• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    ELISA法和RT-PCR法在麻疹病毒檢測中的應(yīng)用比較分析

    2016-12-10 03:01:54褚文達(dá)
    標(biāo)記免疫分析與臨床 2016年11期
    關(guān)鍵詞:麻疹病毒出疹麻疹

    褚文達(dá)

    (上海市寶山區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科,上海201901)

    ELISA法和RT-PCR法在麻疹病毒檢測中的應(yīng)用比較分析

    褚文達(dá)

    (上海市寶山區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科,上海201901)

    目的 探討酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative realtime PCR,RT-PCR)對(duì)疑似麻疹病例的麻疹病毒的檢測,為疾病的盡早確診及治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 以上海市寶山區(qū)2014年4月至2015年12月的250例疑似麻疹病例為研究對(duì)象,采集其血清標(biāo)本和咽拭子標(biāo)本,分別應(yīng)用ELISA法檢測患者血清中的麻疹特異性的免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)抗體和RT-PCR法檢測咽拭子中麻疹病毒的核酸。結(jié)果 250例疑似麻疹病例,排除風(fēng)疹病毒陽性的34例病例,其中麻疹病毒(measles virus,MV)IgM抗體呈陽性的有80例,陽性率為37.04%;MV RT-PCR呈陽性的有128例,陽性率為59.26%。RT-PCR的檢測陽性率顯著高于IgM檢測(χ2=41.14,P<0.001)。結(jié)論 RT-PCR法可快速診斷麻疹病毒的病原學(xué),且對(duì)出疹初期麻疹I(lǐng)gM呈陰性的病例可進(jìn)一步確診,是一種有效可靠的方法。

    麻疹病毒; 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn); 實(shí)時(shí)熒光定量PCR; 血清; 核酸

    麻疹病毒(measles virus,MV)感染臨床上可引起發(fā)熱及出疹為特征的急性病毒性呼吸道傳染病,其發(fā)病率之高,傳染性之強(qiáng),已屬于我國計(jì)劃免疫的病毒之一。對(duì)麻疹進(jìn)行早期診斷,并采取一定的預(yù)防措施,能有效減少麻疹的暴發(fā)。但由于風(fēng)疹病毒(rubella virus,RV)與麻疹病毒的臨床癥狀相似,常易引起混淆,因此區(qū)分二者需要進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)室診斷。目前實(shí)驗(yàn)室對(duì)麻疹病毒的診斷主要有血清學(xué)方面的診斷和病原學(xué)方面的診斷[1-3]。在麻疹的防治工作中,有研究[4]表明選擇合適的抗體能顯著提高檢測的陽性率。IgG抗體由于檢測步驟復(fù)雜,人為誤差較大,并且需要雙份血清,采血時(shí)間引起誤差,導(dǎo)致檢測陽性率較低,尤其在麻疹早期診斷中,與IgG相比,特異檢測IgM抗體更有效

    幫助麻疹的確診。目前我國建立的麻疹實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò),是利用ELISA對(duì)患者血清中的麻疹特異性的IgM抗體進(jìn)行檢測[5]。RT-PCR是一項(xiàng)于近年迅速發(fā)展的高特異性、高靈敏度的對(duì)核酸進(jìn)行快速檢測的技術(shù),其優(yōu)點(diǎn)是普通定量PCR無法達(dá)到的,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于病毒等各種病原微生物核酸的快速檢測[6]。本文以寶山區(qū) 2014年 4月至2015年 12月的疑似麻疹病例為研究對(duì)象,分別應(yīng)用ELISA法檢測患者血清中的麻疹特異性的IgM抗體和RT-PCR法檢測麻疹病毒的核酸,并進(jìn)一步探討兩種檢測方法的檢測效果。

    材料和方法

    1 一般資料

    本組250份標(biāo)本來源于寶山區(qū)2014年4月至2015年12月的疑似麻疹病例,其中男160例,女90例,平均年齡10.8±3.3歲。出疹后14天內(nèi)進(jìn)行血標(biāo)本采集,用于ELISA法檢測患者血清中的麻疹特異性的IgM抗體;出疹后5天內(nèi)進(jìn)行咽拭子標(biāo)本采集,用于RT-PCR法檢測麻疹病毒核酸,同時(shí)利用兩種方法檢測標(biāo)本中的風(fēng)疹病毒,以排除風(fēng)疹病毒的干擾。

