二硫氰基甲烷對斑腿泛樹蛙蝌蚪抗氧化系統(tǒng)及丙二醛含量的影響

戴金妹， 張玲玲， 耿寶榮

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350117)

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DOI:10.11984/j.issn.1000-7083.20150408

二硫氰基甲烷對斑腿泛樹蛙蝌蚪抗氧化系統(tǒng)及丙二醛含量的影響

戴金妹， 張玲玲， 耿寶榮*

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350117)

采用半靜態(tài)染毒法研究了二硫氰基甲烷(MBT)對斑腿泛樹蛙Polypedatesmegacephalus蝌蚪的急性毒性。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了不同濃度(0.6 μg·L-1、1.2 μg·L-1、1.8 μg·L-1、2.4 μg·L-1和3.0 μg·L-1)的MBT對蝌蚪的總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)活力及丙二醛(MDA)含量的影響。結(jié)果表明，MBT對斑腿泛樹蛙蝌蚪的48 h和96 h的半致死濃度(LC50)分別為8.024 μg·L-1和6.095 μg·L-1。蝌蚪的T-AOC和GSH-Px活力在短時間和低濃度下被誘導(dǎo)后，隨著MBT濃度的增加逐漸被抑制而降低；在3.0 μg·L-1(96 h)和2.4 μg·L-1(48 h和96 h)的MBT溶液中，蝌蚪的T-AOC及GSH-Px活力顯著被抑制。MDA含量在1.2 μg·L-1的MBT溶液明顯降低后，出現(xiàn)增高的趨勢并保持高值狀態(tài)。研究表明蝌蚪抗氧化酶活性的變化間接反映了環(huán)境中氧化脅迫的存在，MBT對斑腿泛樹蛙蝌蚪會造成一定的毒性影響。

二硫氰基甲烷；斑腿泛樹蛙蝌蚪；T-AOC；GSH-Px；MDA

二硫氰基甲烷[SCN-(CH2)2-SCN，methylene dithiocyanate，MBT]是一種具有強烈殺菌、降低線蟲活性的有機硫氰化合物(祁之秋等，2007)，對 20 多種植物病原真菌、細(xì)菌和線蟲均具有很高的生物學(xué)活性，可用于防治水稻惡苗病和干尖線蟲病、大麥條紋病、網(wǎng)斑病、堅黑穗病等，同時也適用于其他病害的防治，還能夠降低病原菌對苯并咪唑類藥劑的抗藥性(陳長軍等，2003；馬承鑄等，2011)。作為一種高效、廣譜、安全的殺菌劑，MBT在作物病蟲害防治方面得到了廣泛的應(yīng)用，但對農(nóng)田生態(tài)環(huán)境和水生生物的影響則少有研究(王李寶等，2008)。

兩棲動物生活于水陸環(huán)境，是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在控制害蟲和發(fā)展無公害農(nóng)業(yè)中起到重要的作用(薛清清等，2005)。然而，近年來全球性的兩棲類種群下降已引起人們的高度關(guān)注(Stuartetal., 2004; Xieetal., 2007)。研究表明，環(huán)境污染對兩棲動物的生存與繁殖造成了巨大威脅(Sharpe & Skakkebaek, 1993; Gengetal., 2005)，有關(guān)環(huán)境污染物對兩棲動物的影響已成為當(dāng)前生態(tài)毒理學(xué)研究的熱點(Blausteinetal., 2003; 李貞等, 2010)。實際上，兩棲動物具有特殊的生活周期和生理特征，與其他脊椎動物相比，其對環(huán)境變化更為敏感，在作為靈敏的生物學(xué)標(biāo)志物或早期預(yù)警系統(tǒng)檢測環(huán)境毒物方面具有重要的意義(徐士霞等，2003；周景明等，2006)。本試驗以斑腿泛樹蛙Polypedatesmegacephalus蝌蚪為實驗材料，在急性毒性研究基礎(chǔ)上，開展MBT對其總抗氧化能力(total antioxidative capacity，T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活力以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyd，MDA)含量等影響的生理毒性研究，探討MBT的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)，旨在探明MBT對兩棲動物抗氧化性的損傷程度，為農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)保護和保護兩棲動物水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考，也為MBT的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DT11A型電子天平由江蘇常熟長青儀器儀表廠生產(chǎn)，CR2II型高速冷凍離心機由日本日立有限公司生產(chǎn)，臺式離心機、752型紫外可見分光光度計由上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，HH4數(shù)顯恒溫水浴鍋為國華電器有限公司生產(chǎn)。

