普瑞巴林聯(lián)合吳茱萸堿對神經(jīng)病理性疼痛大鼠細(xì)胞因子和T細(xì)胞的影響

章玲賓，潘 晨，張 寧，游敏吉，陳 琴，陳佳琪

實(shí)驗(yàn)研究

普瑞巴林聯(lián)合吳茱萸堿對神經(jīng)病理性疼痛大鼠細(xì)胞因子和T細(xì)胞的影響

章玲賓1，潘 晨2，張 寧1，游敏吉1，陳 琴1，陳佳琪3

目的:觀察普瑞巴林聯(lián)合吳茱萸堿對神經(jīng)病理性疼痛大鼠免疫細(xì)胞的影響。方法:SD大鼠30只。隨機(jī)分為5組（每組6只）：假手術(shù)組（S組）、對照組（C組）、普瑞巴林組（P組）、吳茱萸堿組（Q組）和普瑞巴林-吳茱萸堿復(fù)合物（F組）。大鼠暴露左側(cè)L5脊神經(jīng)并結(jié)扎，建立脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)模型，S組大鼠暴露左側(cè)L5脊神經(jīng)，但不結(jié)扎。建立SNL模型7 d后P組腹腔注射普瑞巴林（5 mg/kg），Q組腹腔注射吳茱萸堿注射液（5 mg/kg），F(xiàn)組腹腔注射普瑞巴林-吳茱萸堿復(fù)合物（5 mg/kg），S和C組腹腔注射生理鹽水（2 mL/kg），連續(xù)給藥7 d，觀察測量大鼠神經(jīng)損傷側(cè)的疼痛行為學(xué)的變化。給藥7 d后取主動脈血3 mL檢測大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）和T淋巴細(xì)胞亞群中T細(xì)胞分化群4（CD4+）、T細(xì)胞分化群8（CD8+）的水平。結(jié)果:模型制成后S組大鼠活動如常，其它四組大鼠SNL 1周后，步態(tài)及姿勢出現(xiàn)不同程度的異常；P組、Q組、F組三組動物SNL第10天開始，上述癥狀逐漸緩解，尤其F組癥狀表現(xiàn)輕微。給藥7 d后C組TNF-α為（101.75±15.46）μg/L、IL-6為（32.98±6.64）μg/L、NE為（78.14±4.38）pg/mL、5-HT為（6.21±1.87）μmol/L，較S組TNF-α[（55.14±13.28）μg/L]、IL-6[（18.16±5.98）μg/L]、NE[（23.65±2.21）pg/mL]、5-HT[（1.89±0.76）μmol/L]顯著升高(P＜0.01)；F組TNF-α為（68.54±17.65）μg/L、IL-6為（20.21±4.23）μg/L、NE為（33.08±3.85）pg/mL、5-HT為（2.64±1.38）μmol/L較C組明顯降低(P＜0.05)。給藥7 d后C組CD4+為（16.43±1.68）ng/mL、CD8+為（11.26±2.31）ng/mL較S組CD4+[（25.28±1.56）ng/ mL]、CD8+[（14.05±2.45）ng/mL]顯著降低(P＜0.01)；F組CD4+為（32.45±3.45）ng/mL、CD8+（21.47±1.08）ng/mL較C組升高(P＜0.01或P＜0.05)。結(jié)論:普瑞巴林聯(lián)合吳茱英堿對神經(jīng)病理性疼痛大鼠具有較好的協(xié)同鎮(zhèn)痛作用，優(yōu)于各自單獨(dú)使用；兩者合用能夠使神經(jīng)病理性疼痛家兔炎性細(xì)胞因子的表達(dá)下調(diào)，并能延緩神經(jīng)病理性疼痛大鼠T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+的下降。