    2 儀器與試劑

    Bio-Tek(ELX-808)酶標(biāo)儀(貨號(hào):196682);ABI 7500熒光定量PCR儀;麻疹病毒IgM抗體檢測試劑盒購于珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司(產(chǎn)品編號(hào):YZB/國6817-2012);風(fēng)疹/麻疹病毒 RNA檢測試劑盒(熒光PCR法)購于江蘇碩士生物科技有限公司。

    3 方法

    3.1 ELISA法檢測血清IgM抗體 ①血清標(biāo)本處理:無菌注射器抽取患者靜脈血,4℃離心,2 000 r/min,10 min,取血清。②ELISA法檢測:嚴(yán)格按照麻疹病毒IgM抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作,結(jié)束后以空白調(diào)零,用酶標(biāo)儀讀出450 nm處的吸光度值,或者通過(A450nm-A630nm)計(jì)算吸光度值,通過該吸光度值判定檢測結(jié)果。

    3.2 RT-PCR檢測麻疹病毒核酸 ①咽拭子的采集:無菌棉簽蘸取患者咽部分泌物,避免觸及口腔黏膜、舌和唾液。加入至3~5 mL病毒標(biāo)本保存液中,在靠近頂端處折斷棉簽,后按照Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit(貨號(hào):52904)提取試劑盒提取RNA,用于后續(xù)擴(kuò)增。②RT-PCR法檢測:嚴(yán)格按照麻疹病毒RNA檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作,反應(yīng)體系配置完成后于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件:逆轉(zhuǎn)錄:50℃,30 min,1個(gè)循環(huán);預(yù)變性:95℃,5 min,1個(gè)循環(huán);變性、退火、延伸:95℃,10 s,55℃,共45個(gè)循環(huán);在55℃時(shí)收集熒光信號(hào),檢測通道為:FAM,VIC,ROX(注:PCR儀設(shè)置時(shí)不選ROX校正,淬滅基團(tuán)選None)。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分?jǐn)?shù))的形式表示,配對(duì)資料采用配對(duì)組χ2檢驗(yàn)。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 不同樣本ELISA和RT-PCR法檢測結(jié)果

    共收集250例疑似麻疹病例的血液標(biāo)本和咽拭子標(biāo)本,排除兩種方法檢測風(fēng)疹病毒為陽性的34例病例,從而排除風(fēng)疹干擾因素。剩余的216份血清標(biāo)本中MV IgM抗體呈陽性的有80例,陽性率為37.04%,其中有四份可能為假陽性;216份咽拭子標(biāo)本中 MV RT-PCR呈陽性的有128例,陽性率為59.26%。兩方法檢驗(yàn)結(jié)果具有顯著性差異,RT-PCR的檢測陽性率較高(χ2=41.14,P<0.001),見表1。

    表1 不同樣本ELISA和RT-PCR法檢測結(jié)果比較

    2 檢測時(shí)間分析

    由上述MV IgM檢測結(jié)果呈陰性而 RT-PCR檢測結(jié)果呈陽性的52份標(biāo)本發(fā)現(xiàn),其中46份標(biāo)本的檢測時(shí)間處于發(fā)病的1~5 d,見表2。

    表2 檢測時(shí)間比較

    討 論

    麻疹病毒樣本一般通過血液或鼻咽分泌物來采集,早期研究表明,在麻疹前驅(qū)期或者患者機(jī)體出現(xiàn)皮疹第1天,病人血液或者呼吸道分泌物易分離出麻疹病毒[7]。

