瘦素及其受體在甲狀腺乳頭狀癌組織中共同高表達

馬小開，謝傳信，王圣應(yīng)，鄭緒才，黃建康，朱正志，姚廷敬，張暉，馮振中

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外一科，蚌埠 233000；2亳州市人民醫(yī)院腫瘤外科，亳州 236000；3安徽省腫瘤醫(yī)院頸胸腫瘤外科，合肥 230000；4蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，蚌埠 233000）

瘦素及其受體在甲狀腺乳頭狀癌組織中共同高表達

馬小開1*，謝傳信2，王圣應(yīng)3*，鄭緒才3，黃建康1，朱正志1，姚廷敬1，張暉1，馮振中4

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外一科，蚌埠 233000；2亳州市人民醫(yī)院腫瘤外科，亳州 236000；3安徽省腫瘤醫(yī)院頸胸腫瘤外科，合肥 230000；4蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，蚌埠 233000）

目的 探討瘦素（leptin）和瘦素受體（leptin recptor，LEPR）在甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）組織中的表達及其臨床意義。方法 采用免疫組織化學(xué)Elivision法分別檢測60例甲狀腺乳頭狀癌組織和45例甲狀腺腺瘤組織中l(wèi)eptin和LEPR的表達，免疫熒光雙染檢測leptin及LEPR在甲狀腺乳頭狀癌組織和癌旁正常甲狀腺組織中的共同表達；Pearson相關(guān)性分析法分析PTC組織中l(wèi)eptin和LEPR表達水平之間的相關(guān)性，卡方檢驗法分析leptin和LEPR表達與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果 Leptin和LEPR在PTC組織中的陽性表達率均高于甲狀腺腺瘤組織；二者在PTC組織中的表達呈正相關(guān)，并呈共同高表達；在PTC組織中，腫瘤直徑≥1cm者leptin和LEPR陽性表達率均高于腫瘤直徑＜1cm者；leptin和LEPR在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性表達率均低于未發(fā)生轉(zhuǎn)移者。結(jié)論 leptin和LEPR在PTC組織中呈現(xiàn)共同高表達，且兩者的表達與腫瘤直徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等腫瘤進展指標(biāo)密切相關(guān)，提示兩者可能在PTC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可以作為PTC治療的潛在靶點。

甲狀腺乳頭狀癌；瘦素；瘦素受體

甲狀腺乳頭狀癌（thyroid papillary carcinoma，PTC）是甲狀腺癌中惡性程度較低的一種，占60%～80%，患者多為女性。PTC預(yù)后較好，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機會多，臨床觸不到淋巴結(jié)的患者，經(jīng)選擇性頸清掃術(shù)后，病理結(jié)果提示46%～72%的病例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［1］。我們總結(jié)前期的臨床工作發(fā)現(xiàn)PTC的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的規(guī)律，通常頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ區(qū)為主，尤以Ⅵ區(qū)最常見［2］，但對于這種淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機制，目前尚不清楚。

瘦素（leptin）是由肥胖基因（Obesity genes，OB）編碼、白色脂肪組織分泌的一種蛋白質(zhì)類激素，目前已證實leptin可以促進PTC細胞的增殖及抗其凋亡［3，4］，但leptin及l(fā)eptin受體（LEPR）在PTC中的其他功能尚不明確。本文旨在通過觀察leptin及LEPR在PTC組織中的表達及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，為分析其在PTC的進展過程中的作用提供線索。

材料和方法

1 病例

收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外一科2012年6月至2013年6月行甲狀腺手術(shù)患者病歷及病理資料進行統(tǒng)計分析。根據(jù)隨機原則，選取甲狀腺乳頭狀癌組織蠟塊標(biāo)本60例，男性25例，女性35例（術(shù)后病理示17例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、43例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）和甲狀腺腺瘤組織標(biāo)本45例，以上病歷資料詳盡、完整，所有患者術(shù)前均未行內(nèi)分泌、化療及放療等治療，標(biāo)本結(jié)果均經(jīng)病理證實。所有實驗所用甲狀腺組織蠟塊標(biāo)本均為手術(shù)后2h以內(nèi)的新鮮標(biāo)本，先于4℃下用10%甲醛（pH值7.2～7.4）固定6～12h，后充分水洗，石蠟包埋封存。

