• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    ELISA法和RT-PCR法在麻疹病毒檢測中的應(yīng)用比較分析

    2016-12-10 03:01:54褚文達(dá)
    標(biāo)記免疫分析與臨床 2016年11期
    關(guān)鍵詞:麻疹病毒出疹麻疹

    褚文達(dá)

    (上海市寶山區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科,上海201901)

    ELISA法和RT-PCR法在麻疹病毒檢測中的應(yīng)用比較分析

    褚文達(dá)

    (上海市寶山區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科,上海201901)

    目的 探討酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative realtime PCR,RT-PCR)對(duì)疑似麻疹病例的麻疹病毒的檢測,為疾病的盡早確診及治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 以上海市寶山區(qū)2014年4月至2015年12月的250例疑似麻疹病例為研究對(duì)象,采集其血清標(biāo)本和咽拭子標(biāo)本,分別應(yīng)用ELISA法檢測患者血清中的麻疹特異性的免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)抗體和RT-PCR法檢測咽拭子中麻疹病毒的核酸。結(jié)果 250例疑似麻疹病例,排除風(fēng)疹病毒陽性的34例病例,其中麻疹病毒(measles virus,MV)IgM抗體呈陽性的有80例,陽性率為37.04%;MV RT-PCR呈陽性的有128例,陽性率為59.26%。RT-PCR的檢測陽性率顯著高于IgM檢測(χ2=41.14,P<0.001)。結(jié)論 RT-PCR法可快速診斷麻疹病毒的病原學(xué),且對(duì)出疹初期麻疹I(lǐng)gM呈陰性的病例可進(jìn)一步確診,是一種有效可靠的方法。

    麻疹病毒; 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn); 實(shí)時(shí)熒光定量PCR; 血清; 核酸

    麻疹病毒(measles virus,MV)感染臨床上可引起發(fā)熱及出疹為特征的急性病毒性呼吸道傳染病,其發(fā)病率之高,傳染性之強(qiáng),已屬于我國計(jì)劃免疫的病毒之一。對(duì)麻疹進(jìn)行早期診斷,并采取一定的預(yù)防措施,能有效減少麻疹的暴發(fā)。但由于風(fēng)疹病毒(rubella virus,RV)與麻疹病毒的臨床癥狀相似,常易引起混淆,因此區(qū)分二者需要進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)室診斷。目前實(shí)驗(yàn)室對(duì)麻疹病毒的診斷主要有血清學(xué)方面的診斷和病原學(xué)方面的診斷[1-3]。在麻疹的防治工作中,有研究[4]表明選擇合適的抗體能顯著提高檢測的陽性率。IgG抗體由于檢測步驟復(fù)雜,人為誤差較大,并且需要雙份血清,采血時(shí)間引起誤差,導(dǎo)致檢測陽性率較低,尤其在麻疹早期診斷中,與IgG相比,特異檢測IgM抗體更有效

    幫助麻疹的確診。目前我國建立的麻疹實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò),是利用ELISA對(duì)患者血清中的麻疹特異性的IgM抗體進(jìn)行檢測[5]。RT-PCR是一項(xiàng)于近年迅速發(fā)展的高特異性、高靈敏度的對(duì)核酸進(jìn)行快速檢測的技術(shù),其優(yōu)點(diǎn)是普通定量PCR無法達(dá)到的,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于病毒等各種病原微生物核酸的快速檢測[6]。本文以寶山區(qū) 2014年 4月至2015年 12月的疑似麻疹病例為研究對(duì)象,分別應(yīng)用ELISA法檢測患者血清中的麻疹特異性的IgM抗體和RT-PCR法檢測麻疹病毒的核酸,并進(jìn)一步探討兩種檢測方法的檢測效果。

    材料和方法

    1 一般資料

    本組250份標(biāo)本來源于寶山區(qū)2014年4月至2015年12月的疑似麻疹病例,其中男160例,女90例,平均年齡10.8±3.3歲。出疹后14天內(nèi)進(jìn)行血標(biāo)本采集,用于ELISA法檢測患者血清中的麻疹特異性的IgM抗體;出疹后5天內(nèi)進(jìn)行咽拭子標(biāo)本采集,用于RT-PCR法檢測麻疹病毒核酸,同時(shí)利用兩種方法檢測標(biāo)本中的風(fēng)疹病毒,以排除風(fēng)疹病毒的干擾。