    對(duì)上海市寶山區(qū)2014年4月至2015年12月250份麻疹疑似病例,在發(fā)病2周內(nèi)采集靜脈血或咽拭子,分別采用ELISA法檢測血清樣本中IgM抗體和采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測咽拭子樣本中麻疹病毒核酸。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ELISA法檢測麻疹病毒陽性率顯著低于RT-PCR法對(duì)麻疹病毒核酸的檢測。通過RT-PCR法檢測為陽性結(jié)果的128例患者中,有52例患者麻疹病毒IgM抗體的檢測結(jié)果為陰性,其原因?yàn)榛颊咴诟腥韭檎畈《局?,麻疹I(lǐng)gM抗體在發(fā)病早期較少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生,并且抗體產(chǎn)生帶有個(gè)體差異性。有文獻(xiàn)報(bào)道,出疹3d內(nèi),通過麻疹I(lǐng)gM抗體來檢測麻疹病毒可能出現(xiàn)的假陽性結(jié)果高達(dá)30%[8]。因此,在患者發(fā)病早期,通過血清樣本檢測麻疹I(lǐng)gM抗體來進(jìn)行確診并不十分可靠,可能會(huì)出現(xiàn)漏檢[9]。若臨床上仍采用麻疹I(lǐng)gM抗體進(jìn)行確診,則應(yīng)在出疹之后4d到28d再次進(jìn)行麻疹I(lǐng)gM抗體檢測,抗體檢測的時(shí)間跨度一般較長[10]。所以,ELISA法對(duì)麻疹確診具有局限性,不僅早期檢測結(jié)果不理想,而且耗時(shí)長,患者對(duì)抽血有排斥感,另外,病毒血癥可能會(huì)在患者出疹前7d出現(xiàn),出疹1~2 d內(nèi),中和抗體出現(xiàn)在血清中,血循環(huán)中病毒可能消失,因此出疹可能是由于體內(nèi)出現(xiàn)抗體-病毒復(fù)合物這種炎癥物質(zhì)[11],所以醫(yī)生在實(shí)際操作中需把握好患者就診和采血時(shí)間等。

    采用RT-PCR法檢測麻疹病毒核酸來對(duì)患者進(jìn)行確診,不僅方便易行,檢測的特異性和靈敏度均高于ELISA檢測。RT-PCR法能夠在發(fā)熱僅1d的小兒樣本中檢測出麻疹病毒[12],可用于麻疹病毒核酸早期的快速診斷及篩查,如果病例為陽性則不需要再檢測IgM抗體即可確診,而ELISA法可作為RT-PCR法的有力補(bǔ)充。另外對(duì)于一些患者的血清IgM抗體呈陰性可進(jìn)一步通過RT-PCR進(jìn)行檢測,達(dá)到彌補(bǔ)漏檢的目的[13-14]。雖然RT-PCR能提高特異性檢測,但是如果模板序列中有堿基發(fā)生變異,則RTPCR過程中,探針就不能有效結(jié)合模板,從而導(dǎo)致假陽性。因此,對(duì)某些基因變異發(fā)生率較高的微生物,如病毒等,設(shè)計(jì)引物的難度與真核生物相比大幅增加。另外,本研究的樣品量較少,研究結(jié)果不夠全面,仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。

    [1]龔甜,熊英,張艷妮,等.江西省2013年疑似麻疹病例病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測結(jié)果分析.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2015,25(10):1615-1617.

    [2]郭鵬娟,甘標(biāo),潘捷云,等.2007-2014年廣州市海珠區(qū)麻疹風(fēng)疹疑似病例血清學(xué)檢測結(jié)果分析.熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2015,15(4):555-557.

    [3]許松濤,張燕,王慧玲,等.中國2012年麻疹/風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)運(yùn)轉(zhuǎn)情況分析.中國疫苗和免疫,2014,20(1):62-66.

    [4]陳鳳仙.健康人群麻疹抗體水平及麻疹疑似病例IgM抗體檢測.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2016,30(1):91-94

    [5]李海燕.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)與中和抗體試驗(yàn)檢測麻疹抗體比較研究.今日健康,2015,14(7):6-7.

    [6]趙越,李壯,費(fèi)飛.實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測咽拭子中麻疹病毒核酸.中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生,2015,2(1):44-45.

    [7]單竹周,潘雪雪,王芳,等.黔東南州2011年-2014年麻疹、風(fēng)疹疑似病例IgM抗體檢測結(jié)果分析.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2015,25(23):4109-4111.

    [8]劉勇.麻疹疑似病例進(jìn)行IgM抗體檢測的結(jié)果分析.現(xiàn)代婦女:醫(yī)學(xué)前沿,2014,10(8):201-201.

    [9]陳玲霞,姬莉莉,孫建飛.麻疹實(shí)驗(yàn)室診斷中ELISA法和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法的比較.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2016,23(1):106-108.

