一種新的生物組織質(zhì)譜成像方法及儀器集成

胡勇軍, 陳家新, 陸 橋

(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，廣州 510006)

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一種新的生物組織質(zhì)譜成像方法及儀器集成

胡勇軍*, 陳家新, 陸 橋

(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，廣州 510006)

介紹了一種免標(biāo)記質(zhì)譜分子成像新技術(shù)，即紅外激光解析/真空紫外激光后電離質(zhì)譜成像方法. 該方法具有樣品前處理簡(jiǎn)單，無(wú)需人為添加基質(zhì)等優(yōu)點(diǎn). 同時(shí)，這種成像方法還可以通過(guò)在時(shí)間和空間上獨(dú)立優(yōu)化2束激光的波長(zhǎng)、強(qiáng)度以及延遲時(shí)間來(lái)獲得最佳的質(zhì)譜成像探測(cè)條件. 首次應(yīng)用該實(shí)驗(yàn)技術(shù)成功地探測(cè)抗癌藥物吖啶黃素在小鼠腎臟組織切片中的空間分布，其空間分辨率低于100 μm，單一成像點(diǎn)檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1 pmol. 這種新型的質(zhì)譜成像技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)和藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景.

吖啶黃素； 激光解析電離； 組織成像； 臨床診斷

質(zhì)譜成像是一種新型的原位成像技術(shù)，近年來(lái)，此技術(shù)因其能提供高度精確的分子分布信息而在諸多領(lǐng)域受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注. 質(zhì)譜成像具有高靈敏度、高效率以及能夠在復(fù)雜的生物體系中同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)和鑒別多種分子等優(yōu)點(diǎn)，不管是從細(xì)胞，還是組織，再到整個(gè)活體動(dòng)物成像，質(zhì)譜成像技術(shù)都可以很好地呈現(xiàn)出被觀(guān)察對(duì)象的空間分布情況[1-2]. 這種原位分析技術(shù)的原理是利用激光或者離子束使切片表面的分子離子化，然后通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定這種離子化分子的質(zhì)荷比(m/z)，再由軟件重構(gòu)出分析物在組織中分布的圖譜[3]. 常見(jiàn)的質(zhì)譜成像技術(shù)有matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) 成像，電噴霧電離成像等質(zhì)譜成像技術(shù)，但是，這些質(zhì)譜成像技術(shù)有著自身的局限性，對(duì)于MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)來(lái)說(shuō)，研究生物大分子有很好的效果，但是對(duì)于生物小分子來(lái)說(shuō)，就顯得不是非常方便，尤其是在特定的生物組織這個(gè)體系中，這種研究更加的困難. 此外，這種成像技術(shù)需要一種合適的基質(zhì)，這些基質(zhì)在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中也會(huì)對(duì)質(zhì)譜信號(hào)產(chǎn)生一定的影響. 對(duì)于電噴霧電離質(zhì)譜成像技術(shù)來(lái)說(shuō)，每一個(gè)電噴霧的變量(如真空度、電勢(shì)、溶劑的揮發(fā)性、溶液的導(dǎo)電性及電解質(zhì)的濃度)都有可能對(duì)成像的結(jié)果產(chǎn)生很大的影響,此外，即使在良好的條件下，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也存在離子信號(hào)的波動(dòng)[4-5]. 基于這個(gè)前提，本文介紹了一種由本研究組提出的質(zhì)譜分子成像新技術(shù)，即紅外激光解析/真空紫外激光后電離質(zhì)譜成像方法. 與其他傳統(tǒng)的質(zhì)譜成像方法相比，該成像方法具有樣品前處理簡(jiǎn)單、無(wú)需人為添加基質(zhì)等優(yōu)點(diǎn). 這在某種程度上可以提高實(shí)驗(yàn)的效率以及準(zhǔn)確性，同時(shí)，這種成像方法還可以在時(shí)間和空間上獨(dú)立優(yōu)化兩束激光的波長(zhǎng)、強(qiáng)度以及延遲時(shí)間來(lái)獲得最佳的質(zhì)譜成像探測(cè)條件.

本文系統(tǒng)介紹了紅外激光解析/真空紫外光電離的實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)譜成像的儀器集成、實(shí)驗(yàn)室儀器成像的可行性驗(yàn)證、小鼠腎臟組織切片的制備以及組織成像，并對(duì)今后該質(zhì)譜成像技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)以及藥物研發(fā)領(lǐng)域的發(fā)展進(jìn)行了展望.