MBT(有效成分98%)由成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，試驗前先用二甲基亞砜(DMSO)作為助溶劑，將其配成質(zhì)量濃度為1 g·L-1的母液，正式試驗時再稀釋為試驗所需要的濃度。考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒、T-AOC試劑盒、GSH-Px試劑盒和MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗動物

將采自福建師范大學(xué)倉山校區(qū)生態(tài)池塘的斑腿泛樹蛙卵泡帶回，置于實驗室的水族箱內(nèi)，用充分曝氣48 h以上的自來水進(jìn)行孵化和培養(yǎng)，定期換水；開食后的蝌蚪用蛋黃和粉狀鰻魚飼料喂養(yǎng)。選擇處于28～30期(Gosner, 1960)、體質(zhì)健康、活動正常、大小一致(體長22.06 mm±2.25 mm，體質(zhì)量0.18 g±0.03 g)的蝌蚪進(jìn)行實驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 急性毒性 在實驗室條件下(水溫15 ℃～17 ℃)采用靜態(tài)換水法進(jìn)行急性毒性試驗(周永欣，章宗涉，1989)。在預(yù)試驗所得到的最大無致死濃度(LC0)和最小全致死濃度(LC100)范圍內(nèi)，按0.9等對數(shù)間距，設(shè)置5個MBT濃度處理組(4.0 μg·L-1、4.9 μg·L-1、6.0 μg·L-1、7.4 μg·L-1和9.1 μg·L-1)，另設(shè)1個DMSO對照組(3.0 μg·L-1)和1個空白對照組，試驗設(shè)置3個平行組。每組隨機放置8尾蝌蚪，染毒持續(xù)96 h；試驗期間不喂食，每24 h更換1次試液，記錄蝌蚪死亡數(shù)并清除死亡個體。

1.3.2 生理毒性

染毒：根據(jù)急性毒性試驗的結(jié)果，以96 h半致死濃度(96 h-LC50)的50 %值為最高濃度，設(shè)置5個MBT濃度處理組(0.6 μg·L-1、1.2 μg·L-1、1.8 μg·L-1、2.4 μg·L-1和3.0 μg·L-1)、1個DMSO對照組(3.0 μg·L-1)和1個空白對照組。每組放置20尾蝌蚪，染毒期間不喂食，每24 h更換一次試液。

樣品制備：分別于暴露后48 h和96 h，從各處理組及對照組中隨機取出6尾蝌蚪，沖洗后用濾紙吸干體表的水，按質(zhì)量體積比(1∶9)加入生理鹽水，在冰浴條件下迅速將蝌蚪研磨，制成10%的勻漿液，在2 500 r下離心10 min，取上清液測定。

測定方法：采用考馬斯亮蘭法測定蝌蚪體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量，T-AOC、GSH-Px活力及MDA含量的測定嚴(yán)格按照試劑盒中的說明書步驟進(jìn)行操作。T-AOC單位定義為：在37 ℃時，每分鐘每毫克蛋白質(zhì)使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加0.01時為1個總抗氧化能力單位；GSH-Px活力單位定義為：每毫克蛋白質(zhì)每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol·L-1為1個酶活力單位；MDA含量以nmol·mg-1表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