神經(jīng)病理性疼痛；普瑞巴林；吳茱萸堿；疼痛行為學(xué)；免疫細(xì)胞

神經(jīng)病理性疼痛是中樞或外周神經(jīng)損傷或產(chǎn)生病變而引起的疼痛[1]，是慢性疼痛中最為難治的一種，可持續(xù)數(shù)天、數(shù)月甚至數(shù)年，發(fā)病率高，臨床治療效果不理想[2]。新型抗癲癇藥物普瑞巴林是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)r-氨基丁酸(GABA)的結(jié)構(gòu)衍生物，具有脂溶性，能通過血腦屏障，對神經(jīng)病理性疼痛治療有良好療效且不良反應(yīng)少，患者耐受性較好[3]。目前普瑞巴林治療神經(jīng)病理性疼痛的作用機(jī)制尚未完全明確。吳茱英堿是吳茱萸的主要有效成分之一，具有鎮(zhèn)痛、降血壓及體溫上升等藥理作用。本實(shí)驗(yàn)提出普瑞巴林聯(lián)合吳茱萸堿應(yīng)用于神經(jīng)病理性疼痛大鼠，并對比聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥，觀察大鼠自發(fā)疼痛行為學(xué)改變、對炎性介質(zhì)和免疫細(xì)胞的影響。評價(jià)瑞巴林聯(lián)合吳茱萸堿應(yīng)用于神經(jīng)病理性疼痛大鼠是否有協(xié)同鎮(zhèn)痛效果。為臨床上治療神經(jīng)病理性疼痛的用藥選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 成年雄性清潔級Sprague-Dawley（SD）大鼠30只(由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量250～350 g，飼養(yǎng)于溫度為（22±2）℃、相對濕度為（55±15）%的動物房鼠籠里，12 h光照/12 h黑暗周期變化，自由攝食飲水。適應(yīng)環(huán)境1周。

1.2 動物模型建立 采用文獻(xiàn)的報(bào)道的方法[4]制作脊神經(jīng)結(jié)扎（spinal nerve ligation，SNL）模型。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后，常規(guī)消毒，俯臥捆綁，沿L4～6脊椎中線切皮，鈍性分離脊椎左側(cè)肌肉組織，切斷橫突，暴露L5脊神經(jīng)，用3.0絲線結(jié)扎并剪斷左側(cè)k脊神經(jīng)。然后逐層縫合肌肉和皮膚，避免術(shù)后感染。假手術(shù)組大鼠暴露左側(cè)L5脊神經(jīng)，但不結(jié)扎。

1.3 研究方法 按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組（每組6只）：假手術(shù)組（S組），對照組（C組），普瑞巴林組（P組），吳茱萸堿組（Q組）和普瑞巴林-吳茱萸堿復(fù)合物（F組）。P組腹腔注射普瑞巴林5 mg/kg，Q組腹腔注射吳茱萸堿注射液5 mg/kg，F(xiàn)組腹腔注射普瑞巴林-吳茱萸堿復(fù)合物5 mg/kg，S和C組腹腔注射生理鹽水2 mL/kg。SNL模型建立7 d后給藥，再連續(xù)給藥7 d。

1.4 指標(biāo)檢測 (1)疼痛行為學(xué)的觀察：①行為學(xué)變化：觀察手術(shù)前及手術(shù)后大鼠步態(tài)、姿勢、后肢著地協(xié)調(diào)程度(尤其是左側(cè))，跛行，大鼠后爪變化以及舔、咬或激烈抖動手術(shù)側(cè)后爪等現(xiàn)象。②機(jī)械縮足痛閾（MWT）測定[5]：在手術(shù)前1 d以及手術(shù)后1、3、5、9、14 d給藥后30 min測量機(jī)械刺激縮足痛閾值。機(jī)械刺激縮足反射閾值的測量：將有機(jī)玻璃箱置于金屬篩網(wǎng)上，待大鼠在有機(jī)玻璃箱中適應(yīng)10 min后，用不同內(nèi)徑的Von Frey尼龍絲，選擇一根合適的Von Frey尼龍絲垂直刺激大鼠左后肢足底中部，逐漸加壓至出現(xiàn)抬足或舔足行為時(shí)作為陽性反應(yīng)，參照up-down法推測閾值。⑵標(biāo)本的采集與檢測：給藥7 d后取主動脈血3 mL，置入不抗凝管常溫下放置1 h后，1500 r/min離心30 min，抽取血清，標(biāo)本置于-20℃以下冰箱中保存。待標(biāo)本收集完成后用ELISA法檢測用于大鼠體內(nèi)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、5-羥色胺（5-HT）和去甲腎上腺素（NE）和T細(xì)胞分化群4（CD4+）、T細(xì)胞分化群8（CD8+）的水平變化檢測。放免法試劑盒由上海生物制品研究所及解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所提供，均按說明書操作。測量儀器為中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司中佳光電GC-1200γ免疫計(jì)數(shù)儀。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)大鼠無自噬、死亡、脫落等現(xiàn)象，30只大鼠全部進(jìn)入結(jié)果分析。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠體重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 疼痛行為學(xué)測定 （1）疼痛行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，S組大鼠活動如常；C組、P組、Q組、F組四組SNL 1周后，步態(tài)及姿勢出現(xiàn)不同程度的異常，左側(cè)患肢活動減少，無力，不能觸地，爪不能伸展，有時(shí)突然舔嗜手術(shù)側(cè)后爪或抖動。C組大鼠術(shù)后，手術(shù)側(cè)后爪有足趾并攏且常處于保護(hù)狀態(tài)(懸與空中)。P組、Q組、F組三組給藥后3 d開始，上訴癥狀逐漸緩解，尤其F組上訴癥狀表現(xiàn)輕微。（2）各組機(jī)械縮足痛閾（MWT）比較：術(shù)前各組大鼠的機(jī)械刺激縮足反射閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。S組大鼠手術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)機(jī)械刺激縮足反射閾值較對照組均顯著降低（P＜0.05、0.01）。P組大鼠術(shù)后第3 d起MWT值較模型組顯著升高（P＜0.05），Q組大鼠手術(shù)后第5 d起MWT值較模型組顯著延長（P＜0.05、0.01），F(xiàn)組從手術(shù)后第3 d起MWT值較S組顯著延長（P＜0.05），較P或Q組顯著延長（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠MWT的比較(±s,n=6)