1 實(shí)驗(yàn)原理及儀器

紅外激光解析/真空紫外光電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的原理如圖1所示，在紅外激光解析/真空紫外激光系統(tǒng)中，解析激光和電離激光在時(shí)間和空間上相互獨(dú)立，第一束激光一般采用光子能量較小的紅外激光[6-7]，當(dāng)解析激光照射到承載有樣品的基體上時(shí)，被吸收的光在瞬間大部分轉(zhuǎn)換成熱能，并傳遞給待測(cè)樣品，使其瞬間氣化/解析[8]. 研究表明，短脈沖激光可以在10 ns時(shí)間內(nèi)上升到108K的高溫[9]，如此快的升溫速度，可以避免分子因均勻受熱而發(fā)生裂解，在解析光的照射下，在離靶體表面很近的范圍內(nèi)會(huì)形成一個(gè)體積約為1 mm3的氣團(tuán)，包含在該氣團(tuán)中的大部分為中性離子，其中中性離子所占的比例大約是帶電離子的1 000倍以上[10]. 經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的延遲后，第二束電離激光被聚焦并引入到該氣團(tuán)，優(yōu)化兩者之間的延遲時(shí)間，這樣可以極大地提高電離效率，有助于質(zhì)譜信號(hào)的形成，被電離的離子隨后被引入質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測(cè)，第二束激光一般采用真空紫外光，光子的能量大概在10.48 eV，這是一種軟電離技術(shù)，可以有效避免碎片的大量產(chǎn)生[11-12].

圖1 激光解析后電離原理示意圖

Figure 1 The schematic diagram of the principle of laser desorption photoionization

實(shí)驗(yàn)室自主搭建用來(lái)進(jìn)行生物組織質(zhì)譜成像的儀器示意圖分別如圖2、圖3所示，該儀器主要由1個(gè)含有多個(gè)接口的高真空腔、2臺(tái)固體激光器、1個(gè)電控三維進(jìn)樣平臺(tái)、1個(gè)氣體池、1個(gè)電腦操控程序以及1個(gè)線(xiàn)性的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀組成[13].

圖2 激光解析后電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀示意圖

Figure 2 The schematic diagram of laser desorption postionization mass spectrometry (LDPI-MS)

圖3 實(shí)驗(yàn)室成像儀器原理示意圖

2臺(tái)固體激光器(圖2)中一臺(tái)是YAG固體激光器泵浦產(chǎn)生的118 nm 真空紫外激光光源. YAG激光器的工作原理是活性的介質(zhì)3價(jià)銣離子受到Xe燈輻射的激發(fā),產(chǎn)生基頻為1 064 nm的激光，該基頻激光經(jīng)過(guò)3倍頻得到355 nm的激光，經(jīng)聚焦射入成分比例為1∶10的Xe/Ar氣體池, 產(chǎn)生的118 nm真空紫外光作為電離激光光源. 另外一臺(tái)是國(guó)產(chǎn)的光泵浦固體激光器，可輸出1 064 nm的激光作為解析激光. 這2臺(tái)激光器的工作頻率為10 Hz,通過(guò)一臺(tái)DG535時(shí)間延遲器控制其與記錄設(shè)備同步和采集.

三維進(jìn)樣平臺(tái)如圖2所示，是一個(gè)與質(zhì)譜真空系統(tǒng)兼容的三維傳動(dòng)桿實(shí)驗(yàn)裝置，三維平臺(tái)的末端固定一個(gè)樣品承載平臺(tái)，接口處有一個(gè)手動(dòng)的閘板閥將其與外界隔絕開(kāi)來(lái)，在初級(jí)的真空接口上通過(guò)2個(gè)O型的橡膠圈密封，當(dāng)進(jìn)樣桿裝置緩緩插入真空系統(tǒng)中時(shí)，橡膠圈便通過(guò)密封進(jìn)樣桿將電離室與大氣隔絕. 通過(guò)一個(gè)前級(jí)機(jī)械泵對(duì)其進(jìn)行前期的抽取，抽取15 min后關(guān)閉前級(jí)機(jī)械泵. 打開(kāi)手動(dòng)的閘板閥,將涂布有樣品的承載平臺(tái)送入真空腔中的電離區(qū)[13]. 進(jìn)樣桿在三維平臺(tái)的帶動(dòng)下運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而可以檢測(cè)到藥物分子在不同空間位置的信號(hào)強(qiáng)度，最后在成像軟件的處理下，獲得藥物分子成像圖. 圖4是實(shí)驗(yàn)室三維平臺(tái)進(jìn)樣系統(tǒng)示意圖.