急性毒性試驗中，利用Excel計算LC50。將MBT濃度轉(zhuǎn)化為濃度對數(shù)，與蝌蚪累積死亡百分率進(jìn)行回歸分析，得到毒性回歸方程，當(dāng)死亡率為50%時，通過回歸方程計算出48 h-LC50和96 h-LC50，安全濃度(SC)采用公式SC=0.1×96 h-LC50(Ezemonye & Tongo, 2009)。在生理毒性試驗中，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；在同一暴露時間內(nèi)，各處理組間及各處理組與對照組間的比較用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行LSD多重比較分析，顯著性水平設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性

在急性毒性試驗的96 h內(nèi)，DMSO對照組和空白對照組的蝌蚪未出現(xiàn)死亡，且活動正常、游動活躍、反應(yīng)靈敏，表明低劑量的助溶劑DMSO對蝌蚪無影響。各處理組中的蝌蚪則出現(xiàn)一定的中毒癥狀，主要表現(xiàn)為：蝌蚪游動的頻率和能力下降，出現(xiàn)呆滯、行動緩慢的癥狀，軀體呈現(xiàn)不同程度的僵硬狀態(tài)，尾部出現(xiàn)不同程度的彎曲；隨著處理時間的延長，蝌蚪出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；蝌蚪死亡時，身體發(fā)黑腐爛。

96h的急性毒性試驗表明，MBT濃度對數(shù)和蝌蚪累積死亡百分率呈顯著線性關(guān)系(圖1)。經(jīng)計算得知，MBT對斑腿泛樹蛙蝌蚪48 h和96 h 的LC50分別為8.024 μg·L-1和6.095 μg·L-1，安全濃度為0.610 μg·L-1。

圖1 暴露于不同濃度的二硫氰基甲烷溶液48 h和96 h的斑腿泛樹蛙蝌蚪累積死亡百分率與二硫氰基甲烷濃度對數(shù)關(guān)系曲線

2.2 生理毒性

經(jīng)MBT處理48 h和96 h后，蝌蚪的T-AOC、GSH-Px活力變化及MDA含量變化見圖2。由于DMSO對照組和空白對照組的所有數(shù)據(jù)均無統(tǒng)計學(xué)差異，故合并為單一的對照組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.2.1 MBT對斑腿泛樹蛙蝌蚪T-AOC的影響 由圖2可以看出，在MBT溶液中暴露48 h后，0.6 μg·L-1濃度處理組蝌蚪的T-AOC和對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而中、高濃度處理組的T-AOC則被誘導(dǎo)而呈上升趨勢，峰值出現(xiàn)在2.4 μg·L-1濃度處理組；而最高濃度處理組(3.0 μg·L-1)的T-AOC則受到顯著抑制而下降。

暴露96 h后，0.6 μg·L-1濃度處理組仍與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，說明該濃度不會影響蝌蚪的T-AOC；中、高濃度處理組的T-AOC被誘導(dǎo)呈緩慢上升之勢，峰值仍出現(xiàn)在2.4 μg·L-1濃度處理組，而最高濃度處理組的T-AOC則下降至極顯著低于對照組的水平(P<0.01)，表明T-AOC受到較大抑制。

2.2.2 MBT對斑腿泛樹蛙蝌蚪GSH-Px活力的影響 斑腿泛樹蛙蝌蚪在MBT溶液中暴露48 h和96 h后，其GSH-Px活力變化趨勢大致與T-AOC的相同(圖2)。在最低濃度處理組(0.6 μg·L-1)，蝌蚪的GSH-Px活力受毒物的脅迫先顯著下降(P<0.05)；從1.2 μg·L-1濃度處理組開始，其活力出現(xiàn)“毒物興奮效應(yīng)”而顯著升高，染毒48 h后的GSH-Px活力峰值出現(xiàn)在1.8 μg·L-1濃度處理組，而96 h后則出現(xiàn)在1.2 μg·L-1濃度處理組。表明在較高的濃度中，只需相對較短的時間即可被誘導(dǎo)而引起“毒物興奮效應(yīng)”，高濃度處理組(2.4 μg·L-1和3.0 μg·L-1)的GSH-Px活力則比中濃度處理組的顯著下降，說明其活力受到了一定程度的抑制。