表1 各組大鼠MWT的比較(±s,n=6)

注：與C組比較：aP＜0.05，bP＜0.01；與S比較：cP＜0.05，dP＜0.01；與P組或Q組比較：eP＜0.05

MWT值（s）組別C組S組P組Q組F組術(shù)前12.7±1.1 12.9±1.8 12.8±2.2 12.6±1.6 12.4±1.9術(shù)后1 d 12.8±0.9 9.8±1.4a10.2±2.2 10.9±2.2 10.4±2.1術(shù)后3 d 13.0±1.2 8.5±1.8b9.6±1.9c10.1±1.9 11.3±2.2c術(shù)后5 d 13.1±1.6 7.6±2.0b10.1±1.4c10.2±1.8c12.8±2.1c、e術(shù)后9 d 12.9±1.4 6.3±1.9b9.1±1.3d9.6±2.3d12.1±1.8c、e術(shù)后14 d 12.8±1.7 5.5±2.1b9.4±1.7d8.4±2.0d11.9±1.7c、e

2.3 血清TNF-a、IL-6水平 給藥7 d后C組TNF-a、IL-6較S組顯著升高(P＜0.01)；P、Q、F三組較C組明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)，見圖1。

圖1 給藥7 d后各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平

2.4 5-HT和NE的表達(dá) 給藥7 d后C組5-HT、NE較S組顯著升高(P＜0.01)；P、Q、F三組較C組明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)，見圖2。

2.5 CD4+、CD8+的表達(dá) 給藥7 d后C組CD4+、CD8+較S組顯著降低(P＜0.01)；P、Q、F三組較C組升高(P＜0.01或P＜0.05)，見圖3。

圖2 給藥7 d各組大鼠血清5-HT、NE水平

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛的治療是全球性的難題，其發(fā)病機(jī)制和治療也成為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中最富挑戰(zhàn)的問題之一。即使采用現(xiàn)有最好的治療方法，仍有半數(shù)以上患者因達(dá)不到滿意的緩解而成為難治性患者。目前藥物治療仍是主要的治療方法。目前多項(xiàng)國際指南規(guī)范了對神經(jīng)病理性疼痛的處理[6-7]。指南推薦的藥物包括抗癲癰藥物、抗抑郁藥物、阿片類藥物、非甾體抗炎劑及局部用藥。當(dāng)單藥治療療效不夠理想時(shí)，可聯(lián)合用藥[8]。聯(lián)合應(yīng)用對中樞神經(jīng)有多種作用機(jī)制的藥物應(yīng)是一種比較有應(yīng)用前景的鎮(zhèn)痛策略。理論上需要多種具有不同作用模式和作用機(jī)制的藥物或不同治療手段進(jìn)行聯(lián)合治療，才能達(dá)到良好或滿意的效果，同時(shí)因所使用藥物劑量的較少，從而降低了不良反應(yīng)的發(fā)生率[9]。