圖4 三維平臺(tái)進(jìn)樣系統(tǒng)示意圖

2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.1 實(shí)驗(yàn)樣品

本實(shí)驗(yàn)選擇吖啶類(lèi)藥物中的吖啶黃素作為實(shí)驗(yàn)的測(cè)試樣品，吖啶黃素作為一種吖啶類(lèi)有機(jī)藥物，早期作為處理含有性因子F的大腸桿菌和用于誘變酵母菌產(chǎn)生小菌落的藥物，作用十分有限. 近年來(lái)，吖啶黃素其他用途也逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，研究表明，吖啶黃素對(duì)于某些特殊的腫瘤具有抑制作用，這使人們對(duì)吖啶黃素的抗癌研究更加深入[14-15]，本實(shí)驗(yàn)采用一種新型的生物組織質(zhì)譜成像法，對(duì)該抗腫瘤藥物進(jìn)行檢測(cè)和研究.

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器成像能力的測(cè)試實(shí)驗(yàn)

在進(jìn)行動(dòng)物組織成像實(shí)驗(yàn)之前，先對(duì)這套實(shí)驗(yàn)儀器成像的可行性進(jìn)行初步的測(cè)試實(shí)驗(yàn). 用亞甲基藍(lán)(m/z為320)染料在承載基底(剛玉棒)上描繪出英文字母“SCNU”,即華南師范大學(xué)英文名字的首字母縮寫(xiě)(South China Normal University). 然后送入質(zhì)譜成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像(圖5). 下圖為實(shí)物圖,上圖為質(zhì)譜成像圖. 結(jié)果表明：應(yīng)用所搭建的質(zhì)譜成像系統(tǒng)完全可以開(kāi)展分子成像相關(guān)的實(shí)驗(yàn).

圖5 “SCNU”的質(zhì)譜成像圖以及實(shí)物圖

Figure 5 The LDPI-MS image of “SCNU” and the corresponding digital photo

2.3 組織切片制備及組織成像

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行小鼠腎臟的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)中，首先需要制作動(dòng)物的腎臟組織切片，組織切片的制作過(guò)程如下：從廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)中心購(gòu)買(mǎi)3只Balb/c 雄性小鼠，6～7周齡，質(zhì)量約為20 g，通過(guò)斷頸法將3只小鼠致死，1 h后，取出小鼠腎臟，放在-80 ℃的冰箱中保存冷凍，約30 min后，取出腎臟組織，放在徠卡冷凍切片機(jī)上切片，切片的厚度控制在250 μm左右，將切片轉(zhuǎn)移到樣品桿上，接著向組織切片上均勻滴加10 μL 1 mg/L的吖啶黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，待組織風(fēng)干后在質(zhì)譜儀中檢測(cè). 探測(cè)獲得的成像如圖6所示.

圖6 組織成像圖

3 結(jié)論

通過(guò)將探測(cè)獲得的質(zhì)譜圖與實(shí)物圖進(jìn)行對(duì)比，所提出的分子成像技術(shù)很好地呈現(xiàn)了抗腫瘤藥物吖啶黃素在組織當(dāng)中的空間分布，分辨率可達(dá)100 μm，且單一成像點(diǎn)檢測(cè)極限低于0.1 pmol. 與傳統(tǒng)的質(zhì)譜成像方法(如基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜成像、電噴霧解析電離質(zhì)譜成像等)相比，本文的紅外激光解析/真空紫外激光后電離質(zhì)譜成像法具有樣品前處理簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、無(wú)基質(zhì)干擾、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn). 此外，該方法還可以從時(shí)間和空間上進(jìn)行單獨(dú)優(yōu)化，這是其他的方法無(wú)法做到的. 在未來(lái)幾年，隨著質(zhì)譜成像技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，這種新型的生物組織質(zhì)譜成像方法將在臨床醫(yī)學(xué)上具有很大的應(yīng)用前景，尤其是在腎臟疾病診斷和藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有不可忽視的作用.

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【中文責(zé)編：成文 英文責(zé)編：肖菁】

A New Mass Spectrometry Imaging Technique for Biological Tissue and Instruments Integration

HU Yongjun*, CHEN Jiaxin, LU Qiao

(College of Biophotonics, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

A new mass imaging technique for biological tissues using laser desorption postionization mass spectrometry is proposed. This technique does not require multiple sample preparation and avoids the spectra interferences. Moreover, this imaging method can be used to optimize wavelength independently of two laser beams in time and space. It also can adjust the delay time between the desorption laser and the ionization laser. The first application of this experimental technique was applied successfully to detect the spatial distribution of anticancer drug, c14h15n3cl2, in mouse kidney tissues. This helps us get the best mass spectra and images with a resolution of 100 μm and a limit of 0.1 pmol. All the results show that this new imaging technique is promising in the areas of clinical medicine and medicinal development in the future.

acriflavine; laser desorption ionization; tissue imaging; clinical diagnosis

2016-05-27 《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21273083, U1332132)

O43

A

1000-5463(2016)06-0063-04

*通訊作者:胡勇軍，教授，Email: yjhu@scnu.edu.cn.