內(nèi)源抗壞血酸對(duì)水稻葉片抗氧化脅迫的影響

張啟雷， 高 輝， 彭長(zhǎng)連

(廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631)

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內(nèi)源抗壞血酸對(duì)水稻葉片抗氧化脅迫的影響

張啟雷， 高 輝， 彭長(zhǎng)連*

(廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631)

以野生型水稻(Oryzasativa)品種‘中花11’(WT)、抗壞血酸合成關(guān)鍵酶GLDH基因的上調(diào)(超表達(dá))株系GO-2及下調(diào)(干涉)株系GI-2的離體葉片為實(shí)驗(yàn)材料，用甲基紫精(MV)高光誘導(dǎo)的光氧化脅迫處理，研究?jī)?nèi)源抗壞血酸對(duì)水稻葉片抗光氧化能力的影響. MV高光處理后，超表達(dá)型水稻葉片的超氧陰離子和過氧化氫含量明顯低于野生型和干涉型. 水稻葉片的膜脂過氧化加劇，可溶性蛋白發(fā)生了降解，其中干涉型受到的影響最大. 葉綠素?zé)晒庀嚓P(guān)參數(shù)的變化體現(xiàn)了超表達(dá)的優(yōu)勢(shì). 結(jié)果顯示抗壞血酸含量高的超表達(dá)株系具有更強(qiáng)的抗氧化脅迫能力，而干涉型株系的抗氧化脅迫能力最差，從而說明了內(nèi)源抗壞血酸能明顯增強(qiáng)水稻抗氧化能力.

水稻； 抗壞血酸；GLDH基因； 氧化脅迫

抗壞血酸(Ascorbic Acid，AsA)又名維生素C(Vitamin C)，是植物體內(nèi)的一種重要抗氧化劑，直接或間接清除體內(nèi)的活性氧[8]，植物中的抗壞血酸含量與抗逆性呈正相關(guān)[9]. 有研究表明，L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶(GLDH)是植物合成抗壞血酸的限速酶[10]，使GLDH基因超表達(dá)能夠提高植物中的抗壞血酸含量[11]，在水稻中也有同樣的結(jié)果，且超表達(dá)株系和干涉型株系已經(jīng)成功構(gòu)建[12]. 本研究用MV高光處理3種株系水稻離體劍葉，分析不同株系水稻對(duì)MV高光介導(dǎo)的氧化脅迫的響應(yīng)，探討內(nèi)源抗壞血酸對(duì)水稻抗光氧化脅迫的影響.

1 材料和方法

1.1 植物材料

水稻粳稻品種中花11(WT)和在中花11的遺傳背景下構(gòu)建的GLDH基因超表達(dá)株系GO-2和干涉株系GI-2，水稻種子由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)彭新湘教授實(shí)驗(yàn)室提供. 水稻種植于華南師范大學(xué)生物系試驗(yàn)田，常規(guī)水肥管理和病蟲害防治. 剪取揚(yáng)花期水稻劍葉，實(shí)驗(yàn)組用質(zhì)量濃度為200 μmol/L的MV、光強(qiáng)為1 600 μmol/(m2·s)的高光進(jìn)行處理，對(duì)照組用蒸餾水、光強(qiáng)為1 600 μmol/(m2·s)的光進(jìn)行處理.

1.2 抗壞血酸含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]的方法， 取約0.1 g水稻葉片，用1 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為6%的三氯乙酸在冰上充分研磨，4 ℃、13 000 r/m 離心10 min，取上清液加入2 mL反應(yīng)體系中，37 ℃水浴1 h，用分光光度計(jì)檢測(cè)525 nm的吸光值，每次測(cè)定重復(fù)3次.

1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

剪取水稻葉片用濕紗布包好放在黑暗處暗適應(yīng)30 min，暗適應(yīng)后用便攜式熒光測(cè)定儀(PAM-2100，Germany)，設(shè)定光化光強(qiáng)度為150 μmol/(m2·s)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)(最大光化學(xué)效率Fv/Fm,電子流速率ETR,激發(fā)壓1-qP,熱耗散NPQ)，計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[14].

1.4 電解質(zhì)滲透率的測(cè)定

用超純水把水稻葉片沖洗干凈，再吸干葉片表面多余的水分，用打孔器取5片直徑為0.6 cm的葉圓片，放在50 mL的試管中加入20 mL超純水，抽真空使葉片完全浸泡在水中，室溫放置3 h. 用DDS-11A型電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率，記為R1，煮沸30 min，冷卻后再測(cè)定其電導(dǎo)率，記為R2. 以相對(duì)電導(dǎo)率表示細(xì)胞膜的滲透率，計(jì)算方式：相對(duì)電導(dǎo)率=(R1/R2)×100%.