    2 儀器與試劑

    Bio-Tek(ELX-808)酶標(biāo)儀(貨號(hào):196682);ABI 7500熒光定量PCR儀;麻疹病毒IgM抗體檢測試劑盒購于珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司(產(chǎn)品編號(hào):YZB/國6817-2012);風(fēng)疹/麻疹病毒 RNA檢測試劑盒(熒光PCR法)購于江蘇碩士生物科技有限公司。

    3 方法

    3.1 ELISA法檢測血清IgM抗體 ①血清標(biāo)本處理:無菌注射器抽取患者靜脈血,4℃離心,2 000 r/min,10 min,取血清。②ELISA法檢測:嚴(yán)格按照麻疹病毒IgM抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作,結(jié)束后以空白調(diào)零,用酶標(biāo)儀讀出450 nm處的吸光度值,或者通過(A450nm-A630nm)計(jì)算吸光度值,通過該吸光度值判定檢測結(jié)果。

    3.2 RT-PCR檢測麻疹病毒核酸 ①咽拭子的采集:無菌棉簽蘸取患者咽部分泌物,避免觸及口腔黏膜、舌和唾液。加入至3~5 mL病毒標(biāo)本保存液中,在靠近頂端處折斷棉簽,后按照Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit(貨號(hào):52904)提取試劑盒提取RNA,用于后續(xù)擴(kuò)增。②RT-PCR法檢測:嚴(yán)格按照麻疹病毒RNA檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作,反應(yīng)體系配置完成后于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件:逆轉(zhuǎn)錄:50℃,30 min,1個(gè)循環(huán);預(yù)變性:95℃,5 min,1個(gè)循環(huán);變性、退火、延伸:95℃,10 s,55℃,共45個(gè)循環(huán);在55℃時(shí)收集熒光信號(hào),檢測通道為:FAM,VIC,ROX(注:PCR儀設(shè)置時(shí)不選ROX校正,淬滅基團(tuán)選None)。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分?jǐn)?shù))的形式表示,配對(duì)資料采用配對(duì)組χ2檢驗(yàn)。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 不同樣本ELISA和RT-PCR法檢測結(jié)果

    共收集250例疑似麻疹病例的血液標(biāo)本和咽拭子標(biāo)本,排除兩種方法檢測風(fēng)疹病毒為陽性的34例病例,從而排除風(fēng)疹干擾因素。剩余的216份血清標(biāo)本中MV IgM抗體呈陽性的有80例,陽性率為37.04%,其中有四份可能為假陽性;216份咽拭子標(biāo)本中 MV RT-PCR呈陽性的有128例,陽性率為59.26%。兩方法檢驗(yàn)結(jié)果具有顯著性差異,RT-PCR的檢測陽性率較高(χ2=41.14,P<0.001),見表1。

    表1 不同樣本ELISA和RT-PCR法檢測結(jié)果比較

    2 檢測時(shí)間分析

    由上述MV IgM檢測結(jié)果呈陰性而 RT-PCR檢測結(jié)果呈陽性的52份標(biāo)本發(fā)現(xiàn),其中46份標(biāo)本的檢測時(shí)間處于發(fā)病的1~5 d,見表2。

    表2 檢測時(shí)間比較

    討 論

    麻疹病毒樣本一般通過血液或鼻咽分泌物來采集,早期研究表明,在麻疹前驅(qū)期或者患者機(jī)體出現(xiàn)皮疹第1天,病人血液或者呼吸道分泌物易分離出麻疹病毒[7]。