2 試劑

Elivision法免疫組織化學(xué)染色用兔抗人LEP單克隆抗體、兔抗人LEPR單克隆抗體、即用型快捷免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，免疫熒光用兔多克隆抗體（Anti-leptin抗體ab16227）和小鼠單克隆抗體（Anti-leptin receptor抗體LPR-02 ab2143）為Abcam產(chǎn)品，羊抗小鼠IgG（H＋L）488和羊抗兔IgG（H＋L）546）為Invitrogene產(chǎn)品。

3 Elivision法免疫組織化學(xué)染色與結(jié)果判定

Leptin及LEPR檢測主要步驟參照ElivisionTMplus試劑盒說明書兩步法：切片脫蠟、水化，微波抗原修復(fù)及過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，分別滴加一抗（1：40），4℃孵育過夜，PBS沖洗后滴加二抗孵育30min后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、二甲苯透明、中性樹膠封固后顯微鏡下觀察。PBS替代一抗作陰性對照，已知陽性片作陽性對照。由兩位有經(jīng)驗的臨床病理醫(yī)師采用雙盲法對每例切片染色結(jié)果進行判讀，根據(jù)陽性細胞占視野中所有組織細胞中的比例以及陽性細胞的染色強度來判定實驗結(jié)果：按顯色細胞數(shù)（A）記分：陽性細胞數(shù)＜1／3為1分，陽性細胞數(shù)1／3～2／3為2分，陽性細胞數(shù)≥2／3為3分。按細胞顯色深淺（B）記分：無陽性反應(yīng)細胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。積分?jǐn)?shù)＝A×B。A×B＝0判斷為（-），A×B＝1～2判斷為（＋），A×B＝3～4判斷為（＋＋），A×B＝6～9判斷為（＋＋＋）。實驗結(jié)果（-）與（＋）視為陰性，（＋＋）與（＋＋＋）視為陽性。

4 免疫熒光雙重染色

冰凍切片恢復(fù)室溫，PBS洗3次除去包埋劑，冰甲醇固定10min，BSA、Triton X-100室溫封閉破膜60min，滴加一抗（1：100）稀釋液約100μl，置濕盒中4℃過夜，熒光二抗（1：500）室溫避光孵育1h，PBS洗片、封片，室溫放置1h待片干后放入冰箱避光保存，在熒光顯微鏡下觀察。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，對實驗數(shù)據(jù)進行分析，臨床特征由相關(guān)數(shù)據(jù)表示，根據(jù)數(shù)據(jù)類型，對結(jié)果進行χ2檢驗、Spearman等級相關(guān)分析等進行相關(guān)分析。

結(jié)　果

1 Leptin和LEPR在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達率高于甲狀腺腺瘤組織

Elivision法免疫組織化學(xué)染色顯示，leptin主要在PTC組織的細胞膜和（或）胞質(zhì)中呈陽性表達（圖1A），而在甲狀腺腺瘤中主要呈陰性表達（圖1B），在PTC和甲狀腺腺瘤中的陽性表達率分別為78.33%和26.67%（表1）。LEPR主要在 PTC組織的細胞膜和（或）胞質(zhì)中呈陽性表達（圖1C），在甲狀腺腺瘤中主要呈陰性表達（圖1D），在PTC和甲狀腺腺瘤中的陽性表達率分別為70.00%和40.00%（表1）。Leptin和LEPR在PTC組織中共同陽性表達率為60.00%；免疫熒光雙重染色顯示，PTC組織中，幾乎所有的leptin強陽性細胞同時強表達LEPR（圖2）；Spearman相關(guān)分析顯示，leptin和LEPR表達水平之間呈正相關(guān)（表2）。

2 Leptin和LEPR在甲狀腺乳頭狀癌中的表達與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)

將PTC中l(wèi)eptin和LEPR的表達與患者臨床病理特征進行相關(guān)分析顯示，leptin和LEPR在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達率均低于未發(fā)生轉(zhuǎn)移組，同時發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑≥1cm組患者中l(wèi)eptin和LEPR陽性表達率均高于腫瘤直徑＜1cm組（表3）。

圖1　Leptin和　LEPR在甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺腺瘤中的免疫組織化學(xué)表達。A，甲狀腺乳頭狀癌組織中l(wèi)eptin表達；B，甲狀腺腺瘤組織中l(wèi)eptin表達；C，甲狀腺乳頭狀癌組織中LEPR表達；D，甲狀腺腺瘤組織中LEPR表達；比例尺，50μmFig.1　Immunohistochemical expression of leptin and LEPR in PTC and thyroid adenoma.A，Expression of leptin in PTC；B，Expression of leptin in thyroid adenoma；C，Expression of LEPR in PTC；D，Expression of LEPR in thyroid adenoma；scale bar，50μm

