、3/4 MS、1 MS）的增殖培養(yǎng)基中，每個(gè)處理重復(fù)6瓶，每瓶接4株試管苗。

1.2.7 蔗糖對(duì)增殖苗的影響

將地被銀樺試管苗分別接種于含不同濃度糖（30、35、40、45 g/L）的增殖培養(yǎng)基中，每個(gè)處理重復(fù)6瓶，每瓶接4株試管苗。

以上各組實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基中均添加瓊脂粉6 g/L，培養(yǎng)基pH值為5.8，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx。所有處理均培養(yǎng)4周，之后統(tǒng)計(jì)試管苗的高度、增殖率及玻璃化苗比例。受污染影響，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)可測(cè)定的重復(fù)數(shù)不等。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SAS軟件進(jìn)行不等重復(fù)試驗(yàn)方差分析，顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素對(duì)增殖苗的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基中的6-BA濃度影響地被銀樺試管苗的增殖倍數(shù)。隨著6-BA濃度的升高，增殖倍數(shù)逐步上升（圖1），但同時(shí)試管苗的高度在迅速下降（圖2），玻璃化苗比例上升（圖3）。方差分析顯示，6-BA濃度的變化對(duì)地被銀樺增殖倍數(shù)的影響在不同處理間差異不顯著（表1），但試管苗的高度在不同處理間表現(xiàn)出極顯著差異（表2），玻璃化苗比例也表現(xiàn)出顯著差異（表3）。

IBA對(duì)增殖苗的影響是雙向的。一方面培養(yǎng)基中加入IBA后增殖倍數(shù)普遍表現(xiàn)為上升的趨勢(shì)（圖1），但差異不顯著（表1）；另一方面IBA的加入也導(dǎo)致試管苗玻璃化的比例顯著上升（圖3），且不同處理間表現(xiàn)出顯著差異（表3）。IBA對(duì)試管苗的高度有一定影響，即在加入IBA后，盡管試管苗的高度也會(huì)隨著6-BA濃度的升高而下降，但下降的幅度會(huì)減少（圖2），且不同處理間的差異不顯著（表2）。

雖然方差分析表明6-BA與IBA的聯(lián)合作用對(duì)地被銀樺試管苗的增殖倍數(shù)、高度及玻璃化比例的影響在不同處理間差異不顯著（表1～3），但實(shí)際的數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中加入少量IBA后，在培養(yǎng)基中6-BA濃度相同的情況下，增殖倍數(shù)都略有升高（圖1），IBA會(huì)減緩因6-BA濃度的升高而導(dǎo)致的試管苗高度下降（圖2），同時(shí)IBA有加劇試管苗玻璃化的傾向（圖3）。綜合考慮增殖倍數(shù)、試管苗高度及玻璃化的狀況， 認(rèn)為6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基配方比較適合地被銀樺試管苗的增殖培養(yǎng)。

2.2 NH4NO3濃度對(duì)增殖苗的影響

培養(yǎng)基中的NH4NO3濃度的變化導(dǎo)致試管苗高生長(zhǎng)量發(fā)生巨大變化（圖4）。方差分析表明，NH4NO3對(duì)地被銀樺試管苗高生長(zhǎng)有極顯著影響（表4）。當(dāng)培養(yǎng)基中NH4NO3的濃度為0時(shí)，試管苗的平均苗高生長(zhǎng)為1.64 cm；但當(dāng)NH4NO3的濃度增至825 mg/L（1/2 MS）時(shí)，試管苗高生長(zhǎng)量卻降至0.94 cm，不過(guò)加入少量的NH4NO3（412.5 mg/L）（1/4 MS）對(duì)地被銀樺試管苗高生長(zhǎng)還是有促進(jìn)作用的。

2.3 KH2PO4濃度對(duì)增殖苗的影響

培養(yǎng)基中KH2PO4的濃度對(duì)地被銀樺試管苗高生長(zhǎng)有重要影響（圖5）。當(dāng)KH2PO4濃度太低時(shí)（42.5 mg/L，即1/4 MS），試管苗普遍矮小，平均苗高生長(zhǎng)量只有0.38 cm；當(dāng)KH2PO4濃度上升至85 mg/L（1/2 MS）時(shí)，試管苗平均苗高生長(zhǎng)量隨即升高至1.96 cm，但當(dāng)繼續(xù)提高KH2PO4濃度至127.5 mg/L（3/4 MS）時(shí)，試管苗高度又開(kāi)始下降，可見(jiàn)地被銀樺試管苗對(duì)P也是比較敏感的，適合用偏低濃度的P進(jìn)行組織培養(yǎng)。方差分析顯示，KH2PO4對(duì)地被銀樺試管苗的苗高生長(zhǎng)量有極顯著影響（表5）。

2.4 蔗糖對(duì)地被銀樺試管苗的影響

適當(dāng)增加培養(yǎng)基中蔗糖的濃度，能提高地被銀樺試管苗的高度，但如果蔗糖濃度過(guò)高，試管苗的高度又會(huì)下降（圖6）。這說(shuō)明蔗糖作為地被銀樺試管苗組織培養(yǎng)中的碳源對(duì)試管苗的生長(zhǎng)起著比較重要的作用，合適的濃度能促進(jìn)試管苗的生長(zhǎng)，但濃度過(guò)高可能改變了培養(yǎng)基的滲透環(huán)境，影響了試管苗對(duì)其它物質(zhì)的吸收，從而導(dǎo)致試管苗高生長(zhǎng)量下降。方差分析表明，蔗糖對(duì)試管苗高生長(zhǎng)量的影響差異不顯著（表6）。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