1.5 超氧陰離子的檢測(cè)

超氧陰離子檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[7]，剪取MV高光處理的水稻葉片約2 cm，放在試管中，加入質(zhì)量濃度為1 g/L的25 mmol/L Hepes buffer(pH=7.6)的硝基藍(lán)四氮唑藍(lán)(Nitroblue Tetrazolium,NBT)15 mL，抽真空，黑暗室溫放置8 h. 取出葉片用超純水沖洗后放入80%的乙醇溶液中，80 ℃脫色直至葉片無綠色，然后拍照.

1.6 過氧化氫的檢測(cè)

過氧化氫檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[7]，剪取MV高光處理的水稻葉片約2 cm，放在試管中，加入質(zhì)量濃度為1 g/L的50 mmol/L Hepes 緩沖液(pH=3.8)的二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)15 mL，抽真空，黑暗室溫放置6 h. 取出葉片用超純水沖洗后放入95%的乙醇溶液中，室溫脫色直至葉片無綠色，然后拍照.

1.7 可溶性蛋白的測(cè)定

可溶性蛋白參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行測(cè)定. 稱取去除葉脈水稻劍葉葉片0.1 g，剪碎后放入預(yù)冷研缽加入蛋白研磨緩沖液，在冰上充分研磨后，13 000 r/m離心10 min, 取上清液稀釋50倍，向稀釋后的上清液加入等體積的 Bradford工作液，反應(yīng)5 min，用分光光度計(jì)檢測(cè)595 nm的吸光值.

1.8 基因表達(dá)

取揚(yáng)花期水稻劍葉進(jìn)行基因表達(dá)量的測(cè)定，GLDH基因引物序列為GLDH-F：5’-CGGCGGCATCATTCAGGTT-3’，GLDH-R：5’-AAGCCCACAGCGAGCAAGATA-3’，內(nèi)參引物序列為OsUBQ-F：5’-CCAGGACAAGATGATCTGCC-3’,OsUBQ-R：5’-AAGAAGCT-GAAGCATCCAGC-3’. 采用7500 Real Time PCR System進(jìn)行PCR，分析方法來源文獻(xiàn)[16].

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用Microsofe Excel 2010 進(jìn)行整理，用SPSS 12.0 One Way ANOVA 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和LSD檢驗(yàn)，Sigma Plot 12.5繪圖.

2 結(jié)果

2.1 不同轉(zhuǎn)基因水稻植株GLDH表達(dá)量及抗壞血酸含量

3種株系水稻葉片的GLDH基因的表達(dá)量存在顯著差異(圖1)，與野生型相比，超表達(dá)型的GLDH表達(dá)量高20倍，而干涉型低10倍，3種水稻葉片的抗壞血酸含量也都存在顯著差異，且超表達(dá)型最高，干涉型最低，野生型居中.

2.2 MV高光處理后3種基因型植株超氧陰離子和H2O2的積累

在植物體內(nèi)，超氧陰離子和H2O2能夠分別與NBT和DAB反應(yīng)，生成不溶于水的藍(lán)色顆粒和黃褐色沉淀于葉片表面[17]. 分別用NBT和DAB對(duì)經(jīng)過MV高光處理后的3種水稻劍葉進(jìn)行染色，結(jié)果顯示3種水稻都被染色，其中超表達(dá)株系的染色最淺，野生型和干涉型株系染色較深(圖2).

圖1 GLDH相對(duì)表達(dá)量和抗壞血酸含量

Figure 1 Relative expression ofGLDHgene and ascorbic acid content in leaf

注：不同字母表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(下圖同).

圖2 MV光氧化后DAB和NBT染色

2.3 MV高光對(duì)3種基因型植株可溶性蛋白及電解質(zhì)滲透率的影響

MV高光處理后水稻葉片的可溶性蛋白含量均有所降低，其中干涉型下降的最大幅度為31.9%，而超表達(dá)型和野生型分別降低了27.7%和23.8%(圖3). 電導(dǎo)率的大小可以反映膜脂完整性，MV高光處理加劇了水稻葉片的膜脂過氧化程度(圖3). 其中干涉型的膜脂受光氧化最嚴(yán)重，電解質(zhì)滲透率增加了57%，而超表達(dá)型和野生型分別增加了40.5%和24.7%. MV高光處理后干涉型的電解質(zhì)滲透率顯著高于超表達(dá)型和野生型.

圖3 可溶性蛋白和電解質(zhì)滲透率的變化

Figure 3 Changes of soluble protein and ion leakage rate

2.4 MV高光對(duì)3種基因型植株葉綠素?zé)晒獾挠绊?/p>

MV高光對(duì)3種水稻葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響趨勢(shì)一致，在MV高光處理前Fv/Fm、1-qP、NPQ和ETR的值相近，MV高光處理后均發(fā)生了顯著變化. 其中Fv/Fm、NPQ和ETR都處于下降趨勢(shì)，1-qP則是上升的. 超表達(dá)型植株葉片的Fv/Fm和NPQ下降的程度顯著低于野生型和干涉型，而1-qP上升程度顯著低于野生型和干涉型(圖4).