    對(duì)上海市寶山區(qū)2014年4月至2015年12月250份麻疹疑似病例,在發(fā)病2周內(nèi)采集靜脈血或咽拭子,分別采用ELISA法檢測血清樣本中IgM抗體和采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測咽拭子樣本中麻疹病毒核酸。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ELISA法檢測麻疹病毒陽性率顯著低于RT-PCR法對(duì)麻疹病毒核酸的檢測。通過RT-PCR法檢測為陽性結(jié)果的128例患者中,有52例患者麻疹病毒IgM抗體的檢測結(jié)果為陰性,其原因?yàn)榛颊咴诟腥韭檎畈《局?,麻疹I(lǐng)gM抗體在發(fā)病早期較少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生,并且抗體產(chǎn)生帶有個(gè)體差異性。有文獻(xiàn)報(bào)道,出疹3d內(nèi),通過麻疹I(lǐng)gM抗體來檢測麻疹病毒可能出現(xiàn)的假陽性結(jié)果高達(dá)30%[8]。因此,在患者發(fā)病早期,通過血清樣本檢測麻疹I(lǐng)gM抗體來進(jìn)行確診并不十分可靠,可能會(huì)出現(xiàn)漏檢[9]。若臨床上仍采用麻疹I(lǐng)gM抗體進(jìn)行確診,則應(yīng)在出疹之后4d到28d再次進(jìn)行麻疹I(lǐng)gM抗體檢測,抗體檢測的時(shí)間跨度一般較長[10]。所以,ELISA法對(duì)麻疹確診具有局限性,不僅早期檢測結(jié)果不理想,而且耗時(shí)長,患者對(duì)抽血有排斥感,另外,病毒血癥可能會(huì)在患者出疹前7d出現(xiàn),出疹1~2 d內(nèi),中和抗體出現(xiàn)在血清中,血循環(huán)中病毒可能消失,因此出疹可能是由于體內(nèi)出現(xiàn)抗體-病毒復(fù)合物這種炎癥物質(zhì)[11],所以醫(yī)生在實(shí)際操作中需把握好患者就診和采血時(shí)間等。

    采用RT-PCR法檢測麻疹病毒核酸來對(duì)患者進(jìn)行確診,不僅方便易行,檢測的特異性和靈敏度均高于ELISA檢測。RT-PCR法能夠在發(fā)熱僅1d的小兒樣本中檢測出麻疹病毒[12],可用于麻疹病毒核酸早期的快速診斷及篩查,如果病例為陽性則不需要再檢測IgM抗體即可確診,而ELISA法可作為RT-PCR法的有力補(bǔ)充。另外對(duì)于一些患者的血清IgM抗體呈陰性可進(jìn)一步通過RT-PCR進(jìn)行檢測,達(dá)到彌補(bǔ)漏檢的目的[13-14]。雖然RT-PCR能提高特異性檢測,但是如果模板序列中有堿基發(fā)生變異,則RTPCR過程中,探針就不能有效結(jié)合模板,從而導(dǎo)致假陽性。因此,對(duì)某些基因變異發(fā)生率較高的微生物,如病毒等,設(shè)計(jì)引物的難度與真核生物相比大幅增加。另外,本研究的樣品量較少,研究結(jié)果不夠全面,仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。

    [1]龔甜,熊英,張艷妮,等.江西省2013年疑似麻疹病例病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測結(jié)果分析.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2015,25(10):1615-1617.

    [2]郭鵬娟,甘標(biāo),潘捷云,等.2007-2014年廣州市海珠區(qū)麻疹風(fēng)疹疑似病例血清學(xué)檢測結(jié)果分析.熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2015,15(4):555-557.

    [3]許松濤,張燕,王慧玲,等.中國2012年麻疹/風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)運(yùn)轉(zhuǎn)情況分析.中國疫苗和免疫,2014,20(1):62-66.

    [4]陳鳳仙.健康人群麻疹抗體水平及麻疹疑似病例IgM抗體檢測.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2016,30(1):91-94

    [5]李海燕.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)與中和抗體試驗(yàn)檢測麻疹抗體比較研究.今日健康,2015,14(7):6-7.

    [6]趙越,李壯,費(fèi)飛.實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測咽拭子中麻疹病毒核酸.中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生,2015,2(1):44-45.

    [7]單竹周,潘雪雪,王芳,等.黔東南州2011年-2014年麻疹、風(fēng)疹疑似病例IgM抗體檢測結(jié)果分析.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2015,25(23):4109-4111.

    [8]劉勇.麻疹疑似病例進(jìn)行IgM抗體檢測的結(jié)果分析.現(xiàn)代婦女:醫(yī)學(xué)前沿,2014,10(8):201-201.