圖2　Leptin和LEPR在甲狀腺乳頭狀癌組織共定位的免疫熒光雙標(biāo)檢測。A，leptin；B，LEPR；箭頭示雙標(biāo)細胞；比例尺，50μmFig.2　Immunofluorescent double labeling for co-localization of leptin and LEPR in PTC.A，leptin；B，LEPR；arrows indicate the double labelling cells；scale bar，50μm

表1　Leptin及　LEPR在甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺腺瘤中的表達Table 1　The expression of leptin and LEPR in PTC and thyroid adenoma

表2　Leptin及　LEPR在甲狀腺乳頭狀癌中表達的關(guān)系Table 2　The correlation between the expressions of leptin and LEPR in PTC

表3　甲狀腺乳頭狀癌中　leptin和　LEPR的表達和臨床特征的關(guān)系Table 3　The relationship between the expression of leptin／LEPR and clinical features in PTC

討　論

甲狀腺癌的檢出率逐年提高，醫(yī)生通過體檢發(fā)現(xiàn)甲狀腺結(jié)節(jié)的患病率是3%～7%，應(yīng)用超聲檢查出甲狀腺結(jié)節(jié)的患病率從20%～76%不等［5，6］。而在甲狀腺結(jié)節(jié)中通過手術(shù)切除，術(shù)后病理證實為惡性的概率約5%～10%［7］，嚴(yán)重影響群眾健康及生活水平。

PTC是甲狀腺癌最常見的一個類型，占甲狀腺惡性腫瘤的60%～70%［8］。甲狀腺癌的發(fā)病機制尚不明確，目前惟一明確的甲狀腺癌危險因素是兒童期電離輻射接觸史，其與PTC的發(fā)生密切相關(guān)［9］。近年來越來越多的學(xué)者研究肥胖與甲狀腺癌的相關(guān)性時認(rèn)為肥胖可能增加患甲狀腺癌的風(fēng)險，孔娜等對385例良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)臨床資料比較分析提示體重指數(shù)大于正常的患者甲狀腺癌的發(fā)病風(fēng)險可能增加［10］。Kitahara等［11］通過研究身體質(zhì)量指數(shù)（Body Mass Index，BMI）和甲狀腺癌風(fēng)險之間的關(guān)系，認(rèn)為肥胖是患甲狀腺癌的高危因素。

Leptin是由肥胖基因OB編碼、白色脂肪組織分泌的一種蛋白質(zhì)類激素，需要與其受體LEPR結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。在生理狀態(tài)下，leptin可以通過影響下丘腦室旁核中促甲狀腺釋放激素基因的表達而發(fā)揮調(diào)節(jié)甲狀腺激素分泌的作用，甲狀腺激素也可通過影響體脂含量及促甲狀腺激素等對leptin發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用［12］。相關(guān)研究已經(jīng)證明leptin及LEPR在正常乳腺上皮組織以及乳癌細胞中均有表達，且在乳腺癌細胞中可檢測到瘦素受體mRNA的過表達［13，14］，此外，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中，leptin都可促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［15-17］。

Leptin和LEPR在PTC中的作用機制尚未明確。有文獻報道，leptin可通過PI3K／AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來刺激腫瘤細胞的增殖，同時促進腫瘤細胞的抗凋亡作用［18］。Melih等［19］應(yīng)用ELISA來檢測PTC患者中血清leptin水平，發(fā)現(xiàn)其顯著高于正常人群。Rania等［20］發(fā)現(xiàn)分化型甲狀腺癌患者術(shù)前的的血清leptin處于較高水平，術(shù)后一月下降明顯，提示瘦素與分化型甲狀腺癌相關(guān)并有助于其診斷。Yaghmaei［4］等的研究顯示甲狀腺癌患病組的血清leptin明顯高于正常對照組，而兩組之間的BMI、甲狀腺激素和促甲狀腺激素水平無顯著差異。本研究結(jié)果也提示，leptin和LEPR的表達與患者的BMI值無關(guān)。Fan等的研究也證實，leptin和LEPR的表達與乳頭狀甲狀腺癌、濾泡狀甲狀腺癌及甲狀腺未分化癌相關(guān)，且在甲狀腺乳頭狀癌患者中高水平的leptin和LEPR提示預(yù)后較差［21］。