    [10]葉平.上海市浦東新區(qū)2012年麻疹疑似病例IgM抗體檢測結(jié)果分析.中國初級(jí)衛(wèi)生保健,2013,27(12):87-89.

    [11]趙辨.臨床皮膚病學(xué).第3版.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2001:319-322.

    [12]高丹,張國斌,賈妮娜.實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法快速檢測麻疹病毒核酸.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2015,25(11):1815-1816.

    [13]袁海濤,遲金蓮,李忠延,等.麻疹病毒PCR檢驗(yàn)的措施和效果分析.臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志,2015,2(7):1268-1268.

    [14]張爾夫,劉錄春,許航.ELISA法和實(shí)時(shí)熒光PCR法在麻疹檢測上的應(yīng)用比較.中國冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2015,32(3):334-335.

    (潘子昂編輯)

    Comparison of Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)and Real-time PCR Assay(RT-PCR)in the Detection of Measles Virus

    CHU Wen-da
    (Center for Disease Control and Preventionof Baoshan District Shanghai,Shanghai 201901,China)

    Objective To explore the measles virus of suspected measles cases through ELISA and the RT-PCR to provide scientific experimental basis for taking immediate measures to control outbreak of measles.Methods Venous blood and throat swab specimens were collected from 134 suspected measles cases in Baoshan,Shanghai from Apr.2014 to Dec.2015.Serum measles IgM was detected by ELISA.Measles viral RNA from throat swab specimens was detected by RT-PCR.Results From 250 cases of suspected measles,80 measles virus IgM antibody detected by ELISA method was positive with the positive rate of 37.04%,while 128 measles virus nucleic acid was positive with the positive rate of 59.26%.The positive rate of RT-PCR was significantly higher than that of IgM(χ2=20.83,P<0.001).Conclusion RT-PCR is a rapid method for diagnosis of measles virus.It can further confirm the initial IgM negative measles rash cases,which is effective and reliable.

    Measles virus; Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA); Real-time fluorescent PCR assay(RT-PCR); Serum; Nucleic acid

    10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.11.032

    2016-06-20;

