枯草芽孢桿菌發(fā)酵復方中草藥工藝優(yōu)化

武洪志，宋玉卓，王志龍，郭照宙，許靈敏，王芳芳，刁華杰，許麗，刁新平

（東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱150030）

枯草芽孢桿菌發(fā)酵復方中草藥工藝優(yōu)化

武洪志，宋玉卓，王志龍，郭照宙，許靈敏，王芳芳，刁華杰，許麗，刁新平*

（東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱150030）

為研究枯草芽孢桿菌發(fā)酵復方中草藥飼料添加劑的最佳工藝，通過單因素和響應面相結合的試驗方法對枯草芽孢桿菌發(fā)酵復方中草藥生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化。選用枯草芽孢桿菌對復方中草藥進行發(fā)酵，以復方中草藥多糖含量為檢測指標，在接菌量、含水量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度4個單因素的基礎上，選擇對發(fā)酵效果影響較大的關鍵因素進行響應面試驗來進一步優(yōu)化。結果表明∶4個單因素中，含水量、接菌量和發(fā)酵時間對發(fā)酵效果影響較大，為關鍵因素，經(jīng)響應面法進一步優(yōu)化后得出最佳條件為含水量為51.50%，接種量為3.60%，發(fā)酵時間為2.7 d，此條件下測得復方中草藥多糖含量平均值為19.59%，與響應面預測值19.78%接近，相較于未發(fā)酵復方中草藥中12.70%的復方中草藥多糖，發(fā)酵后復方中草藥多糖含量提高了55.75%。

飼料添加劑；復方中草藥；發(fā)酵；工藝優(yōu)化

中草藥早已以添加劑的形式應用于畜牧生產(chǎn)中，但其炮制過程仍以熬制為主，這極大程度限制了其推廣應用。中草藥經(jīng)發(fā)酵后其有效成分得到極大程度的釋放，藥效也達到最佳狀態(tài)（李洪龍等，2007）。蒼術、白術、黃柏、板藍根、山楂、甘草等中草藥均能不同程度提高動物機體的免疫力，且無毒副作用，也不存在殘留問題（張鵬，2013）。本試驗以上述幾種中草藥為配伍，用枯草芽孢桿菌對其進行發(fā)酵，使其有效成分得到最大程度的釋放，為其在飼料中的應用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料中草藥:復方中草藥中蒼術、白術、黃柏、板藍根、甘草、山楂等均購自哈爾濱三棵樹中藥材市場，65℃烘干，粉碎后過40目篩，備用。

供試菌種:枯草芽孢桿菌，購于智薈生物科技股份有限公司。

試驗試劑:LB培養(yǎng)基、葡萄糖、乙醇、濃鹽酸、蒽酮、濃硫酸等試劑均為分析純，購于哈爾濱市德美實驗儀器經(jīng)銷有限公司；酶聯(lián)免疫試劑盒:免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG），購于R＆D公司；生化指標:總蛋白（TP）、總膽固醇（CHOL）、生長激素（GH），均由黑龍江電力醫(yī)院檢測。

試驗儀器設備:制冰機（FM100，GRANT）、高速離心機（Allegra 64R）、美國BACKMAN全自動生化分析儀等均由東北農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)實驗室提供。

1.2試驗方法

1.2.1中草藥發(fā)酵前的預處理將中草藥于65℃烘箱中烘干，粉碎后過40目篩，于紫外燈下滅菌，放置到超凈工作臺中備用。

1.2.2 LB培養(yǎng)基的配制本試驗采用液體LB培養(yǎng)基。配制1 L培養(yǎng)基，需要在950 mL去離子水中加入10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g氯化鈉，攪拌直至溶質(zhì)完全溶解，之后用5 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至7.0。用去離子水定容至1 L，然后121℃高壓蒸汽滅菌20 min，放置到超凈工作臺中備用。

1.2.3枯草芽孢桿菌菌種活化在超凈工作臺中，用無菌水將枯草芽孢桿菌菌粉充分溶解，然后用移液槍準確吸取1 mL該菌溶液加入到裝有99 mL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻封口，于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，連續(xù)培養(yǎng)兩代，之后采用平板計數(shù)法檢測枯草芽孢桿菌的數(shù)量，當達到109個/mL時，即視為達標。最后用接種環(huán)轉(zhuǎn)接到裝有100 mL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶中，封口密封，于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，備用。

