肺炎支原體感染實驗室檢測的研究進展

宋 明(SONG Ming)，趙芝娜(ZHAO Zhi-na)，徐慰倬(XU Wei-zhuo)

(沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

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·綜述·

肺炎支原體感染實驗室檢測的研究進展

宋 明(SONG Ming)，趙芝娜(ZHAO Zhi-na)，徐慰倬(XU Wei-zhuo)

(沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

肺炎； 支原體； 發(fā)病機制； 檢測技術(shù)； 抗體； 膠體金； 實驗室；

感染性肺炎(infectious pneumonia)指人體受病原微生物感染而發(fā)生的肺炎，病原體主要包括細(xì)菌、肺炎支原體、真菌和病毒等。每年有數(shù)以萬計的人患病，且無季節(jié)特征，一年四季均可發(fā)生，病情嚴(yán)重程度無明顯特征，各年齡段人群均可感染，尤其以老年人和兒童患者易感，重癥者甚至可導(dǎo)致死亡[1-2]。社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)患者中3.3%～40%是由肺炎支原體感染引起，其中大約25%的肺炎支原體感染者合并肺外并發(fā)癥，引起其他器官的損傷。肺炎支原體感染者臨床癥狀多樣，肺部體征一般較輕，有時甚至無任何肺部癥狀，僅以肺外并發(fā)癥為首要癥狀。根據(jù)患者的流行病史、臨床癥狀、胸片等相關(guān)檢查，難以將其與一般病毒或其他細(xì)菌感染引起的呼吸道疾病相鑒別，所以在肺炎支原體感染的診斷中病原學(xué)檢查具有重要作用。目前，越來越多的報道提示肺炎支原體感染與支氣管炎急性發(fā)作、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫綜合征、急性感染性多發(fā)性神經(jīng)炎(格林-巴利綜合征)、中風(fēng)、冠心病、多發(fā)關(guān)節(jié)炎，以及人類免疫缺陷病毒(HIV)陽性者感染肺炎支原體導(dǎo)致血清陽性率升高有一定的關(guān)聯(lián)[3]，因此，呼吸道感染性疾病和非呼吸道感染性疾病均可能是由于肺炎支原體感染引起。臨床治療過程中需要針對不同的病原體而合理使用抗菌藥物，因此，早期檢測出肺炎支原體對指導(dǎo)治療非常重要。在頭孢類不過敏的人群中，頭孢類藥物用藥安全指數(shù)較高，價格較便宜，抗菌效果較好，臨床使用經(jīng)驗較多，患者接受性較強，所以臨床醫(yī)生通常首先選擇頭孢類藥物治療非病毒性感染疾病。因肺炎支原體無細(xì)胞壁，所以頭孢類藥物對肺炎支原體通常無效，鑒于上述原因支原體感染治療面臨的最大問題就是如何盡快選擇合理有效的抗菌藥物。目前，臨床上部分醫(yī)生一般先給予患者頭孢類抗生素，治療一段時間無效后再換用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素；部分基層醫(yī)院兒科醫(yī)生在尚未診斷為肺炎支原體感染，即開始給予大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療，上述做法均不是治療感染的有效措施，也不能預(yù)防抗菌藥物耐藥。因此，早期、準(zhǔn)確檢測肺炎支原體，可及時指導(dǎo)臨床治療，進而預(yù)防可能發(fā)生的流行和并發(fā)癥，減少抗菌藥物的濫用，減輕患者的病痛與負(fù)擔(dān)。

1 支原體肺炎的發(fā)病機制及治療

1.1 生物學(xué)特征 目前確認(rèn)對人致病的支原體有3種，即肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，MP)、解脲支原體(Mycoplasmaurealyticum，MU)，以及人型支原體(Mycoplasmahumenis，MH)。肺炎支原體是人類原發(fā)性非典型肺炎的病原體[4]。支原體的大小介于細(xì)菌與病毒之間，直徑約為125～150 nm，可通過細(xì)菌濾器，是已知的獨立生活的最小微生物，在含有膽固醇等特殊營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基上才能生長，生長速度極其緩慢，接種10～15 d后才出現(xiàn)很小的菌落(<0.5 mm)，對非作用于細(xì)胞壁的某些抗菌藥物敏感。