    2016-08-03

    猜你喜歡
    麻疹病毒出疹麻疹
    2013-2016 年江西省麻疹病毒分離株H基因特征分析
    觀疹識(shí)病
    麻疹病毒流行株血凝素基因的變異及抗原性變異研究
    Diagnosis and Treatment of Rash Fever with Anxiety
    CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染人肺泡上皮細(xì)胞中的作用①
    小兒常見出疹性疾病的診治
    患過出疹性疾病的人是否不需要接種麻疹疫苗?
    Trouble in Disneyland
    干擾素α-1b治療成人麻疹療效初步觀察
    麻疹患者的臨床觀察及護(hù)理
    熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 哪里可以看免费的av片| 成人午夜高清在线视频| 两人在一起打扑克的视频| 成人欧美大片| 动漫黄色视频在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美中文日本在线观看视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 男人舔女人的私密视频| 床上黄色一级片| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲专区字幕在线| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 成人亚洲精品av一区二区| 无限看片的www在线观看| 91字幕亚洲| 国产精品一区二区三区四区久久| a在线观看视频网站| 国产单亲对白刺激| 日本熟妇午夜| 亚洲片人在线观看| 国模一区二区三区四区视频 | 又黄又爽又免费观看的视频| 午夜福利18| 亚洲精品美女久久av网站| 日本一二三区视频观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久香蕉激情| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 两个人的视频大全免费| 色综合站精品国产| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 午夜福利18| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 午夜老司机福利片| 国产高清videossex| 成人亚洲精品av一区二区| 成人三级做爰电影| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 精品久久久久久,| 美女大奶头视频| av在线播放免费不卡| 99热只有精品国产| 国产一区二区激情短视频| 国产高清有码在线观看视频 | 黄色视频,在线免费观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 九九热线精品视视频播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久香蕉激情| 天堂影院成人在线观看| 999精品在线视频| 亚洲精品色激情综合| 一级片免费观看大全| 欧美另类亚洲清纯唯美| 中文亚洲av片在线观看爽| 他把我摸到了高潮在线观看| 99riav亚洲国产免费| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 两个人免费观看高清视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 老司机午夜福利在线观看视频| 又黄又粗又硬又大视频| 久久亚洲精品不卡| 18美女黄网站色大片免费观看| svipshipincom国产片| 日韩欧美在线乱码| 人妻久久中文字幕网| 少妇的丰满在线观看| 国产av又大| 久99久视频精品免费| 亚洲国产欧美一区二区综合| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久9热在线精品视频| 首页视频小说图片口味搜索| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产男靠女视频免费网站| 精品国产美女av久久久久小说| 九色成人免费人妻av| 亚洲av美国av| 老汉色av国产亚洲站长工具| 在线免费观看的www视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日韩av在线大香蕉| 免费看日本二区| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲人成网站高清观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 特级一级黄色大片| 久久国产精品影院| 欧美又色又爽又黄视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲黑人精品在线| 国产成人aa在线观看| 亚洲avbb在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产亚洲av高清不卡| av天堂在线播放| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 69av精品久久久久久| 国产亚洲欧美98| 中文资源天堂在线| 好男人电影高清在线观看| 国产av不卡久久| 午夜激情福利司机影院| 白带黄色成豆腐渣| 国产一区二区激情短视频| 成年免费大片在线观看| 熟女电影av网| 亚洲全国av大片| 色哟哟哟哟哟哟| 日韩国内少妇激情av| 精品国产亚洲在线| 国产一区二区在线观看日韩 | 亚洲av熟女| 一边摸一边抽搐一进一小说| 两人在一起打扑克的视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 一本大道久久a久久精品| 妹子高潮喷水视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日韩高清综合在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 九色国产91popny在线| 在线a可以看的网站| 无遮挡黄片免费观看| 成在线人永久免费视频| 国产精品永久免费网站| 不卡一级毛片| 亚洲av熟女| 精品第一国产精品| 免费看a级黄色片| 久久亚洲真实| 看片在线看免费视频| 国产精品久久久av美女十八| 久久九九热精品免费| 真人做人爱边吃奶动态| 丰满的人妻完整版| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人国产综合亚洲| 久久久久久久午夜电影| 国产片内射在线| 亚洲精品中文字幕在线视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 伦理电影免费视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产亚洲av嫩草精品影院| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲一区中文字幕在线| 久久精品综合一区二区三区| 在线播放国产精品三级| 又粗又爽又猛毛片免费看| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产人伦9x9x在线观看| 日韩欧美精品v在线| 国产精品av久久久久免费| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产激情久久老熟女| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲av成人精品一区久久| 久久久国产精品麻豆| 午夜福利在线观看吧| 怎么达到女性高潮| 一区福利在线观看| 在线看三级毛片| 午夜激情av网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产69精品久久久久777片 | 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲专区字幕在线| 麻豆国产97在线/欧美 | 美女午夜性视频免费| 亚洲五月婷婷丁香| 99国产精品一区二区三区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲男人的天堂狠狠| 999精品在线视频| 男女之事视频高清在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 丁香欧美五月| 欧美成狂野欧美在线观看| 