1.2.4接種發(fā)酵準確稱取粉碎烘干后的中草藥粉末18份于250 mL三角瓶中，每份22.5 g，將適量無菌水加入到事先活化好的菌液中，搖勻，取出超凈工作臺中的中草藥（發(fā)酵培養(yǎng)基），加入菌液，邊加邊攪拌。上述操作過程都在無菌環(huán)境中進行，并盡快完成。將接種后的中草藥于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵適當天數(shù)。

1.2.5復方中草藥發(fā)酵工藝單因素試驗設計本試驗選取接菌量、含水量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度為單因素進行試驗，將活化好的枯草芽孢桿菌接種到復方中草藥中進行發(fā)酵，以復方中草藥多糖含量為指標（蘭時樂等，2010），試驗因素和水平見表1。

1.2.6響應面優(yōu)化發(fā)酵工藝

1.2.6.1對發(fā)酵效果影響較大因素的篩選利用SPSS 20.0對單因素試驗數(shù)據(jù)進行分析，比較接菌量、含水量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度4個因素之間的差異，篩選出對發(fā)酵效果影響較大的因素。

表1試驗因素和水平

1.2.6.2響應面對發(fā)酵條件的優(yōu)化利用Design Exepert.V.8.0.6.根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，采用響應面分析，建立復方中草藥多糖含量與各關鍵因素的數(shù)學模型，來計算分析復方中草藥的最佳發(fā)酵條件，從而確定對發(fā)酵效果影響較大因素的最佳水平組合。

1.2.6.3模型驗證試驗以優(yōu)化后的最佳水平組合進行5次重復試驗，對該模型的預測值進行驗證，檢驗該模型的預測結果是否準確，通過對試驗結果與模型預測結果的比較，進行可靠性分析，最終確定最優(yōu)發(fā)酵條件組合。

1.3復方中草藥多糖含量測定

1.3.1葡萄糖標準曲線的繪制準確稱取105℃烘干至恒重的葡萄糖樣品10 mg于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。精確量取該溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，分別置于干凈的具塞試管中，加蒸餾水至1 mL，然后迅速加入4 mL新配制的蒽酮-濃硫酸溶液（準確稱取0.1 g蒽酮，溶于100 mL 80%的濃硫酸），搖勻后于沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫。以未加葡萄糖樣品的溶液為參比，在625 nm處檢測其吸光度。根據(jù)所測結果繪制出葡萄糖標準曲線得到回歸方程:y=83.94x+0.012，R2=0.9987。

1.3.2樣品液的制備與測定準確稱取烘干至恒重的復方中草藥樣品0.5 g于150 mL三角瓶中，加入80%乙醇45 mL，靜置30 min后超聲提取30 min，于100 mL容量瓶中過濾，棄上清液，重復上述操作一次，蒸干濾渣后加入2%鹽酸45 mL，沸水浴提取1 h，充分放冷，于100 mL容量瓶中濾過，重復操作一次，合并濾液后用2%鹽酸定容至刻度，混勻，取1 mL于25 mL容量瓶中，用2%鹽酸定容至刻度。取上述制備好的溶液1 mL于10 mL干燥潔凈的試管中，加入新配制的蒽酮-濃硫酸溶液4 mL，混勻，沸水浴加熱10 min，充分放冷，在625 nm處測量其吸光度。樣品經(jīng)紫外分光光度計測定后，以標準曲線為準，計算得出相應的多糖含量，并以如下

式中:W為發(fā)酵復方中草藥多糖含量；C為標準曲線中相對應的糖的質(zhì)量分數(shù)（mg/L）；V為發(fā)酵復方中草藥試樣稀釋的總體積，L；M為發(fā)酵復方中草藥樣品的質(zhì)量，g。

