運(yùn)動改善衰老內(nèi)皮祖細(xì)胞功能活性的機(jī)制研究

夏文豪賈敏張小勤李琰何江余冰波陶軍

1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院高血壓血管病科（廣州 510080）2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科

運(yùn)動改善衰老內(nèi)皮祖細(xì)胞功能活性的機(jī)制研究

夏文豪1賈敏2張小勤1李琰1何江1余冰波1陶軍1

1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院高血壓血管病科（廣州 510080）2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科

目的：探討運(yùn)動對衰老內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）功能活性的影響及機(jī)制。方法：入選30名健康老年人（年齡：64.3±5.6歲），排除主要的心血管危險因素、疾病史和臨床證據(jù)，參與12周中等強(qiáng)度改良布魯斯運(yùn)動試驗（每周3次，每次30 min，共12周）。運(yùn)動前后抽取志愿者外周血20 ml提取分離培養(yǎng)EPCs，比較EPCs體外遷移、粘附能力變化；通過建立裸鼠頸動脈拉脫損傷模型，觀察運(yùn)動對EPCs修復(fù)裸鼠頸動脈內(nèi)皮損傷能力的影響。檢測運(yùn)動前后EPCs表面基因和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：12周的平板運(yùn)動明顯提高衰老EPCs體外的遷移、粘附及血管內(nèi)皮損傷修復(fù)能力（運(yùn)動前：33.1%±6. 2%；運(yùn)動后：50.6%±7.1%；P＜0.01）。EPCs表面的CXCR4信號通路明顯上調(diào)（P＜0.01）。結(jié)論：運(yùn)動明顯改善老年志愿者EPCs血管內(nèi)皮損傷修復(fù)能力，其機(jī)制可能與EPCs表面的CXCR4信號通路密切相關(guān)。

運(yùn)動；內(nèi)皮祖細(xì)胞；內(nèi)皮損傷；內(nèi)皮修復(fù)；CXCR4信號通路

增齡所致血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)的失衡是動脈粥樣硬化血管疾病發(fā)生發(fā)展的始動環(huán)節(jié)之一[1，2]。因此，維護(hù)血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的完整性，是減少增齡相關(guān)心血管疾病發(fā)病率的重要治療措施。研究表明，來源于骨髓存在于外周血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一種內(nèi)源性的血管內(nèi)皮損傷修復(fù)細(xì)胞，對于維持血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的完整性起著重要作用[3，4]。然而，增齡、肥胖以及高脂血癥等多種心血管疾病危險因素會導(dǎo)致循環(huán)中EPCs數(shù)量下降和功能受損，削弱其內(nèi)源性的內(nèi)皮修復(fù)能力[5，6]。運(yùn)動改善血管內(nèi)皮功能，是防治心血管疾病重要生活干預(yù)措施之一[7，8]。同時，我們既往的研究顯示運(yùn)動能上調(diào)人外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量[9]。然而，體育運(yùn)動是否能夠提高老年人內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能活性及其可能的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究探討體育運(yùn)動對老年人EPCs體外的遷移、粘附能力及在體內(nèi)皮損傷修復(fù)能力的影響，研究其可能的分子機(jī)制，為體育鍛煉作為一種有效防治心血管疾病生活方式措施提供新的理論證據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象

本研究納入30名無心血管臨床證據(jù)、危險因素和不服用藥物的老年（年齡：64.3±5.6歲）健康男性志愿者。具體臨床特征總結(jié)于表1中。

1.2運(yùn)動試驗

所有志愿者參加改良布魯斯跑步運(yùn)動試驗，運(yùn)動強(qiáng)度依據(jù)美國心臟協(xié)會所制定的訓(xùn)練和測試標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[10]。受試者進(jìn)行跑步訓(xùn)練每日30 min，每周3次，運(yùn)動代謝當(dāng)量為4.5，為期12周。所有研究對象受試前簽署知情同意書。本研究方案經(jīng)中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.3EPCs的分離和培養(yǎng)

分別抽取健康志愿者外周靜脈血20 ml，采用密度梯度離心法分離純化出外周血單個核細(xì)胞，重懸于EGM-2培養(yǎng)基（含20%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、青霉素100 U/ ml、鏈霉素0.1 mg/ml、VEGF 50 ng/ml），接種于預(yù)先包被好纖維連接蛋白（5 μg/cm2）的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3天后移除未貼壁懸浮細(xì)胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；每3天換液，在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，培養(yǎng)至7天左右的貼壁細(xì)胞即為實驗所用的內(nèi)皮祖細(xì)胞[11]。