1.2 發(fā)病機制及治療措施 支原體較少侵入感染患者的血液及組織內(nèi)，它可以通過特殊頂端結(jié)構(gòu)黏附于感染者呼吸道上皮細(xì)胞膜上，這些特殊結(jié)構(gòu)包括P1蛋白(170 kDa)、P30蛋白(30 kDa)、P116蛋白(116 kDa)、HMW1、HMW2、HMW3蛋白，以及肺炎支原體蛋白質(zhì)A、B、C等，它們在結(jié)構(gòu)和功能上互相協(xié)調(diào)作用，增加了肺炎支原體對宿主上皮細(xì)胞的黏附作用，以此來逃避黏膜纖毛擺動的清除作用。肺炎支原體可刺激機體產(chǎn)生IgM、IgG和IgA抗體，并可引起感染者細(xì)胞膜抗原表位發(fā)生改變，從而產(chǎn)生抗自身抗原的抗體，導(dǎo)致機體損傷。目前，對肺炎支原體P1蛋白研究較多，它屬于膜表面蛋白一種，抗原特異性強[5]，常被用來作為檢測的目的物，但是P1蛋白并不是肺炎支原體獨有的，支原體屬中其他種也有該結(jié)構(gòu)，需注意交叉反應(yīng)。

支原體肺炎的治療原則與一般肺炎的治療原則基本相同，通常采取綜合治療措施?？咕幬锏膽?yīng)用在肺炎支原體感染治療中占據(jù)重要位置，尤其是老年人、兒童或重癥患者，必須選擇合適的抗菌藥物治療支原體感染。通常干擾微生物細(xì)胞壁合成的抗菌藥物，如頭孢類、青霉素類等對肺炎支原體是無效的。因此，治療肺炎支原體感染，應(yīng)選用干擾DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄或抑制蛋白質(zhì)合成的抗菌藥物，如大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氯霉素類、喹諾酮類等[6]。在臨床治療過程中，阿奇霉素治療肺炎支原體感染效果顯著，不僅抗菌作用強，而且藥效持久，但治療過程中需要注意藥物體內(nèi)蓄積和抗生素后效應(yīng)(阿奇霉素長達(dá)48 h)，否則會引起肝腎損傷。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn) 支原體肺炎臨床癥狀常見刺激性咳嗽，酷似百日咳樣咳嗽，肺部經(jīng)常無明顯陽性體征，血清學(xué)檢查很精確，但僅在病情好轉(zhuǎn)后才能提供診斷，因此，給臨床醫(yī)生的診斷帶來極大的困難。

2 肺炎支原體臨床檢測方法

2.1 影像學(xué)方法 支原體肺炎影像學(xué)改變多樣化，陽性特征不顯著，故影像學(xué)檢查特異性較差，單獨依靠影像學(xué)檢查結(jié)果不能作為診斷依據(jù)[7-8]。

2.2 血常規(guī)和C反應(yīng)蛋白(CRP)檢測 肺炎支原體感染患者血白細(xì)胞計數(shù)(WBC)和急性期CRP值與健康者相比，略有升高或無明顯變化，因此，單獨應(yīng)用血常規(guī)和CRP檢測不能診斷支原體肺炎，給臨床診斷帶來困難[9-10]。