    [9]陳玲霞,姬莉莉,孫建飛.麻疹實(shí)驗(yàn)室診斷中ELISA法和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法的比較.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2016,23(1):106-108.

    [10]葉平.上海市浦東新區(qū)2012年麻疹疑似病例IgM抗體檢測結(jié)果分析.中國初級(jí)衛(wèi)生保健,2013,27(12):87-89.

    [11]趙辨.臨床皮膚病學(xué).第3版.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2001:319-322.

    [12]高丹,張國斌,賈妮娜.實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法快速檢測麻疹病毒核酸.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2015,25(11):1815-1816.

    [13]袁海濤,遲金蓮,李忠延,等.麻疹病毒PCR檢驗(yàn)的措施和效果分析.臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志,2015,2(7):1268-1268.

    [14]張爾夫,劉錄春,許航.ELISA法和實(shí)時(shí)熒光PCR法在麻疹檢測上的應(yīng)用比較.中國冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2015,32(3):334-335.

    (潘子昂編輯)

    Comparison of Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)and Real-time PCR Assay(RT-PCR)in the Detection of Measles Virus

    CHU Wen-da
    (Center for Disease Control and Preventionof Baoshan District Shanghai,Shanghai 201901,China)

    Objective To explore the measles virus of suspected measles cases through ELISA and the RT-PCR to provide scientific experimental basis for taking immediate measures to control outbreak of measles.Methods Venous blood and throat swab specimens were collected from 134 suspected measles cases in Baoshan,Shanghai from Apr.2014 to Dec.2015.Serum measles IgM was detected by ELISA.Measles viral RNA from throat swab specimens was detected by RT-PCR.Results From 250 cases of suspected measles,80 measles virus IgM antibody detected by ELISA method was positive with the positive rate of 37.04%,while 128 measles virus nucleic acid was positive with the positive rate of 59.26%.The positive rate of RT-PCR was significantly higher than that of IgM(χ2=20.83,P<0.001).Conclusion RT-PCR is a rapid method for diagnosis of measles virus.It can further confirm the initial IgM negative measles rash cases,which is effective and reliable.

    Measles virus; Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA); Real-time fluorescent PCR assay(RT-PCR); Serum; Nucleic acid

    10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.11.032

    2016-06-20;