本實驗通過檢測60例甲狀腺乳頭狀癌組織和45例甲狀腺腺瘤組織中l(wèi)eptin和LEPR的表達情況，發(fā)現(xiàn)leptin及LEPR在PTC中的陽性表達率均高于甲狀腺腺瘤組織，說明leptin及LEPR可能參與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展。此外，leptin和LEPR在PTC組織中共同表達率為60.00%，二者呈顯著正相關(guān)，且免疫熒光雙標(biāo)也證實二者在甲狀腺乳頭狀癌組織中共同高表達。結(jié)合leptin在乳腺癌ZR-75-1細胞系中可以促進其受體的表達［22］的研究，我們推測甲狀腺乳頭狀癌細胞中l(wèi)eptin可能是通過相同的方式誘導(dǎo)其受體LEPR的表達，但其中的具體機制尚待我們進一步探究。

在PTC組織中，leptin和LEPR的表達與腫瘤的大小有關(guān)，腫瘤越大二者陽性表達率越高，也進一步說明leptin及LEPR促進腫瘤的發(fā)展，這與Cheng等［23］研究結(jié)果一致。于霄等［24］研究結(jié)果顯示，leptin在甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達要高于未轉(zhuǎn)移組，且PTC組織中新生血管密度隨leptin表達強度的增強而增加，說明leptin參與甲狀腺乳頭狀癌組織中血管的生成及腫瘤的進展。本研究結(jié)果顯示leptin及LEPR在甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達率均要低于未轉(zhuǎn)移組，其中l(wèi)eptin在未轉(zhuǎn)移組的表達率為86%，與于霄等研究結(jié)果接近（89.66%），究其原因可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組樣本量較小有關(guān)，在后續(xù)的研究中將會得到進一步驗證。

［1］董志偉，谷銑之.臨床腫瘤學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，2002，618-619.

［2］王圣應(yīng)，朱正志，彭德峰，等.分化型甲狀腺癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移規(guī)律的研究.中華外科雜志，2008，46（18）：1404-1406.

[3]Uddin S,Hussain AR,Siraj AK,et al.Role of leptin and its receptors in the pathogenesis of thyroid cancer.Int J Clin Exp Pathol,2011,4(7):637-643.

[4]Hedayati M,Yaghmaei P,Pooyamanesh Z,et al.Leptin:a correlated Peptide to papillary thyroid carcinoma?J Thyroid Res,2011,2011:832163.

[5]Gharib H,Papini E,Paschke R,et al.American Association of Clinical Endocrinologists,Associazione Medici Endocrinologi,and European Thyroid Association medical guidelines for clinical practice for the diagnosis and management of thyroid nodules.Endocr Pract,2010,16(suppl1):1-43.

［6］熊專，孫暉，萬姍等.不同性質(zhì)甲狀腺結(jié)節(jié)臨床特征的分析.華中科技大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2014，43（4）：444-448.

[7]Cooper DS,Doherty GM,Haugen BR,et al,Revised A-merican Thyroid Association management guidelines for patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer.Thyroid,2009,19(11):1167-1214.

[8]Burton TR,Henson ES,Baijal P,et al.The pro-cell death Bcl-2 family member,BNIP3,is localized to the nucleus of human glial cells:Implications for glioblastoma multiforme tumor cell survival under hypoxia.Int J Cancer,2006,118 (7):1660-1669.

[9]Boice JD Jr.Radiation and thyroid cancer:what more can be learned?Acta Oncol,1998,37(4):321-324.

［10］孔娜，陳昕彥，張春玉，等.385例良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)臨床資料比較分析.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2012，28（10）：806-810.

[11]Kitahara CM,Platz EA,Freeman LE,et al.Obesity and thyroid cancer risk among US men and women:a pooled analysis of five prospective studies.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2011,20(3):464-472.

[12]Légrádi G,Emerson CH,Ahima RS,et al.Leptin prevents fasting-Induced suppression of prothyrotropin-releasing hormone messenger ribonucleic acid in neurons of the hypothalamic paraventricular nucleus 1.Endocrinology,1997,138 (6):2569-2576.

[13]Rouet-Benzineb P,Aparicio T,Guilmeau S,et al.Leptin counteracts sodium butyrate-induced apoptosis in human colon cancer HT-29 cells via NF-κB signaling.J Biol Chem, 2004,279(16):16495-16502.

[14]Cascio S,Bartella V,Auriemma A,et al.Mechanism of leptin expression in breast cancer cells:role of hypoxia-inducible factor-1α.Oncogene,2008,27(4):540-547.