2.2.3 MBT對斑腿泛樹蛙蝌蚪MDA含量的影響

由圖2可以看出，斑腿泛樹蛙蝌蚪在MBT溶液中暴露48 h后，在0.6 μg·L-1濃度處理組中，MDA含量顯著上升(P<0.01)，而在1.2 μg·L-1濃度處理組中則開始下降，1.8 μg·L-1濃度處理組中又出現(xiàn)極顯著提高，并保持高值狀態(tài)。暴露96 h后，0.6 μg·L-1濃度處理組的MDA含量與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，在1.2 μg·L-1處理組也出現(xiàn)顯著的下降；與處理48 h情況一致，在1.8 μg·L-1濃度處理組中顯著上升(P<0.01)后趨于穩(wěn)定，保持高值狀態(tài)。

3 討論

急性毒性是大劑量的環(huán)境污染物一次性或短時間內(nèi)多次對生物的毒性作用(周啟星等，2004)，由于該試驗操作簡便、耗時短，并能夠反映污染物的相對毒性強度以及劑量效應(yīng)關(guān)系，故被廣泛應(yīng)用，是最常用的一種毒性試驗方法(黃修平等，2013)。有關(guān)環(huán)境污染物對水生動物毒性的評價，目前一般以測得的LC50值作為評價依據(jù)，根據(jù)48 h LC50值的大小，將農(nóng)藥對水生生物的毒性劃分為3個等級(張克杰，張維平，1991)。本試驗的研究結(jié)果表明，MBT對斑腿泛樹蛙蝌蚪的毒性屬于中等毒性。

T-AOC是一項衡量機體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)，反映了機體清除自由基的能力(李安娜等，2008)。有研究表明，受到環(huán)境化學(xué)污染物及環(huán)境應(yīng)激因子脅迫的動植物機體組織能夠產(chǎn)生大量自由基，使抗氧化酶活性發(fā)生相應(yīng)的改變。由于抗氧化酶對低濃度的環(huán)境化學(xué)污染物非常敏感，很多環(huán)境毒理實驗均將其作為研究、檢測及評價污染物引起的機體生化效應(yīng)的一種重要生物標(biāo)志物(Almeidaetal., 2002；王重剛等，2002)。本研究結(jié)果表明，在低濃度(0.6 μg·L-1)的MBT溶液中，無論是48 h還是96 h，斑腿泛樹蛙蝌蚪的T-AOC均不受影響；但隨著MBT濃度的上升，刺激了蝌蚪體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，出現(xiàn)了T-AOC增高呈興奮效應(yīng)，但高濃度長時間的暴露則會嚴(yán)重抑制機體的T-AOC，從而產(chǎn)生一定的毒性效應(yīng)。

GSH-Px是機體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一，能特異催化對H2O2的還原反應(yīng)，有效清除新陳代謝產(chǎn)生的活性氧(ROS)，保護脂膜和其他細(xì)胞組分的結(jié)構(gòu)及功能，維持組織內(nèi)的氧代謝平衡(Kosower & Kosower, 1978; 譚樹華等，2012)。許多研究表明，酶活力在低濃度污染物脅迫時先下降后因“毒物興奮效應(yīng)”而升高，隨著污染物濃度不斷提高或暴露時間的延長，則形成了毒害而再次下降(王重剛等，2002；朱友芳，洪萬樹，2011)。本實驗結(jié)果表明，蝌蚪的GSH-Px活力在低濃度(0.6 μg·L-1)的MBT脅迫時顯著下降，隨著毒物濃度的上升而逐漸被誘導(dǎo)，出現(xiàn)激活狀態(tài)，但隨著毒物濃度的繼續(xù)上升，其活性則被抑制。T-AOC和GSH-Px活力在暴露情況下的誘導(dǎo)與抑制在毒物濃度上沒有同步性，T-AOC峰值出現(xiàn)在2.4 μg·L-1濃度處理組，而GSH-P峰值則出現(xiàn)在1.8 μg·L-1濃度處理組(48 h)和1.2 μg·L-1濃度處理組(96 h)。由此說明環(huán)境污染物對蝌蚪抗氧化酶活性的影響模式比較復(fù)雜，還需要進(jìn)一步的深入研究(Stephensenetal., 2000; 王重剛等，2002)。