2.3 分離培養(yǎng) 肺炎支原體的分離培養(yǎng)是世界衛(wèi)生組織推薦的診斷金標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法耗時2～4 周，靈敏度也較低，不能滿足臨床快速診斷的要求。目前，分離培養(yǎng)方法在臨床診斷上依然適用，現(xiàn)采用了新型快速培養(yǎng)法，標(biāo)本一般采集患者痰，37℃培養(yǎng)5～14 d[11]。培養(yǎng)基由固體培養(yǎng)基變?yōu)橐后w培養(yǎng)基，培養(yǎng)基內(nèi)含肺炎支原體增殖所需的包括膽固醇等特殊營養(yǎng)物質(zhì)在內(nèi)的所有營養(yǎng)成分，并在培養(yǎng)時加入抑制其他微生物生長的青霉素等。肺炎支原體生長的代謝產(chǎn)物會使培養(yǎng)液中指示劑顏色發(fā)生改變(由紅色變?yōu)辄S色為陽性)，以此判斷其生長與否，菌量達(dá)104CFU/mL才有診斷意義。

2.4 聚合酶鏈反應(yīng)( polymerase chain reaction，PCR)檢測 1989年Bernet等[12]將PCR技術(shù)應(yīng)用于肺炎支原體的診斷。PCR方法采用的目標(biāo)基因引物目前有三種，第一種是根據(jù)肺炎支原體編碼P1黏附蛋白的基因設(shè)計，第二種是根據(jù)16SrRNA的基因設(shè)計，第三種是根據(jù)肺炎支原體延伸因子Tu (elongation factor Tu，EF-Tu)的基因設(shè)計[13]。三類引物的設(shè)計均需避免與生殖支原體(Mycoplasmagenitalium，MG)的交叉反應(yīng)。因肺炎支原體的P1蛋白和延伸因子Tu基因與生殖支原體的基因有共同序列，設(shè)計PCR探針時候需要注意。

PCR檢測的準(zhǔn)確性受采樣方法和途徑的影響。目前，常用的采樣方式有兩種：患者呼吸道分泌物及血清采樣，其中呼吸道采樣報道較多。但是呼吸道采樣結(jié)果經(jīng)常與臨床血清學(xué)采樣檢測結(jié)果存在差異，主要是因為一些無癥狀者的咽喉部存在肺炎支原體[14-15]。

PCR方法靈敏度高(可達(dá)20 CFU/5 μL)[16]、特異性強，可用于肺炎支原體感染的早期診斷。但是，該法操作技術(shù)要求高，儀器設(shè)備昂貴，樣品采集、保存和處理要求高(樣品、場所污染均可能造成假陽性)，不適合在一般實驗室開展。而且報道認(rèn)為，PCR檢測結(jié)果為陽性的患者可能并未感染支原體肺炎，一種情況是前面所描述的無癥狀者，另外還可能是既往感染后遺留的片段。Nilsson等[17]報道，急性感染患者喉部殘留的DNA片段可以存在較長時間，可以持續(xù)45～52 d。

2.5 支原體抗體檢測方法

2.5.1 被動凝集法(passive agglutination) 目前，臨床上常用的是日本富士瑞必歐株式會社生產(chǎn)的塞樂迪亞-麥可II肺炎支原體抗體診斷試劑盒(SERODIA-MYCOII)。該試劑盒用人造凝膠顆粒代替紅細(xì)胞成為載體，且避免了既往被動凝集試驗以動物紅細(xì)胞為載體的非特異性反應(yīng)，測定的是肺炎支原體特異性抗體，包含IgA、IgM、IgG，而非直接測定肺炎支原體。該方法主要通過間接試驗檢測肺炎支原體，待檢血清抗體滴度≥1︰40為陽性，但缺點比較明顯，有些既往感染肺炎支原體的患者體內(nèi)IgG滴度水平本身較高，IgG滴度水平在非感染情況下已經(jīng)≥1︰40，造成該方法檢測的陽性率偏高。吳曉等[18]證實采用被動凝集法的陽性率為(56%)，高于冷凝集法(25%)、ELISA法(31%)和金標(biāo)滲濾法(17%)。被動凝集法的結(jié)果判定無需特殊儀器設(shè)備，操作方便、快捷，但是該方法可以檢測肺炎支原體總抗體，無法判斷肺炎支原體感染者血清中升高的抗體具體類型，也無法判斷患者屬于早期感染還是既往感染，因此影響臨床診斷。但若檢出高效價滴度(≥1︰160 )，可以作為肺炎支原體感染早期診斷的一個依據(jù)[19]。