2　結果與分析

2.1復方中草藥發(fā)酵工藝單因素試驗

2.1.1含水量對發(fā)酵復方中草藥多糖含量的影響由圖1可見，當含水量在30%～80%時，復方中草藥多糖含量呈先上升后降低的趨勢，含水量在50%時，復方中草藥多糖含量達到最大值，因此，選擇含水量50%對其他因素進行篩選。公式計算出多糖得率:

圖1含水量對發(fā)酵后多糖含量的影響

2.1.2接菌量對發(fā)酵后復方中草藥多糖含量的影響由圖2可見，當接菌量在2%～12%時，復方中草藥多糖含量呈先上升后降低的趨勢，接菌量在4%時，復方中草藥多糖含量達到最大值，因此，選擇接菌量4%，含水量50%對其他因素進行篩選。

圖2接菌量對發(fā)酵后多糖含量的影響

2.1.3發(fā)酵時間對發(fā)酵后復方中草藥多糖含量的影響由圖3可見，當發(fā)酵時間為1～6 d時，復方中草藥多糖含量呈先上升后降低的趨勢，發(fā)酵時間為3 d時，復方中草藥多糖含量達到最大值，因此，選擇發(fā)酵時間3 d，接菌量4%，含水量50%對發(fā)酵溫度進行篩選。

圖3發(fā)酵時間對發(fā)酵后多糖含量的影響

2.1.4發(fā)酵溫度對發(fā)酵后復方中草藥多糖含量的影響由圖4可見，當發(fā)酵溫度為29～39℃時，復方中草藥多糖含量呈先上升后降低的趨勢，發(fā)酵溫度為31℃時，復方中草藥多糖含量達到最大值，因此，最佳發(fā)酵溫度為31℃。

圖4發(fā)酵溫度對發(fā)酵后多糖含量的影響

2.2利用響應面法優(yōu)化復方中草藥發(fā)酵工藝

2.2.1篩選對發(fā)酵效果影響較大的因素統(tǒng)計4個因素的單因素試驗數(shù)據(jù)，用SPSS 20.0軟件對其結果進行方差分析，并比較4個因素之間的差異，結果見表2。通過對4個因素F值的比較可知，4個因素對發(fā)酵復方中草藥多糖含量的影響強弱依次為:含水量、發(fā)酵時間、接菌量、發(fā)酵溫度，因此選擇對結果影響較大的含水量、發(fā)酵時間、接菌量3個因素進行響應面試驗。

表2單因素試驗結果方差分析

2.2.2響應面優(yōu)化復方中草藥發(fā)酵工藝根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，選擇含水量（A）、發(fā)酵時間（B）、接菌量（C）進行三因素三水平的響應面試驗，以復方中草藥多糖得率（Y）為響應值進行分析，結果如表3所示。

通過Design Expert.V.8.0.6.統(tǒng)計軟件，Box-Behnken中心組合設計，試驗設計及結果見表4。其中2、6、12、15、16組的含水量、發(fā)酵時間、接菌量分別為50%、3 d、4%，是中心試驗組，其他試驗組為析因試驗組。

表3響應面因素水平及設計

表4 Box-Behnken試驗設計及復方中草藥多糖測定結果

其他發(fā)酵條件:發(fā)酵溫度37℃。以復方中草藥多糖含量為響應值，每個發(fā)酵試驗重復3次。

2.2.3模型的建立及顯著性檢驗對Box-Behnken試驗結果進行方差分析，結果見表5。同時對模型進行可信度分析，結果見表6。

表5回歸方程統(tǒng)計分析

用F值檢驗三元二次回歸方程各部分對響應值（Y）的影響，由表5可知，該模型的回歸項中P值＜0.0001，說明該模型高度顯著（P＜0.0001）。失擬項P值為0.1868＞0.05，差異不顯著（P＞0.05），說明該模型預測結果與實際結果較擬合。R2（回歸模型決定系數(shù)）=0.9545，說明該模型能夠解釋發(fā)酵復方中草藥多糖含量的95.45%，說明該模型比較可靠，能夠?qū)Πl(fā)酵復方中草藥多糖含量進行預測。由表5可知，含水量的二次項A2對模型影響高度顯著（P＜0.0001），發(fā)酵時間的二次項B2、接菌量的二次項C2對模型影響顯著（P＜0.05），其他系數(shù)（含水量A、發(fā)酵時間B、接菌量C、AB、AC、BC）影響不顯著（P＞0.05）。