MDA是體內(nèi)氧自由基引發(fā)的生物膜不飽和脂肪酸過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，是目前反映機體氧化損傷最具代表性的指標(biāo)之一，其在機體中的濃度水平反映了脂質(zhì)過氧化的程度，即機體細(xì)胞受自由基攻擊的程度(賈秀英，施蔡雷，2008)，可作為環(huán)境污染評價的有力指標(biāo)(鐘碧瑾等，2009)。研究表明，在有毒性作用的外界化學(xué)物質(zhì)影響下，生物機體內(nèi)的MDA含量會上升(Catalgoletal., 2007)。本研究結(jié)果表明，在較低濃度(0.6 μg·L-1和1.2 μg·L-1)的MBT下染毒48 h，或最低濃度(0.6 μg·L-1)MBT下染毒96 h，蝌蚪機體尚未對MBT的脅迫做出及時反應(yīng)，不能及時清除氧自由基，MDA含量上升。隨后機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)被激活，清除部分氧自由基，MDA含量顯著下降；但隨著藥物濃度的增高和染毒時間延長，機體抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，MDA含量再次上升，并保持高值狀態(tài)。這與T-AOC和GSH-Px活力的變化是相符合的。

總之，農(nóng)藥的使用在對防治農(nóng)業(yè)病蟲害發(fā)揮作用的同時，也對兩棲動物和其他水生動物產(chǎn)生了較大的負(fù)面影響。因此，科學(xué)規(guī)范地使用農(nóng)藥，對有效地控制水環(huán)境污染，保障生態(tài)安全，以及保護兩棲動物正常的生長與繁殖，具有重要的意義。

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Effects of Methylene Dithiocyanate on Antioxidant System Activity and Malondialdehyd Content inPolypedatesmegacephalusTadpoles

DAI Jinmei, ZHANG Lingling, GENG Baorong*

(College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China)

Acute toxicity of methylene dithiocyanate (MBT) onPolypedatesmegacephalustadpoles was studied by using the semi-static exposure method. Based on the study, effects of different concentrations of MBT (0.6 μg·L-1, 1.2 μg·L-1, 1.8 μg·L-1, 2.4 μg·L-1and 3.0 μg·L-1) on total antioxidative capacity (T-AOC), glutathione peroxidase (GSH-Px) activity and malondialdehyd (MDA) content of the tadpoles were investigated. The results showed that the LC50values of MBT for the tadpoles at 48 h and 96 h were 8.024 μg·L-1and 6.095 μg·L-1, respectively. After activated in short time and lower MBT concentration, T-AOC and GSH-Px activity of tadpoles gradually decreased with the increasing MBT concentration, and were significantly inhibited at the concentration of 3.0 μg·L-1(96 h) and 2.4 μg·L-1(48 h, 96 h), respectively. The MDA content was first significantly reduced in 1.2 μg·L-1MBT concentration, and then showed increasing trend and kept at high values. This study may indicate that the changes of antioxidant enzymes system activities indirectly reflected the existence of oxidation stress, and MBT can cause moderate toxic effects onPolypedatesmegacephalustadpoles.

methylene dithiocyanate；Polypedatesmegacephalustadpoles； T-AOC； GSH-Px； MDA

2015-12-22 接受日期：2016-01-15 基金項目:福建省自然科學(xué)基金資助項目(2015J01124)； 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2013級生物科學(xué)拔尖人才班科研訓(xùn)練項目(生物學(xué)拔尖201306)

戴金妹(1995—)， 本科生， 主要參與兩棲動物生態(tài)毒理學(xué)的研究

*通信作者Corresponding author， E-mail:brgeng@fjnu.edu.cn

Q959.5

A

1000-7083(2016)02-0283-05