    2016-08-03

    猜你喜歡
    麻疹病毒出疹麻疹
    2013-2016 年江西省麻疹病毒分離株H基因特征分析
    觀疹識(shí)病
    麻疹病毒流行株血凝素基因的變異及抗原性變異研究
    Diagnosis and Treatment of Rash Fever with Anxiety
    CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染人肺泡上皮細(xì)胞中的作用①
    小兒常見出疹性疾病的診治
    患過出疹性疾病的人是否不需要接種麻疹疫苗?
    Trouble in Disneyland
    干擾素α-1b治療成人麻疹療效初步觀察
    麻疹患者的臨床觀察及護(hù)理
    av在线观看视频网站免费| av黄色大香蕉| 久久亚洲精品不卡| 亚洲成人精品中文字幕电影| av女优亚洲男人天堂| eeuss影院久久| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 干丝袜人妻中文字幕| 两个人视频免费观看高清| 插逼视频在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 天天躁日日操中文字幕| 久久中文看片网| 日韩av不卡免费在线播放| 国产成人一区二区在线| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 精品无人区乱码1区二区| 精品久久国产蜜桃| 亚洲自拍偷在线| av天堂中文字幕网| 国产精品一区二区免费欧美| a级毛色黄片| 俺也久久电影网| 中文字幕熟女人妻在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产精品综合久久久久久久免费| 91在线观看av| 亚洲久久久久久中文字幕| 简卡轻食公司| 久久韩国三级中文字幕| 十八禁网站免费在线| 日韩av不卡免费在线播放| av在线亚洲专区| 内地一区二区视频在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 亚洲av五月六月丁香网| 免费黄网站久久成人精品| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久精品国产亚洲av天美| 毛片女人毛片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 变态另类丝袜制服| 亚洲自拍偷在线| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久亚洲国产成人精品v| 乱码一卡2卡4卡精品| 久久精品国产亚洲网站| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产老妇女一区| 久久亚洲国产成人精品v| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 麻豆成人午夜福利视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日韩成人av中文字幕在线观看 | 亚洲欧美清纯卡通| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 99热网站在线观看| 久久国产乱子免费精品| 悠悠久久av| 亚洲国产精品合色在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久草成人影院| 国产中年淑女户外野战色| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲人成网站在线播| 熟女人妻精品中文字幕| 国产成人a∨麻豆精品| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产精品av视频在线免费观看| 日韩一本色道免费dvd| 婷婷精品国产亚洲av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 在线看三级毛片| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲七黄色美女视频| 色哟哟·www| www.色视频.com| 色在线成人网| 亚洲经典国产精华液单| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产在线精品亚洲第一网站| 免费看日本二区| 好男人在线观看高清免费视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美性感艳星| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲成人中文字幕在线播放| 嫩草影视91久久| 日本黄色视频三级网站网址| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日本三级黄在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲av免费高清在线观看| 夜夜爽天天搞| 久久久精品欧美日韩精品| 淫秽高清视频在线观看| 长腿黑丝高跟| 日韩制服骚丝袜av| avwww免费| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品野战在线观看| 联通29元200g的流量卡| 最近最新中文字幕大全电影3| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩 亚洲 欧美在线| 99久国产av精品国产电影| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99热只有精品国产| 在线观看一区二区三区| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲欧美精品自产自拍| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 美女内射精品一级片tv| 观看美女的网站| 狠狠狠狠99中文字幕| 99九九线精品视频在线观看视频| 成年女人永久免费观看视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| eeuss影院久久| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久热精品热| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品人妻偷拍中文字幕| 1000部很黄的大片| 日韩人妻高清精品专区| 1000部很黄的大片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 精品不卡国产一区二区三区| .国产精品久久| 日本成人三级电影网站| 网址你懂的国产日韩在线| 精品福利观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 免费av观看视频| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品一区二区免费欧美| 国产综合懂色| 男女那种视频在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 可以在线观看毛片的网站| 99久久精品一区二区三区| 99久久精品一区二区三区| 国语自产精品视频在线第100页| ponron亚洲| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 免费观看人在逋| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 超碰av人人做人人爽久久| 偷拍熟女少妇极品色| 成人午夜高清在线视频| 午夜亚洲福利在线播放| 俄罗斯特黄特色一大片| 九九热线精品视视频播放| 在线观看美女被高潮喷水网站| 观看美女的网站| 免费搜索国产男女视频| 一本久久中文字幕| 国产亚洲精品久久久com| 成人性生交大片免费视频hd| 久久精品夜色国产| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产精品久久久久久久久免| 精品无人区乱码1区二区| 特大巨黑吊av在线直播| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美一级a爱片免费观看看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| av专区在线播放| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 