1.4EPCs的體外遷移實驗

培養(yǎng)7天之后，將內(nèi)皮祖細(xì)胞消化后重懸，將2× 104個EPCs加入Boyden小室上室，置于24孔板中，在下室中加入500 μl的不含胎牛血清的EBM-2，然后加入100 ng/ml的SDF-1，將其置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24 h后取出Boyden小室，小心棄去上層液體，并用棉簽小心擦掉小室濾膜孔上表面上未遷移的細(xì)胞；將Boyden小室置于4%多聚甲醛溶液中，固定10 min；熒光顯微鏡下觀察，選擇3個不同視野計數(shù)。

1.5EPCs的體外粘附實驗

將培養(yǎng)的HUVECs消化、重懸，按3×105/孔接種到六孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)48 h后形成內(nèi)皮細(xì)胞單層后，加入1 μg/ml CM-DiI染料的無血清EGM-2培養(yǎng)液37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；孵育10 min后，消化重懸；將消化重懸的內(nèi)皮祖細(xì)胞按1× 105/孔加入上述準(zhǔn)備好的內(nèi)皮細(xì)胞單層中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 h后，棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞10 min，DAPI溶液染色10 min，熒光顯微鏡下觀察，計算粘附于內(nèi)皮細(xì)胞單層上的EPCs的數(shù)量。

1.6裸鼠頸動脈拉脫損傷模型

（1）手術(shù)：取8～10周的裸鼠，腹腔注射水合氯醛進(jìn)行麻醉，頸部正中切口游離、暴露頸外動脈后，在其下穿2根5-0絲線，距離大約0.5 cm，結(jié)扎遠(yuǎn)端（靠近頭部端）。在2根絲線間頸外動脈上剪開一小口，插入直徑0.35 mm的金屬導(dǎo)絲至頸總動脈，旋轉(zhuǎn)進(jìn)出3次，結(jié)扎頸外動脈近端。

（2）內(nèi)皮祖細(xì)胞的移植：將運(yùn)動前后培養(yǎng)7天的志愿者EPCs消化，PBS緩沖液重懸為密度5×105/100 μL的細(xì)胞懸液置于37℃（EPCs示蹤實驗時EPCs先用CM-DiI標(biāo)記），拉脫手術(shù)約3 min后裸鼠蘇醒，將上述內(nèi)皮祖細(xì)胞懸液按5×105每只從尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)，對照組用不含細(xì)胞的PBS緩沖液或HUVEs注射。（3）伊文思藍(lán)染色：將手術(shù)3天后的裸鼠麻醉，經(jīng)尾靜脈注入100 μl的5%伊文思藍(lán)溶液，10 min后打開頸部正中切口分離取出雙側(cè)頸總動脈，處死動物；將動脈條置于PBS緩沖液中漂洗干凈后縱切開，內(nèi)膜朝上置于載玻片上拍照[12]。

1.7基因檢測

采用Realtime RT-PCR檢測EPCs表面的趨化因子受體4（chemokine receptor 4，CXCR4）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等目的基因的表達(dá)水平。以Trizol以裂解細(xì)胞，常規(guī)提取RNA。按RT試劑盒說明配制10 μl體系反應(yīng)液，置于梯度PCR儀中，37℃、15 min；85℃、5sec，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。所用引物序列設(shè)計及合成由上海生工生物科技有限公司完成。PCR反應(yīng)體系為SYBR Premix ExTaq酶10 μl、ROX Reference Dye 0.4 μl、cDNA溶液5 μl、相關(guān)的基因引物及內(nèi)參上、下游引物各0.4 μl。上述PCR反應(yīng)液分裝于96-well快速熱循環(huán)板中，每孔

20 μl，實時定量PCR儀反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性5 s、60℃退火/延伸30 s，擴(kuò)增36個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線與融解曲線，進(jìn)行實驗結(jié)果分析。

1.8蛋白檢測

采用Western blotting檢測老年志愿者運(yùn)動前后EPCs目的蛋白的表達(dá)情況。培養(yǎng)7天后的EPCs經(jīng)預(yù)冷的PBS洗滌后，用細(xì)胞裂解液于4℃裂解5 min。將全細(xì)胞裂解產(chǎn)物經(jīng)30×2 s超聲后進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用CXCR4、JAK2及p-JAK2相應(yīng)的特異性I抗［CXCR4（1：1000）、JAK2（1：1000）及p-JAK2（1：1000）單克隆抗體由Abcom公司提供］進(jìn)行識別后，以相應(yīng)的熒光II抗和ECF蛋白印跡分析儀檢測目的蛋白。

1.9統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析采用SPSS19.0軟件。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。運(yùn)動前后兩種之間比較采用配對t檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1老年志愿者運(yùn)動前后基線資料比較