圖3 給藥7 d各組大鼠內(nèi)CD4+、CD8+的測量值

近年來，隨著對神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制的研究深入，發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生和持續(xù)過程中起著重要作用[10-11]。T淋巴細(xì)胞可以介導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)，T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+、CD8+細(xì)胞對穩(wěn)定和調(diào)節(jié)免疫功能起著十分重要的作用。Cui等[11]在幾個(gè)神經(jīng)病理性疼痛模型中發(fā)現(xiàn)，在受損神經(jīng)部位明顯周圍T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞免疫細(xì)胞明顯增加。Moalem等[12]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，成熟T淋巴細(xì)胞缺失的裸鼠坐骨神經(jīng)損傷后，機(jī)械性觸痛和熱痛過敏明顯輕于對照組的野生型大鼠；而將野生型大鼠的T1型淋巴細(xì)胞提取出來并注射到T淋巴細(xì)胞缺失的裸鼠體內(nèi)后，裸鼠神經(jīng)損傷后的痛敏減輕現(xiàn)象消失，提示神經(jīng)損傷后的炎癥反應(yīng)很有可能為淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)。TNF-α、IL-6是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能系統(tǒng)中的重要炎性細(xì)胞因子，神經(jīng)損傷后激活的免疫細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性因子TNF-α，IL-1β和IL-6等。炎性細(xì)胞因子通過結(jié)合在膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元上激活的受體，提高神經(jīng)元興奮性，產(chǎn)生中樞敏化，導(dǎo)致痛閾降低。因此炎性細(xì)胞因子在疼痛的產(chǎn)生及維持中起著重要作用。5-HT和NE是與疼痛相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，在疼痛過程中參與了致痛和鎮(zhèn)痛兩種過程的調(diào)節(jié)。在外周它們均是致痛因子，通過第二信使(鈣離子、環(huán)核苷酸)作用于局部神經(jīng)細(xì)胞或通過旁分泌方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，刺激感覺神經(jīng)末梢而產(chǎn)生疼痛，通過檢測外周血中的致痛因子濃度，可以在一定程度上反應(yīng)出疼痛的程度。

普瑞巴林并不通過GABA機(jī)制直接發(fā)揮作用，其確切機(jī)制尚不明確。通過特異性和突觸前膜P/Q型電壓門控性鈣通道α2-δ亞單位結(jié)合[13]，阻斷電壓依賴性鈣通道，減少Ca2+內(nèi)流，減少大腦皮層谷氨酸鹽、去甲腎上腺素和P物質(zhì)等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，使過度興奮的神經(jīng)元恢復(fù)常態(tài)而發(fā)揮抗癲癇、止痛、抗焦慮作用[14-16]。吳茱萸堿通過感覺神經(jīng)脫敏而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[17]；另外吳茱萸堿具有抗炎作用，可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)從而在疼痛中產(chǎn)生一定的鎮(zhèn)痛作用。其對炎性腳趾的痛閾值有提高作用，但對非炎性腳趾的痛閾值無影響。對醋酸引起的血管通透性增加有抑制作用[18-20]。

本實(shí)驗(yàn)在建立SNL模型后7 d，除S組大鼠活動如常，C組、P組、Q組、F組四組步態(tài)及姿勢出現(xiàn)不同程度的異常，左側(cè)患肢活動減少，無力，不能觸地，爪不能伸展，有時(shí)突然舔嗜手術(shù)側(cè)后爪或抖動。P組、Q組、F組三組給藥3 d后開始，上訴癥狀逐漸緩解，尤其F組上訴癥狀表現(xiàn)輕微。C組大鼠術(shù)后，手術(shù)側(cè)后爪有足趾并攏且常處于保護(hù)狀態(tài)(懸與空中)。表明普瑞巴林聯(lián)合吳茱英堿對神經(jīng)病理性疼痛大鼠具有較好的協(xié)同鎮(zhèn)痛作用，優(yōu)于各自單獨(dú)使用。給藥7 d后C組TNF-α、IL-6、5-HT、NE較S組顯著升高，CD4+、CD8+顯著降低，均P＜0.01，表明一些神經(jīng)介質(zhì)（如5-HT、NE、促炎細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-6）和T細(xì)胞（CD4+、CD8+）的釋放可能與疼痛有關(guān)。結(jié)果還提示給藥7 d后P、Q、F三組血中的TNF-α、IL-6、5-HT、NE較C組明顯降低，CD4+、CD8+升高，均P＜0.05。表明兩者合用能夠使神經(jīng)病理性疼痛家兔炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、5-HT、NE的表達(dá)下調(diào)；能夠延緩神經(jīng)病理性疼痛大鼠T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+的下降。

總之，本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于使用兩種藥效的作用明確的藥物聯(lián)合用于神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛行為學(xué)和T細(xì)胞的影響研究，研究結(jié)果也顯示聯(lián)合用藥的效果較單一用藥的效果好，給臨床治療神經(jīng)病理性疼痛提供了藥效學(xué)的治療依據(jù)。后期還應(yīng)進(jìn)一步的進(jìn)行相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，明確聯(lián)合用藥的作用機(jī)制。