中文资源天堂在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 十八禁国产超污无遮挡网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 成人欧美大片| 国产免费男女视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 毛片女人毛片| 中文字幕免费在线视频6| 老司机福利观看| 国产精品亚洲美女久久久| 国产成人a区在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 伦精品一区二区三区| 亚洲经典国产精华液单| 永久网站在线| 亚洲自拍偷在线| av免费在线看不卡| 成人特级av手机在线观看| 嫩草影院新地址| 午夜老司机福利剧场| 熟女人妻精品中文字幕| 国产v大片淫在线免费观看| 国产久久久一区二区三区| 国产高清三级在线| 国产在线男女| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 22中文网久久字幕| www日本黄色视频网| 久久久久久伊人网av| 欧美精品国产亚洲| 亚洲最大成人av| 美女内射精品一级片tv| 99久国产av精品国产电影| 免费在线观看成人毛片| 韩国av在线不卡| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩欧美在线乱码| 看十八女毛片水多多多| 亚洲成人久久性| 色噜噜av男人的天堂激情| АⅤ资源中文在线天堂| 综合色av麻豆| av卡一久久| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美丝袜亚洲另类| 欧美另类亚洲清纯唯美| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品国产高清国产av| 小说图片视频综合网站| 国产三级中文精品| 日韩欧美精品v在线| 亚洲综合色惰| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 最近2019中文字幕mv第一页| 午夜福利成人在线免费观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 日韩一区二区视频免费看| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲电影在线观看av| av在线观看视频网站免费| 久久久久久伊人网av| a级毛片免费高清观看在线播放| 嫩草影院入口| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 一个人看视频在线观看www免费| 黄色一级大片看看| 日韩欧美 国产精品| 在线观看一区二区三区| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精华一区二区三区| 老司机福利观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 天天一区二区日本电影三级| 又粗又爽又猛毛片免费看| 香蕉av资源在线| 午夜亚洲福利在线播放| 99riav亚洲国产免费| 老司机午夜福利在线观看视频| 成人一区二区视频在线观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| av天堂在线播放| 深夜精品福利| 国产精品久久视频播放| 秋霞在线观看毛片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美日本视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 五月伊人婷婷丁香| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲av免费高清在线观看| 成年av动漫网址| av在线观看视频网站免费| 国产成人91sexporn| or卡值多少钱| 亚洲精品久久国产高清桃花| 桃色一区二区三区在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 免费看光身美女| 男女啪啪激烈高潮av片| 日韩制服骚丝袜av| 嫩草影院入口| 如何舔出高潮| 成人欧美大片| 亚洲经典国产精华液单| 色在线成人网| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 中文字幕av在线有码专区| 高清午夜精品一区二区三区 | 成人毛片a级毛片在线播放| 在线观看一区二区三区| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产午夜精品论理片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 免费电影在线观看免费观看| 丰满乱子伦码专区| 久久午夜亚洲精品久久| 精品日产1卡2卡| 亚洲无线观看免费| 国产高潮美女av| 亚洲精品色激情综合| 成人午夜高清在线视频| 国产视频内射| 久久人妻av系列| 波野结衣二区三区在线| 五月伊人婷婷丁香| 俄罗斯特黄特色一大片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产av麻豆久久久久久久| 不卡一级毛片| 国产精品免费一区二区三区在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲成人久久爱视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 一区二区三区高清视频在线| 精品久久国产蜜桃| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 国产高清激情床上av| 午夜亚洲福利在线播放| 最新在线观看一区二区三区| 成人美女网站在线观看视频| 在线观看66精品国产| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美日韩乱码在线| 干丝袜人妻中文字幕| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久热精品热| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 又爽又黄a免费视频| 国产探花极品一区二区| 欧美日韩在线观看h| 丰满乱子伦码专区| 99热这里只有是精品在线观看| 人人妻人人看人人澡| 大型黄色视频在线免费观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 禁无遮挡网站| 最近最新中文字幕大全电影3| 中文亚洲av片在线观看爽| 一进一出好大好爽视频| 亚洲欧美清纯卡通| 国内精品久久久久精免费| 国产精品一区二区性色av| 亚洲av免费在线观看| 国产精华一区二区三区| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲成人久久性| 国产一区二区在线av高清观看| 老司机影院成人| 黄色欧美视频在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲av免费在线观看| 中国美女看黄片| 国产乱人偷精品视频| 国产毛片a区久久久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩欧美免费精品| 欧美3d第一页| 亚洲无线观看免费| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲av一区综合| 成人亚洲精品av一区二区| 国产熟女欧美一区二区| www.色视频.com| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 老女人水多毛片| 日本黄色视频三级网站网址| 黑人高潮一二区| 99久国产av精品国产电影| 国产av麻豆久久久久久久| 国内精品美女久久久久久| 亚洲av免费在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 国内精品久久久久精免费| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久精品综合一区二区三区| 在线免费十八禁| 国产色爽女视频免费观看| 国产午夜福利久久久久久| 久久人人爽人人爽人人片va| 在线免费观看不下载黄p国产| 成人永久免费在线观看视频| www日本黄色视频网| 成人午夜高清在线视频| 级片在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 91久久精品国产一区二区三区| 国产日本99.