3 討論

光和氧是光合作用進(jìn)行的必要條件，也是MV毒性所表達(dá)的必須條件，它可接受光合電子傳遞鏈中PS Ⅰ的電子成為水溶性的陽(yáng)離子自由基MV2+，隨后迅速與氧反應(yīng)形成超氧陰離子[18]，也可通過Winterbourn的反應(yīng)或Fenton反應(yīng)形成高毒性的·OH[19]，造成植物的強(qiáng)氧化脅迫，進(jìn)而誘導(dǎo)或加劇植物的光氧化損傷. 文獻(xiàn)[20]表明AsA可以清除植物體內(nèi)因氧代謝及環(huán)境脅迫等產(chǎn)生的活性氧，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體免于氧化脅迫造成的傷害. HUANG等[21]以突變體vtc-1為材料，其AsA的含量只有野生型的30%，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下H2O2的積累明顯高于野生型.

圖4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化

本文結(jié)果顯示超表達(dá)的GLDH的相對(duì)表達(dá)量高于野生型，是野生型的20倍，而干涉型的GLDH相對(duì)表達(dá)量低于野生型，是野生型的0.1倍(圖1A). 相較于野生型，超表達(dá)的抗壞血酸含量增加了18.7%，干涉型的抗壞血酸含量減少57.9%(圖1B). 由此可看出超表達(dá)或干涉GLDH的表達(dá)量確實(shí)可以改變水稻的內(nèi)源AsA含量，說明GLDH的表達(dá)量同AsA的含量呈正相關(guān). 這也與前人的研究發(fā)現(xiàn)GLDH與抗壞血酸的含量有密切關(guān)系是相符的[22]. 在MV介導(dǎo)的光氧化處理下，在短時(shí)間介導(dǎo)的光氧化下，3個(gè)株系的可溶性蛋白都呈下降趨勢(shì)，其中干涉型的下降最快，較處理組下降了31.9%(圖3A)，而電解質(zhì)滲透率都呈升高趨勢(shì)，且干涉型的增加最快，較處理前增加了5.7%(圖3B). 隨著光氧化處理時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)v/Fm和ETR都呈下降趨勢(shì)，且都是干涉型的下降速度最快(圖4A、B)；1-qP在初期并沒有顯著變化，后期卻迅速上升，且超表達(dá)的上升最慢而干涉型的最快(圖4C)；NPQ的計(jì)算可看出在此期間其先上升后下降且超表達(dá)的上升最快(圖4D). 而活性氧定位分析顯示，在光氧化處理后，干涉型的活性氧積累最多最明顯(圖2). 而BRATT等[23]研究紫黃質(zhì)去環(huán)氧酶通過消耗AsA催化紫黃質(zhì)生成玉米黃質(zhì)，從而將過剩的光能以NPQ的葉綠素?zé)晒忉尫牛Ｗo(hù)光合器官. 因此可以推斷超表達(dá)GLDH水稻株系的耐光氧化是通過增加內(nèi)源AsA的含量，減少了活性氧的產(chǎn)生，進(jìn)而增加NPQ將過剩光以熱形式耗散，從而減緩水稻劍葉膜脂損傷，減慢PSⅡ活性的喪失.

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【中文責(zé)編：莊曉瓊 英文責(zé)編：李海航】

Effects of Endogenous Ascorbic Acid on Resisting Oxidative Stress of Rice

ZHANG Qilei， GAO Hui， PENG Changlian*

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, School of Life Science,South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

The homozygote transgenic lines GO-2 with the up-regulatedGLDH( the key enzyme that catalyzes the final step of Asc biosynthesis in plants) gene and GI-2 with the down-regulatedGLDHgene had been established from the cultivar ‘Zhong Hua11’ (WT). Treatment three rice cultivars with methyl viologen(MV) and the effect of changes of endogenous ascorbic acid on resistance to oxidative stress of rice (Oryzasativa) were investigated among three rice cultivars of WT, GO-2 and GI-2. After treatment with MV photo-oxidation, superoxide anion and H2O2were lower in GO-2 than in WT or GI-2. GI-2 was the weakest in membrane lipid oxidation and soluble protein degradation in the three rice cultivars. Changes of chlorophyll fluorescence quenching in three rice cultivars in GO-2 were greater than in the WT or GI-2. The results showed that GO-2 had stronger resistance to oxidative stress which proved that ascorbic acid is important for rice resistance to oxidative stress.

Oryzasativa; ascorbic acid;GLDHgene; oxidative stress

2016-07-03 《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270287,31570398)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015A030311023)

Q945.3

A

1000-5463(2016)06-0025-05

*通訊作者:彭長(zhǎng)連，研究員，Email：pengchl@scib.ac.cn.