2.5.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) ELISA可檢測肺炎支原體的特異性IgM 或IgG 抗體，操作方法簡單。ELISA 法通常以酶標(biāo)記抗人免疫球蛋白抗體作為示蹤物，可以檢測人血清中的IgM和IgG， 也可以檢測非補體依賴性的抗體，尤其是IgA類抗體。具體操作方法是將抗原物質(zhì)預(yù)先包被在反應(yīng)板微孔中，然后加入受檢者的血清樣品，再加入底物3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB)顯色后，加終止液停止反應(yīng)，在一定波長下測OD值，OD值與被測抗體的含量成正比。ELISA 法對呼吸道肺炎支原體感染的診斷具有重要參考價值，與傳統(tǒng)的支原體培養(yǎng)方法比較，耗時較短，僅需數(shù)個小時，且與其他常見的呼吸道病原體無交叉反應(yīng)[20]。與其他方法比較，受檢者接受抗生素治療不影響ELISA法檢測結(jié)果，能夠避免患者使用抗生素后出現(xiàn)的假陰性結(jié)果。

肺炎支原體ELISA檢測試劑盒的抗原選擇非常重要，它決定了檢測肺炎支原體的靈敏度和特異性，目前主要有四大類抗原，分別是肺炎支原體全細(xì)胞裂解物(whole cell lysates)、蛋白提取物(protein extracts)、膜制備物(membrane preparations)、糖脂提取物(glycolipid extracts)。由于支原體屬中其他種類，以及很多革蘭陰性菌均有與肺炎支原體相同或相似的抗原，所以ELISA方法檢測肺炎支原體抗體的關(guān)鍵是選擇合適的預(yù)包抗原，將其固定在反應(yīng)板微孔中，減少交叉反應(yīng)?，F(xiàn)在已有多家廠商出售ELISA 試劑盒，臨床上應(yīng)用廣泛[21]。R-Biopharm，Euroimunn，Medisonic，Novatec，Zeus，Savyon等均有相關(guān)檢測診斷產(chǎn)品，本文列出了部分市售檢測肺炎支原體抗體的ELISA試劑盒。見表1。

表1 市售檢測肺炎支原體抗體ELISA試劑盒比較[21]

NA ：Not Available,表示不能提供數(shù)據(jù)

目前，許多研究者利用人工合成短肽作為檢測用抗原，這些抗原的基因克隆擴增后導(dǎo)入異源細(xì)胞中進行表達(dá)，然后再將這些表達(dá)出來的重組蛋白作為抗原制成預(yù)包被板，靈敏度高、特異性強。重組ATP合酶β亞單位(recombinant ATP synthase β-subunit，rAtpD)、重組P116蛋白N端片段、重組P1蛋白C端片段、重組P30蛋白質(zhì)，以及它們的融合蛋白等均是ELISA檢測試劑盒中很好的預(yù)包被抗原。本文比較了rAtpD、重組P1蛋白C端片段、重組P116蛋白N端片段、重組P30蛋白質(zhì)，以及它們的融合蛋白作為ELISA檢測試劑盒中預(yù)包被抗原的檢測結(jié)果，結(jié)果顯示這些重組蛋白的靈敏度和特異性均較高，非常適合開發(fā)成檢測肺炎支原體IgM的試劑盒，為早期檢測肺炎支原體提供了重要依據(jù)[22]。見表2。

表2 重組蛋白作為包被抗原的ELISA檢測試劑盒檢測結(jié)果比較

重組蛋白靈敏度(%)特異性(%)P116(N?27)9081P1(C?40)9787P116(N?27)+P1(C?40)9790rAtpD7097rP1?C7090rAtpD?rP1?C7494