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（收稿：2016-01-26 修回：2016-05-20）

（責(zé)任編輯 劉洪斌）

文稿所含圖表的具體要求

本刊采用三橫線表，如遇有合計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理內(nèi)容（如t值、P值等），則在此行上面加一條分界橫線；表內(nèi)數(shù)據(jù)要求同一指標(biāo)有效位數(shù)一致，一般按標(biāo)準(zhǔn)差的1/3確定有效位數(shù)。表格中注釋用的角碼符號采用單個(gè)角碼的形式，按a、b、c、d、e、f…順序選用，在表注中依先縱后橫的順序依次標(biāo)出。單一角碼用于表示P＜0.05；若用表示P＜0.01，則用雙角碼，如“aP＜0.05；aaP＜0.01”。線條圖的高寬比例以5∶7為宜。

圖片要求有良好的清晰度和對比度，建議采用tif格式，按其在正文中出現(xiàn)的先后次序連續(xù)編碼。組織（病理）學(xué)圖片應(yīng)注明染色方法和放大倍數(shù)。圖片若為人像，應(yīng)征得本人的書面同意，或遮蓋其能被辨認(rèn)出系何人的部分。

照片的大小以9 cm×6 cm為宜，每幅照片的背面應(yīng)貼上在正文中出現(xiàn)的序碼并注明上下方向。大體標(biāo)本照片應(yīng)有尺度標(biāo)記。照片中需標(biāo)注的符號(包括箭頭)請另用紙標(biāo)上，不要直接寫在照片上，照片不可折損。機(jī)上下載的大體和組織、細(xì)胞圖片應(yīng)改拍為像片刊出。

Effect of Pregabalin and Evodiamine on Cytokines and T Cells in a Rat Model of Neuropathic Pain

ZHANG Ling-bin,PAN Chen,ZHANG Ning,et al. Department of Anesthesiology,Lishui People's Hospital of Zhejiang Province,Lishui(323000),China

Objective To observe the effect of pregabalin and evodiamine on immune cells in a rat model of neuropathic pain. Methods Adult male Sprague-Dawley(SD)rats were subjected to left L5spinal nerve li?gation model(SNL).In a sham operation,the left L5spinal nerve was exposed but not ligated.Total 30 mice were randomly assigned to 5 groups(6 rats in each group):sham operation(Group S),control(Group C),pregaba?lin(Group P),evodiamine(Group Q)and pregabalin combined evodiamine(Group F).Seven days after SNL,rats in different groups were treated as follows:intraperitoneal injection of pregabalin(5 mg/kg)(Group P),intraperito?neal injection of evodiamine(5 mg/kg)(Group Q),intraperitoneal injection of pregabalin and evodiamine com?plexes(Group F),Rats in group C were received intraperitoneal injection of physiological saline(2 mL/kg).All treatment lasted for 7 days.From the beginning of the experiment,the changes of pain behavior in rats were observed every day.In the end,blood(3ml)was sampled from the aorta and examined for serum tu?mornecrosis factor-alpha (TNF-alpha),interleu?kin-6(IL-6),5-serotonin(5-HT),and norepinephrine(NE)and for CD4+and CD8+T lymphocytes. Results Spinal nerve ligation changed gait and posture in all related groups.However,gait and posture improved in Group P,Group Q,and Group F 10 days after SNL,especially in Group F.In Group F,serum levels of TNF-α, IL-6,NE,and 5-HT were significantly lower than those in the Group C(P＜0.05).In Group C,CD4+and CD8+T cells were significantly less than Group S.Group F had more CD4+and CD8+T cells than Group C(P＜0.01 or＜0.05). Conclusion Joint use of pregabalin and evodiamine in rat model of neuropathic pain had good synergistic analgesic effect.The combination of the two medicines can decrease the expression of TNF-alpha, IL-6,5-HT,NE and delay the decrease in CD4+,CD8+T lymphocyte subsets in rats with pathological pain.

Neuropathic pain;pregabalin;evodiamine;pain behavior;immune cells

Q9-33;R971+.6

A

1007-6948(2016)04-0350-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.04.011

浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會臨床藥學(xué)科研項(xiàng)目（2014LYZD005）;浙江省麗水市高層次人才資助項(xiàng)目（2014RC35）;浙江省醫(yī)學(xué)會臨床科研項(xiàng)目(2010ZYC-A48)

浙江省麗水市人民醫(yī)院1.麻醉科;2.藥學(xué)部;3.檢驗(yàn)科（麗水 323000）

潘晨，E-mail:pan8chen@qq.com