一般認(rèn)為，6-BA在培養(yǎng)基中的作用是誘導(dǎo)芽的分化及促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)[5]。在一定范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的增加，試管苗的增殖倍數(shù)會(huì)升高[6-9]。地被銀樺主要是以側(cè)芽萌發(fā)的方式進(jìn)行繁殖，提高6-BA的濃度能促進(jìn)試管苗的增殖，但卻導(dǎo)致試管苗的高度下降，在高粱泡組培研究中也發(fā)現(xiàn)類似的情況[6]。IBA是生長(zhǎng)素類激素，通常認(rèn)為其在組織培養(yǎng)中能促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[5]，往培養(yǎng)基中加入IBA后，在6-BA濃度相同的情況下，地被銀樺試管苗的高度有所增加。在對(duì)山新楊[7]、變?nèi)~金銀木[10]進(jìn)行組織培養(yǎng)研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的生長(zhǎng)素類激素能提高芽苗的高度。

Mujib等[11]認(rèn)為，BA是組培試管苗玻璃化的根源。徐涌等[12]在研究吳茱萸組織培養(yǎng)時(shí)證明，適當(dāng)質(zhì)量濃度的6-BA能提高增殖率，但質(zhì)量濃度過(guò)高則容易導(dǎo)致玻璃化。本研究結(jié)果也表明，6-BA是影響試管苗玻璃化率的重要因子，同時(shí)IBA也對(duì)地被銀樺試管苗的玻璃化有顯著影響，這說(shuō)明無(wú)論是細(xì)胞分裂素還是生長(zhǎng)素類激素都對(duì)試管苗的玻璃化有顯著影響。莫麗銀樺[3]、月光銀樺[4]的組織培養(yǎng)研究結(jié)果也證明，6-BA、NAA、IBA濃度的上升容易導(dǎo)致組培苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在其它植物如鐵線蓮[13]、洋桔梗[14]的組培研究中也表明，當(dāng)6-BA相同濃度時(shí)，提高生長(zhǎng)素類激素濃度會(huì)增加試管苗玻璃化比例。

MS培養(yǎng)基是目前應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基，大多數(shù)植物都能在MS培養(yǎng)基上較好地生長(zhǎng)，但是銨對(duì)不少培養(yǎng)物有抑制生長(zhǎng)的作用[15]。劉正娥等[16]在研究孝順竹的組培快繁時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NH4NO3在0～2 475 mg/L時(shí)，苗高隨著濃度的升高有所下降；當(dāng)KH2PO4在85～255 mg/L時(shí)，苗高隨濃度的升高而增加，其中濃度為255 mg/L時(shí)苗高最高，之后隨其濃度的升高而下降。MS培養(yǎng)基中蔗糖的標(biāo)準(zhǔn)濃度是3%[15]，然而不同的植物對(duì)碳源的需求并不一樣。李林等[17]研究了蔗糖濃度為10～50 g/L時(shí)對(duì)美國(guó)黃松不定芽增殖和生長(zhǎng)的影響，證明不定芽的增殖率在蔗糖濃度為20 g/L時(shí)最大，之后隨著蔗糖濃度的增加而下降。周遜等[18]在研究遵義大白姜的組織培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蔗糖濃度為0～100 g/L時(shí)，隨著蔗糖濃度的升高，大白姜的生長(zhǎng)量直線上升，但繼續(xù)升高蔗糖濃度后，試管苗的生長(zhǎng)開(kāi)始受到抑制。因此，采用MS培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)有必要根據(jù)試管苗的狀況進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。本研究結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基中不同濃度的NH4NO3和KH2PO4對(duì)地被銀樺試管苗生長(zhǎng)的影響均達(dá)到極顯著差異水平，較高濃度的NH4NO3和KH2PO4均會(huì)抑制地被銀樺試管苗高生長(zhǎng)，而將培養(yǎng)基中糖的濃度提高到3.5%時(shí)，試管苗的生長(zhǎng)量會(huì)上升。所以，在對(duì)地被銀樺進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)采用較低濃度的NH4NO3和KH2PO4，并適當(dāng)提高糖的濃度。

3.2 結(jié)論

地被銀樺在進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)容易出現(xiàn)試管苗玻璃化現(xiàn)象，而激素濃度對(duì)試管苗的玻璃化有顯著影響，因此只能采用較低濃度的激素組合。另外，地被銀樺試管苗的生長(zhǎng)量受到激素濃度、NH4NO3和 KH2PO4含量以及蔗糖濃度的影響，必須對(duì)常規(guī)MS培養(yǎng)基進(jìn)行改良才能保證試管苗的正常生長(zhǎng)。最適增殖培養(yǎng)基為：改良MS培養(yǎng)基（NH4NO3 412.5 mg/L，KH2PO4 85 mg/L）+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.1 mg/L+糖35 g/L。

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