ELISA檢測肺炎支原體主要采用患者血清，也有少量報道采用患者尿。ELISA法的缺點也非常明顯，檢測過程中常需兩份不同時期的血清樣本，一份是急性感染期血清樣本，另外一份是感染后2周的血清樣本，后者的抗體滴度應(yīng)該是前者的4倍或大于4倍才可確定為陽性。但臨床上從感染患者體內(nèi)采集兩次血做檢查并不容易，因為兩周后患者癥狀基本緩解，住院患者大部分已經(jīng)出院，尤其是在兒童醫(yī)院，更是難以操作。而且，即使收集到兩次血清樣本，檢測結(jié)果也符合早期臨床診斷，但是2周后的結(jié)果屬于回顧性檢測，此時的檢查結(jié)果對臨床醫(yī)生合理使用抗菌藥物和采取合適的治療策略無任何指導(dǎo)意義。Chang等[23]發(fā)現(xiàn)利用ELISA方法檢測IgM所指示的細(xì)菌感染量與患者臨床表現(xiàn)并不一致，所以單獨使用ELISA法檢測IgM具有很大的局限性，而且也不符合早期診斷的要求。另外，報道[24]顯示，在臨床實際應(yīng)用中部分ELISA試劑盒對成人MP感染的檢出率過低，如何保證ELISA檢測試劑盒高效的靈敏度和穩(wěn)定的特異性，還有待于進一步研究。

2.5.3 膠體金免疫層析法 膠體金免疫檢測技術(shù)是在傳統(tǒng)免疫檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型檢測技術(shù)，其原理是基于抗原抗體反應(yīng)的高特異性和高親和性，以及膠體金納米顆粒的示蹤放大效應(yīng)。1971年Faulk和Taylor兩位研究者將膠體金與抗原結(jié)合，利用抗原標(biāo)記的膠體金研究沙門菌細(xì)胞壁的抗原成分，首次發(fā)現(xiàn)了膠體金標(biāo)記技術(shù)，為膠體金免疫檢測技術(shù)的發(fā)展開辟了新道路[25]。采用膠體金免疫層析試紙條進行檢測，試驗結(jié)果可以在5～10 min內(nèi)通過肉眼進行觀察[26]。目前，檢測病原菌或免疫球蛋白等細(xì)胞或大分子最常用的方法是雙抗夾心法，利用連接于固相載體(硝酸纖維膜)上的抗體(捕獲抗體)和膠體金標(biāo)記抗體(檢測抗體)分別與樣品中被檢測抗原分子上的兩個抗原表位相結(jié)合，形成固相抗體-抗原-膠體金標(biāo)記抗體免疫復(fù)合物。當(dāng)抗原分子所在的液體流經(jīng)金墊時，與溶解了的膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合，然后再往前流動，經(jīng)過檢測線(T線)時被捕獲抗體捕獲，同時部分抗原分子繼續(xù)前進至控制線(C線)，與羊抗鼠抗體結(jié)合，見圖1。該檢測方法無需任何儀器設(shè)備，具有方便、快速、便宜、適合現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，適宜在一般基層醫(yī)院開展應(yīng)用。該檢測方法的報告結(jié)果只能報告陰性或陽性，不能報告滴度。國內(nèi)產(chǎn)品如福建海天藍(lán)波、濰坊康華、珠海麗珠和深圳普瑞康等均已經(jīng)在臨床應(yīng)用。

圖1 雙抗夾心法在膠體金免疫層析中的應(yīng)用原理示意圖

因為該方法檢測的物質(zhì)是針對患者的IgG或IgM，所以也屬于回顧性檢測，約滯后于早期感染數(shù)周，甚至數(shù)個月，也無法在早期給臨床醫(yī)生合理用藥提供幫助，并且該方法存在假陽性，實驗中發(fā)現(xiàn)健康人的樣品檢測結(jié)果也呈陽性[27-28]。目前，膠體金免疫層析方法檢測肺炎支原體的研究主要集中在兩個方向，一是對肺炎支原體半定量或定量的研究，另一個是直接對病原體進行定性檢測。