本研究共入組30名無心血管臨床證據(jù)、危險因素和不服用任何藥物的老年人健康男性志愿者。運(yùn)動前后的基線資比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

志愿者（30） 12周運(yùn)動前 12周運(yùn)動后年齡（歲） 64.3 ± 5.6 64.7 ± 6.8體重（kg） 67.8 ± 5.7 66.8 ± 6.6體重指數(shù)（kg/m2） 22.5 ± 3.3 23.5 ± 4.4收縮壓（mmHg） 122.7 ± 7.8 124.4 ± 6.3舒張壓（mmHg） 63.8 ± 6.7 66.6 ± 7.4心率（次/分） 72.7 ± 5.9 71.2 ± 6.2血糖（mmol/L） 4.5 ± 1.2 4.4 ± 1.4總膽固醇（mmol/L） 3.1 ± 1.2 3.0 ± 1.2甘油三醋（mmol/L） 1.3 ± 0.4 1.2 ± 0.5高密度脂蛋白膽固醇（mmol/L） 1.1 ± 0.2 1.0 ± 0.3低密度脂蛋白膽固醇（mmol/L） 2.4 ± 1.1 2.3 ± 1.3血肌酐（μmol/L） 69.2 ± 5.2 71.1 ± 7.3谷丙轉(zhuǎn)氨酶（U/L） 32.0 ± 6.2 31.0 ± 7.1谷草轉(zhuǎn)氨酶（U/L） 25.6 ± 5.3 24.8 ± 7.2

2.2EPCs體外遷移能力

采用改良Boyden小室法，我們比較12周的運(yùn)動前后老年志愿者EPCs體外遷移能力變化。我們的實驗結(jié)果顯示：相比于運(yùn)動前，運(yùn)動后老年人EPCs體外的遷移能力明顯提高（P＜0.01）（圖1）。

2.3EPCs體外粘附能力

通過內(nèi)皮細(xì)胞粘附實驗，我們發(fā)現(xiàn)：老年志愿者運(yùn)動后熒光顯微鏡計數(shù)粘附在內(nèi)皮細(xì)胞單層的EPCs數(shù)量明顯多與運(yùn)動前（P＜0.01）（圖2）。

圖2 運(yùn)動前后老年志愿者EPCs體外粘附能力比較（n=10）

2.4 EPCs體內(nèi)再內(nèi)皮化實驗

借助于頸動脈內(nèi)皮損傷拉脫模型，我們將培養(yǎng)7天后的內(nèi)皮祖細(xì)胞用DiI標(biāo)記，通過尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，3天后比較裸鼠頸動脈內(nèi)皮損傷修復(fù)的面積。我們的研究結(jié)果顯示：相比于運(yùn)動前，12周運(yùn)動后老年志愿者EPCs損傷血管內(nèi)皮化面積明顯更大（運(yùn)動前：36.2%±5.8%；運(yùn)動后：52.1%±8.9%；P＜0.01）（圖3）。

圖3 運(yùn)動前后老年志愿者EPCs內(nèi)皮化比較（n=10）

2.5EPCs表面基因檢測

為了探討運(yùn)動改善EPCs內(nèi)皮損傷修復(fù)能力的可能分子機(jī)制，我們采用實時定量PCR檢測了12周運(yùn)動前后志愿者EPCs表面與損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CXCR4基因表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01），而CXCR7等其它基因無明顯改變（P＞0.01）。

2.6CXCR4信號通路的檢測

采用Western-blotting法，我們檢測EPCs CXCR4蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：運(yùn)動明顯上調(diào)內(nèi)皮祖細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)（運(yùn)動前：1.0±0.2；運(yùn)動后：2.4±0.5；P＜0.01）（圖3）。研究顯示，蛋白質(zhì)酪氨酸激酶（Janus kinase 2，JAK2）是CXCR4的重要的下游基因之一，參與EPCs的血管損傷的修復(fù)過程[12]。因此，我們進(jìn)一步觀察了EPCs的JAK2蛋白表達(dá)情況，研究結(jié)果表明：p-JAK2表達(dá)明顯上調(diào)（運(yùn)動前：1.0±0.2；運(yùn)動后：2.2 ±0.3；P＜0.01）。

圖4 運(yùn)動前后CXCR4信號通路蛋白的表達(dá)（n=10）

表2 運(yùn)動對老年志愿者EPCs表面基因表達(dá)的影響

3 討論

研究表明，外周血中EPCs的數(shù)量及功能活性下降與增齡所致血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)[5，6，13，14]。因此，如何提高EPCs數(shù)量，改善血管其內(nèi)皮修復(fù)能力，對于動脈粥樣硬化性心血管疾病的防治具有重要意義。運(yùn)動是一種有效的生活干預(yù)方式，可影響循環(huán)外周血中EPCs數(shù)量和功能[7-9]。然而，體育運(yùn)動對于老年人EPCs的內(nèi)皮損傷修復(fù)能力的影響及其可能的分子機(jī)制尚未有研究報道。