對試驗結果進行二次線性回歸擬合，如表6所示。

表6方程回歸系數(shù)估計

根據(jù)表6分析，得到三元二次回歸方程:

Y=19.77+0.10A-0.094B-0.14C-5.00E-03AC-0.018BC-1.89A2-0.5B2-0.72C2

2.2.4各因素最佳水平分析對三元二次回歸方程模型進行最優(yōu)化分析，得到各因素的最佳水平，如表7所示。

由表7可知，當含水量為51.5%，發(fā)酵時間為2.7 d，接菌量為3.6%時預測復方中草藥多糖含量最大值為19.78%，與未發(fā)酵復方中草藥多糖含量12.70%相比，提高55.75%。

表7各因素的最佳水平分析

2.2.5 Box-Behnken響應面及等高線圖結合三元二次回歸方程，運用Design Exepert.V.8.0.6.軟件，繪制兩兩因素的響應曲面圖及等高線圖，從中可以直觀地看出兩兩因素的交互作用對發(fā)酵復方中草藥多糖含量的影響，如圖1、2、3所示。

圖1含水量和發(fā)酵時間相互作用對復方中草藥多糖含量影響的響應面和等高線圖

圖1、2、3可以直觀地反應含水量、發(fā)酵時間和接菌量三因素及其相互作用對復方中草藥多糖含量的影響。兩兩因素之間交互作用的強弱是由等高線的形狀來反映的，橢圓形表示交互作用強，圓形表示交互作用弱（武洪志等，2016）。由圖1和圖2可以看出，響應面的坡度陡峭、等高線密集，表明含水量和發(fā)酵時間的交互作用及含水量與接菌量的交互作用對復方中草藥多糖含量影響較強；由圖3可知，發(fā)酵時間和接菌量的交互作用對復方中草藥多糖含量影響較弱。

圖2含水量和接菌量相互作用對復方中草藥多糖含量影響的響應面和等高線圖

圖3發(fā)酵時間和接菌量相互作用對復方中草藥多糖含量影響的響應面和等高線圖

2.2.6模型驗證試驗在含水量51.5%，發(fā)酵時間為2.7 d，接菌量為3.6%，發(fā)酵溫度為37℃的發(fā)酵條件下，分別進行5次驗證試驗。實測發(fā)酵復方中草藥多糖平均值為19.59%，與預測值19.78%接近，進一步說明該數(shù)學模型能夠較好地預測實際發(fā)酵情況。與未發(fā)酵復方中草藥相比，多糖含量增加54.25%。

3　討論

3.1枯草芽孢桿菌發(fā)酵復方中草藥工藝優(yōu)化目前，發(fā)酵是提高中草藥多糖提取率最重要的方法之一，發(fā)酵過程中最關鍵的是對發(fā)酵條件的優(yōu)化，最常用的分析方法有單因素試驗、正交試驗和響應面試驗（Bandaru等，2006）。單因素試驗是在假設各個因素之間沒有交互作用的前提下，研究各個因素對試驗結果的影響，因此分析結果比較片面，而正交試驗與單因素試驗相比能夠分析部分因素之間的線性關系，但其試驗結果只能是試驗中某種組合，不會超越試驗所選取水平范圍，倘若因素過多，工作量會非常大。響應面分析方法具有試驗次數(shù)少、周期短、回歸方程精度高、能同時研究各因素間交互作用的特點，單因素試驗和響應面試驗結合后，單因素試驗結果可以作為響應面設計因素和水平的依據(jù)，響應面可以彌補單因素試驗的不足。