2.6 檢測肺炎支原體的新方法 基于Fe3O4磁性納米顆粒的可視化技術(shù)檢測病原微生物是近些年發(fā)展起來的新技術(shù)。傳統(tǒng)的Fe3O4磁性納米顆粒和辣根過氧物酶組成的反應(yīng)系統(tǒng)中，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒是固定化的，整個系統(tǒng)的催化效率受到顆粒大小和相對表面積大小的限制。而MingzhuYang團隊開發(fā)出一種可溶性Fe3O4磁性納米顆粒反應(yīng)系統(tǒng)，這種基于可溶性Fe3O4磁性納米顆粒(dissolved Fe3O4magneticn anoparticles，DMNPs)的類過氧化物酶性質(zhì)可視化檢測肺炎支原體技術(shù)突破了傳統(tǒng)反應(yīng)系統(tǒng)限制因素的制約，其反應(yīng)機理是Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4magneticn anoparticles，MNPs)首先完全溶解在一定濃度的含鐵離子的酸中，然后鐵離子催化TMB顯色液中的H2O2，產(chǎn)生高活性的羥基自由基(·OH)，隨后·OH氧化底物TMB顏色變藍(lán)，反應(yīng)物的最大吸收峰在652 nm[29]。見圖2。

Mingzhu Yang團隊將免疫檢測技術(shù)與DMNPs可視化檢測技術(shù)完美融合，開發(fā)出基于DMNPs的間接免疫檢測肺炎支原體系統(tǒng)。見圖3。

圖2 基于DMNPs的類過氧化物酶性質(zhì)可視化檢測技術(shù)原理[29]

圖3 基于DMNPs的間接免疫檢測肺炎支原體系統(tǒng)

實驗中選擇了兩種修飾性磁性顆粒，一種是Fe3O4MNPs-NH2，另外一種是 Fe3O4MNPs-PEI(PEI：聚乙烯亞胺)，然后將修飾性磁性顆粒與二抗相偶聯(lián)。若血清樣本中存在抗肺炎支原體抗體(被檢測抗體IgM)，則標(biāo)記有二抗的修飾性磁性顆粒會與MP IgM結(jié)合形成復(fù)合物，然后復(fù)合物通過IgM與預(yù)先固定好的肺炎支原體P1蛋白(抗原)結(jié)合，經(jīng)過孵育后，洗掉未結(jié)合的復(fù)合物，最后在反應(yīng)體系會發(fā)生圖2中的顯色反應(yīng)，然后通過檢測可得到具體數(shù)值?；贒MNPs的間接免疫檢測肺炎支原體系統(tǒng)是一種靈敏性高、價格低廉、耗時少的技術(shù)。

近年來，量子點(quantum dots，QDs)憑借其自身獨特的光譜特征和光化學(xué)穩(wěn)定性受到人們越來越多的重視。與傳統(tǒng)熒光染料相比，量子點這種半導(dǎo)體納米晶體，具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、發(fā)光效率高，發(fā)光顏色可調(diào)，熒光強度和光穩(wěn)定性較高，且能夠承受多次的激發(fā)和光發(fā)射等一系列優(yōu)點[30-31]，因此，在實驗室診斷得到廣泛應(yīng)用。胡紀(jì)文等[32]研究在偶聯(lián)劑碳二亞胺EDC和N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)的作用下，兔抗人肺炎支原體多克隆抗體與羧基量子點(Cd Se/Ze S)偶聯(lián)，制備量子點標(biāo)記物，以抗P1蛋白抗體作為捕獲抗體，建立雙抗體夾心量子點免疫層析法檢測肺炎支抗原。實驗中檢測了50份臨床咽拭子標(biāo)本，并與培養(yǎng)法相比較，結(jié)果顯示陰性符合率為97%，陽性符合率為100%，最低檢出濃度為0.5 ng/mL，因此，證明該實驗方法可用于肺炎支原體感染的早期診斷。