一本综合久久免费| 免费高清视频大片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜视频精品福利| 亚洲五月天丁香| 免费一级毛片在线播放高清视频| 美女黄网站色视频| 又爽又黄无遮挡网站| 不卡一级毛片| 久久精品成人免费网站| 成人永久免费在线观看视频| 99在线人妻在线中文字幕| 久久久国产成人精品二区| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久久久久大精品| 亚洲人成网站高清观看| 久久这里只有精品中国| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 淫秽高清视频在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲天堂国产精品一区在线| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 日本一二三区视频观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 变态另类丝袜制服| 久久人妻av系列| 亚洲国产精品999在线| 制服诱惑二区| 在线观看免费视频日本深夜| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产精品一区二区免费欧美| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久九九热精品免费| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 天堂动漫精品| 色尼玛亚洲综合影院| 此物有八面人人有两片| 亚洲性夜色夜夜综合| 天堂影院成人在线观看| 午夜a级毛片| 黄色片一级片一级黄色片| 免费无遮挡裸体视频| 淫秽高清视频在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 久久99热这里只有精品18| 免费在线观看亚洲国产| 国产爱豆传媒在线观看 | 精品电影一区二区在线| 制服诱惑二区| 国产精品久久久久久久电影 | 他把我摸到了高潮在线观看| www国产在线视频色| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产成人影院久久av| 91在线观看av| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲第一电影网av| 色噜噜av男人的天堂激情| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 在线观看66精品国产| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产1区2区3区精品| 两个人免费观看高清视频| av片东京热男人的天堂| 国产爱豆传媒在线观看 | 此物有八面人人有两片| 99精品久久久久人妻精品| 激情在线观看视频在线高清| a级毛片a级免费在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美午夜高清在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久精品91蜜桃| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产免费男女视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品免费一区二区三区在线| 91麻豆av在线| 亚洲自拍偷在线| 操出白浆在线播放| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲av熟女| 91九色精品人成在线观看| 变态另类丝袜制服| 一级毛片女人18水好多| 日韩欧美三级三区| 一本精品99久久精品77| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产亚洲欧美98| 午夜福利高清视频| 最近在线观看免费完整版| 麻豆成人av在线观看| 一个人免费在线观看电影 | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 很黄的视频免费| 一区二区三区高清视频在线| 午夜精品在线福利| 国产午夜福利久久久久久| 一个人观看的视频www高清免费观看 | av超薄肉色丝袜交足视频| 搞女人的毛片| 香蕉丝袜av| 丁香六月欧美| 日韩三级视频一区二区三区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产高清激情床上av| 中出人妻视频一区二区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品久久久久久,| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 午夜激情福利司机影院| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久这里只有精品19| 一区二区三区高清视频在线| 香蕉国产在线看| 欧美成人午夜精品| www.www免费av| 午夜激情av网站| av视频在线观看入口| 91在线观看av| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 一区二区三区国产精品乱码| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产成人av激情在线播放| 一进一出好大好爽视频| 国产高清videossex| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 91麻豆av在线| avwww免费| 亚洲欧美精品综合久久99| 婷婷精品国产亚洲av在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日韩欧美 国产精品| 久久性视频一级片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 一本久久中文字幕| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 夜夜爽天天搞| 怎么达到女性高潮| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲成av人片免费观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久久久久久久久黄片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 白带黄色成豆腐渣| 午夜福利免费观看在线| 男男h啪啪无遮挡| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久久精品大字幕| 99在线人妻在线中文字幕| 精品国产乱子伦一区二区三区| 深夜精品福利| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产黄a三级三级三级人| 一级毛片女人18水好多| 久久久久久久午夜电影| 中文资源天堂在线| 一夜夜www| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲国产精品成人综合色| 色老头精品视频在线观看| 亚洲av熟女| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 日韩有码中文字幕| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲欧美激情综合另类| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久久久久久午夜电影| 精品久久久久久久久久久久久| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲男人天堂网一区| 无人区码免费观看不卡| 中文在线观看免费www的网站 | 嫁个100分男人电影在线观看| 窝窝影院91人妻| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 无人区码免费观看不卡| 麻豆成人av在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 黄色a级毛片大全视频| 美女免费视频网站| 亚洲人成电影免费在线| 一二三四在线观看免费中文在| or卡值多少钱| 欧美久久黑人一区二区| 成人三级黄色视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 