本研究招募老年健康志愿者進(jìn)行12周的平板運(yùn)動，探討了運(yùn)動對老年志愿者EPCs內(nèi)皮損傷修復(fù)能力的影響及分子機(jī)制。我們的研究結(jié)果顯示：12周平板運(yùn)動明顯提高老年志愿者EPCs體外遷移及粘附能力；同時，通過裸鼠頸動脈內(nèi)皮拉脫損傷模型，我們觀察到運(yùn)動后培養(yǎng)的老年志愿者EPCs歸巢到頸動脈內(nèi)皮損傷局部參與內(nèi)皮損傷修復(fù)的能力顯著增加。這些有趣的結(jié)果表明：體育運(yùn)動不僅能提高老年志愿者EPCs的體外及體內(nèi)功能活性，還能明顯改善其內(nèi)皮損傷修復(fù)的能力。這與我們的前期研究顯示的急性運(yùn)動可顯著提高青年健康志愿者外周血中EPCs的數(shù)量和遷移能力相符合[9]。

為了明確運(yùn)動改善EPCs功能活性可能的分子機(jī)制，我們將運(yùn)動前后老年志愿者EPCs表面與內(nèi)皮修復(fù)

相關(guān)的基因進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示CXCR4基因表達(dá)明顯上調(diào)，其余相關(guān)基因無明顯變化。眾所周知，JAK2是CXCR4的重要下游靶點之一，參與EPCs的內(nèi)皮損傷修復(fù)過程[12，15]。因此，我們對運(yùn)動前后老年志愿者EPCs表面CXCR4/JAK2的蛋白表達(dá)進(jìn)行的比較，結(jié)果顯示，CXCR4及下游的p-JAK2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，提示CXCR4/JAK2信號通路可能參與運(yùn)動相關(guān)的EPCs功能活性的改善。

總之，我們的研究結(jié)果顯示，體育運(yùn)動可明顯改善老年志愿者內(nèi)皮祖細(xì)胞的內(nèi)皮損傷修復(fù)能力，其機(jī)制可能與上調(diào)CXCR4/JAK2信號通路密切相關(guān)。本研究為運(yùn)動作為一種重要的生活方式抵抗衰老相關(guān)的疾病提供新的理論基礎(chǔ)，對于干細(xì)胞在心血管疾病預(yù)防和治療提供了新的證據(jù)。有關(guān)運(yùn)動調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞改善血管內(nèi)皮損傷的具體機(jī)制還有待我們進(jìn)一步的研究繼續(xù)探討。

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Improvement of Reendothelialization Capacity of Endothelial Progenitor Cells in Elderly Subjects through Physical Exercise

Xia Wenhao,Jia Min,Zhang Xiaoqin,Li Yan,He Jiang,Yu Bingbo,Tao Jun
First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University,Guangzhou,China 510080 Corresponding Author:Tao Jun,Email:taojungz123@163.com

Objective To investigate the effect of physical exercise on the reendothelialization capacity of endothelial progenitor cells（EPCs）of elderly subjects and its underlying molecular mechanism.Methods 30 elderly healthy male subjects（64.3±5.6 years）without clinical evidences of cardiovascular risk factors and without concomitant medications were enrolled into the study.They were instructed to exercise according to modified Bruce treadmill endurance-type exercise protocol（30 minutes per day，3 days per week for 12 weeks）（Exercise Standards for Testing and Training of American Heart Association）.The EPCs were isolated and cultured from peripheral blood by density gradient centrifugation method and migration and adhesion function in vitro and reendothelialization capacity in vivo of the subjects were observed before and after the exercise.Results The migration and adhesion function of EPCs in vitro increased from 33.1%±6.2%before the exercise to 50.6%±7.1%after the exercise（P＜0.01）.The expression of chemokine receptor 4（CXCR4）signaling on EPCs were up-regulated obviously after the 12-week exercise.Conclusion Endurance exercise attenuates age-associated reduction in endothelial repair capacity of endothelial progenitor cells probably through the regulation of CXCR4 signaling pathway.

physical exercise，endothelial progenitor cells，endothelial injury，endothelial repair，CXCR4 signaling

2016.01.17

國家自然科學(xué)基金（81200249，31370941，31530023）；廣東省科技計劃項目（2016A020215056）；中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院優(yōu)秀青年人才計劃（2012年）；中山大學(xué)青年教師培育項目（2014年）

陶軍，Email：taojungz123@163.com