2.7 直接檢測肺炎支原體的方法 直接檢測肺炎支原體需要克服分離培養(yǎng)的缺點，即必須耗時短，操作簡便，漏報率低。Miyashita等[33]報道了一種檢測肺炎支原體病原體的免疫層析試劑盒Ribotest Mycoplasma (Asahi Kasei Pharma Co.，Tokyo，Japan)，與PCR方法對比，發(fā)現(xiàn)其靈敏度、特異性和總體性能分別是62.5%、90.9%和88.9%。該檢測試劑盒檢測的抗原是患者血清中肺炎支原體核糖體蛋白L7/L12，由于其靈敏度偏低，漏檢率偏高，并且檢測過程中需要抽血取樣，因此不太適合床旁檢測。周轉(zhuǎn)等[20 ]制備了抗肺炎支原體的多克隆抗體，通過ELISA方法檢測，共耗時約6 h，該檢測方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法進行比較，檢測陽性率約為92.86%，并且與其他常見的呼吸道病原體無交叉反應(yīng)。涂少華等[34]制備了Mp單抗5B9、4D6，利用兩個單抗制備了雙抗體夾心ELISA 檢測肺炎支原體抗原的試劑盒，147份臨床標(biāo)本PCR檢測陽性率為13.6%(20/147)，雙抗體夾心ELISA法檢測陽性率為12.2% (18/147)，兩者符合率達(dá)95.9 %。

Li等[35]在2015年開發(fā)出一種快速檢測肺炎支原體的方法，該方法是基于膠體金免疫層析技術(shù)設(shè)計的，選取了一對抗肺炎支原體P1蛋白的單克隆抗體(分別是A和B)作為標(biāo)記抗體和檢測抗體，同時以PCR方法檢測臨床標(biāo)本為“金標(biāo)準(zhǔn)”，兩種方法作了對比實驗，實驗結(jié)果表明膠體金快速檢測肺炎支原體試紙條的特異性達(dá)100%，靈敏度達(dá)97%，最低檢測濃度達(dá)到103copies/mL，實驗結(jié)果見表3。該方法可能會成為一種快速、準(zhǔn)確、簡便的臨床檢測肺炎支原體的新方法。

表3 膠體金法和PCR法檢測結(jié)果的比較

3 展望

目前，肺炎支原體感染實驗室診斷方法大致分為分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢查，以及PCR檢測技術(shù)。肺炎支原體分離培養(yǎng)檢測結(jié)果最可靠，但缺點是時間長，陽性率低。PCR檢測法對儀器設(shè)備要求較高，操作繁瑣，價格昂貴，也不能滿足臨床快速診斷的需要，所以，目前MP感染的實驗室診斷仍然主要依靠血清學(xué)檢查，但是血清學(xué)檢查假陽性或假陰性結(jié)果較多。目前，臨床上基于磁納米球和量子點技術(shù)的新檢測方法應(yīng)用也較少，主要是因為技術(shù)穩(wěn)定性不夠高，仍然需進一步研究。膠體金免疫層析法檢測IgG和IgM的特異性強、靈敏度高，且無需任何儀器設(shè)備，操作簡單快捷。但該方法只能顯示陽性結(jié)果，無法報告滴度，而且該方法和ELISA法檢測抗體相同，均屬于回顧性檢測，實效性不強，臨床應(yīng)用有一定的局限。另外，重癥感染或再感染者可能生成IgM較少，容易出現(xiàn)假陰性，造成漏檢，所以檢測IgM抗體也不是最好的選擇。如果能夠利用操作便捷、特異性強的膠體金免疫層析方法直接檢測肺炎支原體，就可以實現(xiàn)對肺炎支原體的早診斷、早治療，從而提高治愈率，減少抗菌藥物濫用，減輕患者痛苦及經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。

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(本文編輯：孟秀娟)

Advances in laboratory detection forMycoplasmapneumoniaeinfection

(School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang 110016, China)

2016-04-20

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)資助項目(2014AA020901)

宋明(1980-)，男(漢族)，遼寧省大連市人，博士，主要從事臨床檢驗與微生物藥學(xué)研究。

徐慰倬 E-mail：weizhuo@263.net

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.11.022

R375+.2

A

1671-9638(2016)11-0887-07