老司机在亚洲福利影院| 久久久精品欧美日韩精品| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久久国产欧美日韩av| 成人av在线播放网站| 在线a可以看的网站| 黄频高清免费视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 色综合站精品国产| 一本大道久久a久久精品| 岛国在线免费视频观看| 日本成人三级电影网站| 最近在线观看免费完整版| 午夜福利高清视频| 国产97色在线日韩免费| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲第一电影网av| 国产欧美日韩精品亚洲av| 黄色毛片三级朝国网站| 精品国产乱码久久久久久男人| 天天一区二区日本电影三级| 国模一区二区三区四区视频 | 十八禁网站免费在线| 免费观看精品视频网站| 91成年电影在线观看| 中文资源天堂在线| 日韩av在线大香蕉| 欧美三级亚洲精品| 国产成人av教育| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久草成人影院| 国产三级在线视频| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲,欧美精品.| 免费观看精品视频网站| 99国产综合亚洲精品| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲精华国产精华精| 国产视频一区二区在线看| 精品欧美国产一区二区三| www.自偷自拍.com| 又爽又黄无遮挡网站| 一区福利在线观看| 久久久精品大字幕| 舔av片在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美黑人巨大hd| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 麻豆国产av国片精品| 久久久久亚洲av毛片大全| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲av熟女| 不卡av一区二区三区| 午夜福利在线观看吧| 国语自产精品视频在线第100页| 高清毛片免费观看视频网站| 91字幕亚洲| 狂野欧美激情性xxxx| 久久99热这里只有精品18| 国产成人av激情在线播放| a级毛片a级免费在线| 天天一区二区日本电影三级| 午夜免费激情av| 成人av一区二区三区在线看| 久久久国产成人精品二区| 国产精品av视频在线免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日韩精品中文字幕看吧| 久久九九热精品免费| 男人舔奶头视频| 成人三级做爰电影| 五月玫瑰六月丁香| netflix在线观看网站| 国产成人精品无人区| 欧美三级亚洲精品| 亚洲成a人片在线一区二区| avwww免费| 久久久精品大字幕| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 日本成人三级电影网站| 99久久国产精品久久久| 五月伊人婷婷丁香| 国产成人av激情在线播放| 中文字幕熟女人妻在线| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产野战对白在线观看| 久久伊人香网站| 一二三四社区在线视频社区8| 中文资源天堂在线| 免费看十八禁软件| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲国产中文字幕在线视频| 九色成人免费人妻av| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日韩高清综合在线| 人人妻,人人澡人人爽秒播| www.精华液| 长腿黑丝高跟| 日本熟妇午夜| 制服诱惑二区| 亚洲国产精品999在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 在线观看66精品国产| 在线观看免费午夜福利视频| 一a级毛片在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 91av网站免费观看| 亚洲电影在线观看av| 欧美色欧美亚洲另类二区| 99久久精品热视频| 国产99久久九九免费精品| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久香蕉精品热| 无人区码免费观看不卡| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 日日爽夜夜爽网站| 欧美zozozo另类| 黄色 视频免费看| 精品久久蜜臀av无| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 这个男人来自地球电影免费观看| 精品人妻1区二区| 级片在线观看| 91成年电影在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 99在线视频只有这里精品首页| 搡老岳熟女国产| 黄色a级毛片大全视频| 国产伦人伦偷精品视频| 色哟哟哟哟哟哟| 成年女人毛片免费观看观看9| 岛国视频午夜一区免费看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 九色国产91popny在线| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| tocl精华| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产成人av激情在线播放| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美日韩黄片免| 欧美中文日本在线观看视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 精品欧美国产一区二区三| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 脱女人内裤的视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 国产黄片美女视频| 无人区码免费观看不卡| 亚洲激情在线av| 国产午夜精品论理片| 毛片女人毛片| 国产一区二区在线观看日韩 | 中文字幕精品亚洲无线码一区| 在线永久观看黄色视频| 亚洲午夜理论影院| 91国产中文字幕| 精华霜和精华液先用哪个| 日日夜夜操网爽| 亚洲五月天丁香| 午夜免费成人在线视频| 级片在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 我的老师免费观看完整版| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| videosex国产| 亚洲中文字幕日韩| 久久久国产成人精品二区| 长腿黑丝高跟| 成年版毛片免费区| aaaaa片日本免费| 免费电影在线观看免费观看| 日韩国内少妇激情av| 精品熟女少妇八av免费久了| 黄色女人牲交| 久久久久免费精品人妻一区二区| 午夜精品在线福利| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 欧美黑人欧美精品刺激| 日韩国内少妇激情av| 久99久视频精品免费| 一进一出好大好爽视频| 国产免费男女视频| 免费在线观看黄色视频的| 1024香蕉在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日韩有码中文字幕| 午夜免费观看网址| 日本熟妇午夜| 无人区码免费观看不卡| 日韩欧美三级三区| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国内揄拍国产精品人妻在线| 波多野结衣巨乳人妻| 男人的好看免费观看在线视频 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 色播亚洲综合网| 国产三级在线视频| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品 国内视频| 亚洲真实伦在线观看| 免费观看精品视频网站| 麻豆av在线久日| 日韩欧美精品v在线| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲精品久久国产高清桃花| 搡老岳熟女国产| 在线国产一区二区在线| 午夜精品在线福利| 两个人免费观看高清视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 女警被强在线播放|