免费观看| 亚洲性久久影院| 最新中文字幕久久久久| 一级毛片我不卡| 亚洲人成网站高清观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日韩精品青青久久久久久| 露出奶头的视频| 成人二区视频| 欧美最新免费一区二区三区| 国产成人91sexporn| 1024手机看黄色片| 中文字幕av在线有码专区| 美女大奶头视频| 美女内射精品一级片tv| 精品久久久久久久久久免费视频| 高清午夜精品一区二区三区 | 精品人妻视频免费看| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲第一电影网av| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美性猛交黑人性爽| 成人亚洲精品av一区二区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产一区二区在线av高清观看| 免费看日本二区| 亚洲成人av在线免费| 黑人高潮一二区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产精品野战在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 狠狠狠狠99中文字幕| 一本精品99久久精品77| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久精品综合一区二区三区| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产一区二区激情短视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 免费av不卡在线播放| 亚洲精品色激情综合| 精品无人区乱码1区二区| 三级经典国产精品| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| videossex国产| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩国内少妇激情av| 国产精品一区二区三区四区久久| 性欧美人与动物交配| 插逼视频在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日韩欧美国产在线观看| 国产三级在线视频| 免费观看的影片在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 一进一出好大好爽视频| 久久精品夜色国产| 久久久久国产网址| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 中国美女看黄片| 麻豆一二三区av精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 尾随美女入室| 一区福利在线观看| 国产单亲对白刺激| 高清午夜精品一区二区三区 | 精品不卡国产一区二区三区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日本黄大片高清| 特级一级黄色大片| 久久久精品大字幕| h日本视频在线播放| 天堂√8在线中文| 中文字幕免费在线视频6| 身体一侧抽搐| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 精品国内亚洲2022精品成人| 日韩精品有码人妻一区| 免费在线观看成人毛片| 亚洲经典国产精华液单| 久久久精品欧美日韩精品| av在线老鸭窝| 看非洲黑人一级黄片| 午夜精品在线福利| 亚洲国产精品合色在线| 国产一区二区在线av高清观看| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲精品在线观看二区| 99久久精品国产国产毛片| 国产精品国产高清国产av| 日本免费a在线| 日韩大尺度精品在线看网址| 婷婷六月久久综合丁香| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 69av精品久久久久久| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产成年人精品一区二区| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲最大成人手机在线| 看十八女毛片水多多多| 中国国产av一级| 日韩一区二区视频免费看| 免费av毛片视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 一进一出抽搐gif免费好疼| 成人无遮挡网站| 亚洲性久久影院| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲av成人精品一区久久| 3wmmmm亚洲av在线观看| 能在线免费观看的黄片| 国产精品久久久久久久电影| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 午夜福利18| 久久精品国产亚洲网站| 免费在线观看影片大全网站| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品福利观看| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 久久精品国产清高在天天线| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩av不卡免费在线播放| 毛片女人毛片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 听说在线观看完整版免费高清| 国产探花在线观看一区二区| 久久亚洲国产成人精品v| 床上黄色一级片| 干丝袜人妻中文字幕| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲四区av| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产午夜精品论理片| 91久久精品国产一区二区三区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 精品久久久久久久久亚洲| 国产69精品久久久久777片| 欧美+亚洲+日韩+国产| 在线免费十八禁| 免费观看在线日韩| 毛片一级片免费看久久久久| 免费看光身美女| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲内射少妇av| 亚洲三级黄色毛片| 久久久久久久久久黄片| 又爽又黄a免费视频| 国产高清激情床上av| 久久久久性生活片| 精品人妻偷拍中文字幕| 日本欧美国产在线视频| 女同久久另类99精品国产91| 免费搜索国产男女视频| 内射极品少妇av片p| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 午夜视频国产福利| 亚洲内射少妇av| 精品久久久噜噜| 亚洲av免费在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 成人二区视频| 日韩欧美精品v在线| 国产视频内射| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 51国产日韩欧美| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美三级亚洲精品| 给我免费播放毛片高清在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 性色avwww在线观看| 久久精品91蜜桃| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 免费观看的影片在线观看| 国产老妇女一区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲成人av在线免费| 中国美女看黄片| 在线天堂最新版资源| 久久国内精品自在自线图片| 不卡一级毛片| 日本欧美国产在线视频| 国产免费一级a男人的天堂| 99在线视频只有这里精品首页| 成人毛片a级毛片在线播放| 能在线免费观看的黄片| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品一二三区在线看| 搡老岳熟女国产| 高清毛片免费看| 久久久久久久久大av| 国产色爽女视频免费观看| 少妇的逼好多水| 成人精品一区二区免费| 欧美性感艳星| 国产毛片a区久久久久| 一区二区三区免费毛片|