[15]Yen WL,Lu DY,Lee MJ,et al.Leptin induces migration and invasion of glioma cells through MMP-13 production. Glia,2009,57(4):454-464.

[16]Saxena NK,Sharma D,Ding X,et al.Concomitant activation of the JAK／STAT,PI3／AKT,and ERK signaling is involved in leptin-mediated promotion of invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells.Cancer Res,2007, 67(6):2497-2507.

[17]Sharma D,Saxena NK,Vertino PM,et al.Leptin promotes the proliferative response and invasiveness in human endometrial cancer cells by activating multiple signal-transduction pathways.Endocr Relat Cancer,2006,13(2):629-640.

[18]Uddin S,Bavi P,Sirj A,et al.Leptin-R and its association with PI3K／AKT signaling pathway in papillary thyroid carcinoma.Endocr Relat Cancer,2010,17(1):191-202.

[19]Melih A,Funda K,Bahadir C,et al.Leptin Levels in Thyroid Cancer.Asian J Surg,2009,32(4):216-223.

[20]Rania AR,Waleed AE,Reham AE,et al.Study of Serum Leptin in Well-differentiated Thyroid Carcinoma:Correlation with Patient and Tumor Characteristics.World J Surg, 2014,38(10):2621-2627.

[21]Fan YL,Li XQ.Expression of leptin and its receptor in thyroid carcinoma:distinctive prognostic significance in different subtypes.Clin Endocrinol,2015,83(2):261-267.

[22]Chen C,Chang YC,Liu CL,et al.Leptin-induced growth of human ZR-75-1 breast cancer cells is associated with upregulation of cyclin D1 and c-Myc and down-regulation of tumor suppressor p53 and p21WAF1／CIPI.Breast Cancer Res Treat,2006,98(2):121-132.

[23]Cheng SP,Chi CW,Tzen CY,et al.Clinicopathologic significance of Leptin and Leptin receptor expressions in papillary thyroid carcinoma.Surgery,2010,147(6):847-853.

［24］于霄，趙俊軍，王波，等.甲狀腺乳頭狀癌組織中瘦素的表達與血管生成及轉(zhuǎn)移的關(guān)系.中國癌癥雜志，2011，21（4）：283-286.

High level co-expression of leptin and leptin receptor in papillary thyroid carcinoma

Ma Xiaokai1＊,Xie Chuanxin2,Wang Shengying3＊,Zheng Xucai3,Huang Jiankang1,Zhu Zhengzhi1,Yao Tingjing1,Zhang Hui1,Feng Zhenzhong4
（1Department of surgical oncology，the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233000；2Department of surgical oncology，the People＇s Hospital of Bozhou，Bozhou 236000；3Department of cervical thoracic surgical oncology，Anhui Tumor Hospital，Hefei 230000；4Department of Pathology，Bengbu Medical College，Bengbu 233000，China）

Objective To investigate the expression and clinical significance of leptin and leptin receptor(LEPR)in papillary thyroid carcinoma(PTC).Methods In this study,we detected the expression of leptin and LEPR by immunohistochemistry(Elivison) in 60 cases of papillary thyroid carcinoma(PTC)and 45 cases of thyroid adenoma.The coexpression of Leptin and LEPR in papillary thyroid carcinoma and adjacent normal thyroid tissues was detected by immunofluorescent double staining；Pearson correlation was used to analyze the correlation between the expression levels of leptin and LEPR in PTC tissues；the Chi square test was used to analyze the relationship between the expression of leptin and LEPR and the clinicopathological characteristics of the patients.Results The positive rates of leptin and LEPR were higher in PTC than in thyroid adenoma.Both expressions are high and correlated positively in PTC.The positive rates of leptin and LEPR were higher in the group of tumors with a diameter≥1cm than in the group with a diameter＜1cm,while lower in tumors with lymph node metastasis than in those without metastasis.Conclusion Leptin and LEPR were high co-expressed in PTC tissue,and the expression of them was closely related to tumor diameter and lymph node metastasis.These results suggest that both of them may play an important role in the occurrence and development of PTC.They might be potential targets for PTC treatment.

Papillary thyroid carcinoma；leptin；leptin receptor

R739.91

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.012

2015-12-01

2016-10-09

安徽省高校省級自然科學(xué)研究項目資助（KJ2013Z142）；蚌埠醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)基金資助（Byky1371）

馬小開，男（1983年），漢族，主治醫(yī)師

（To whom correspondence should be addressed）：mak0707＠163.com；wangshengying61＠163.com