3.2單因素試驗結果本次試驗選擇了含水量、接菌量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度4個單因素，測定其對發(fā)酵復方中草藥多糖含量的影響。結果表明，接菌量是發(fā)酵過程中最重要的影響因素，不同水平的接菌量對發(fā)酵效果有不同的影響。朱秀清等（2012）在微生物發(fā)酵高溫豆粕的菌種篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究中發(fā)現(xiàn)，高溫豆粕的水解度隨接種量的增加呈先上升后下降的趨勢，與本試驗中隨著接菌量的增加多糖含量也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢一致，因此，適宜的接菌量是保證發(fā)酵效果的前提；含水量是發(fā)酵過程中的重要參數(shù)，含水量的高低直接影響發(fā)酵的品質(zhì)，王鵬等（2006）研究含水量對狗尾草發(fā)酵品質(zhì)影響的結果表明，在適宜的含水量條件下，各處理組的發(fā)酵品質(zhì)均為優(yōu)或良，因此，適宜的含水量是保證發(fā)酵效果的必要條件。發(fā)酵時間是發(fā)酵工藝中不可缺少的因素，由微生物生長曲線可知，其最佳生長時期是對數(shù)期和穩(wěn)定期，因此，適宜的發(fā)酵時間是發(fā)酵效果的重要保障。

3.3響應面優(yōu)化發(fā)酵工藝響應面法本質(zhì)上是一種統(tǒng)計方法，由于單因素中選擇了四個對發(fā)酵效果有影響的因素進行試驗，所以需要先做一個篩選試驗，去掉對發(fā)酵效果影響不大的因素，本試驗中發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果影響最小，因此剔除發(fā)酵溫度因素。之后要確定當前發(fā)酵條件水平是否接近響應面的最優(yōu)位置，當遠離時，采用響應面一階逼近；接近時，獲得對響應面在最優(yōu)值附近某個小范圍內(nèi)的一個精確逼近并識別出最優(yōu)發(fā)酵條件，最后采用二階設計，即Box-Behnken中心組合設計確定最優(yōu)點，從而確定最優(yōu)發(fā)酵條件。本試驗選取含水量、發(fā)酵時間和接菌量三個因素建立響應面模型，通過模型回歸分析和可信度分析確定本試驗所得模型合理，能夠?qū)ψ罴寻l(fā)酵條件進行預測，并求數(shù)學模型的一階偏導得到優(yōu)化的發(fā)酵條件:含水量為51.5%，發(fā)酵時間為2.7 d，接菌量為3.6%。在此條件下，模型預測發(fā)酵復方中草藥多糖含量最大值為19.78%，通過試驗驗證測得實際值為19.59%，兩個結果相差不大，進一步說明本試驗模型有效。武洪志等（2016）在黑曲霉發(fā)酵茯苓工藝優(yōu)化的研究中，用單因素加響應面的試驗設計，對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，最終測得茯苓多糖含量和模型預測值相差不大，與本試驗結果一致。

4　結論

利用單因素試驗和三因素三水平響應面試驗，確定枯草芽孢桿菌發(fā)酵復方中草藥（蒼術、白術、黃柏、板藍根、甘草和山楂）的最佳發(fā)酵工藝為含水量51.5%，發(fā)酵時間2.7 d，接菌量3.6%。此工藝下測得復方中草藥多糖含量為19.59%，與響應面預測值19.78%接近，相較于未發(fā)酵復方中草藥多糖含量12.70%提高了55.75%。

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DOI∶10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20162007

The aim of this experiment was to study the optimum process of compound Chinese herbal medicine fermented by Bacillus subtilis.The compound Chinese herbal medicine process fermented by Bacillus subtilis was optimized through test method combining single factor and response surface.Using Bacillus subtilis fermented compound Chinese herbal medicine，and selected key factors which had greater impact on ferment from inoculation quantity，water content，fermentation time and fermentation temperature and for further optimization by response surface，with compound Chinese herbal medicine polysaccharide content as detection index.The results showed that water content，inoculation and fermentation time were the key factors in the four single factors，after further optimized by response surface the water content was 51.50%，inoculum was 3.60%，fermentation time was 2.7 days，and in this optimized condition the average value compound Chinese herbal medicine polysaccharide content was 19.59%，closed to predicted value 19.78%，and increased by 55.75%，compared with the compound Chinese herbal medicine polysaccharide content 12.70%in unfermented compound Chinese herbal medicine.

feed additive；compound Chinese herbal medicine；fermentation；process optimization

S816.3

A

1004-3314（2016）20-0026-06

國家科技支撐計劃（2014BAD13B03-1）