內(nèi)蒙古布氏田鼠地理種群遺傳多樣性

魏磊， 趙素華， 胡奕， 王承民， 何宏軒*

(1. 亳州學(xué)院生物與化學(xué)工程系，安徽亳州 236800； 2. 宿州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽宿州234101；3.中國科學(xué)院動物研究所動物生態(tài)和保護生物學(xué)院重點實驗室，國家野生動物疫病研究中心，北京100101)

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內(nèi)蒙古布氏田鼠地理種群遺傳多樣性

魏磊1， 3， 趙素華2， 胡奕3， 王承民3， 何宏軒3*

(1. 亳州學(xué)院生物與化學(xué)工程系，安徽亳州 236800； 2. 宿州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽宿州234101；3.中國科學(xué)院動物研究所動物生態(tài)和保護生物學(xué)院重點實驗室，國家野生動物疫病研究中心，北京100101)

以MHCⅡ類基因第二外顯子為分子標記，利用限制性內(nèi)切酶分析法和序列分析法對8個布氏田鼠Lasiopodomysbrandtii地理種群進行遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示，8個布氏田鼠地理種群的MHCⅡ類基因第二外顯子酶切共檢測到6個等位基因，定義21種單倍型，其中有3個單倍型為不同區(qū)域種群共享，經(jīng)卡方檢驗，6個酶切多態(tài)性位點上基因型頻率不符合Hardy-Weinberg平衡；序列分析顯示，在261 bp的核苷酸序列中，有57個變異位點，單倍型多樣性為0.746 5～0.873 3、核苷酸多樣性為0.006 06～0.016 55。譜系分析得到3個穩(wěn)定的分支：錫林浩特、二連浩特、東烏珠穆沁旗和西烏珠穆沁旗4個種群形成一個單元分歧的進化分支(A區(qū)域)，新巴爾虎左旗、陳巴爾虎旗和新巴爾虎右旗3個種群成一個單元分歧的進化分支(B區(qū)域)，而位于渾善達克沙漠南部的正鑲白旗種群形成一個獨立單元分歧的進化分支(C區(qū)域)，分別與采集的地理種群相吻合。AMOVA分析結(jié)果表明，區(qū)域類群間的遺傳變異占總變異比率的64.08%，區(qū)域內(nèi)種群間占7.78%，種群內(nèi)占28.14%。除正鑲白旗種群外，布氏田鼠種群具有較豐富的遺傳多樣性，遺傳變異主要發(fā)生在區(qū)域類群之間和種群內(nèi)。

布氏田鼠；MHCⅡ類基因；遺傳多樣性

布氏田鼠Lasiopodomysbrandtii隸屬于嚙齒目Rodentia倉鼠科Cricetidae田鼠亞科Microtinae，是半干旱型草原的主要嚙齒類動物，分布在我國內(nèi)蒙古中、東部，蒙古利亞共和國南部、東方艾瑪格省東部以及俄羅斯(Shenbrot & Krasnov,2005)。在我國主要有2個間斷的分布區(qū)，分屬于內(nèi)蒙古的呼倫貝爾草原和錫林郭勒的典型草原地區(qū)。近年來人類活動和氣候變化破壞了草原生態(tài)系統(tǒng)，導(dǎo)致大面積荒漠的出現(xiàn)，形成了動物遷徙和重新分布的地理阻隔，使布氏田鼠種群呈點狀、片段化、間斷性分布(Zhongetal.，1985；Shi，1988；王萬杰，任伯平, 2007)。進化生物學(xué)和群體遺傳學(xué)理論表明，小的和孤立的種群將受到擴散的限制并導(dǎo)致遺傳多樣性降低，甚至因隨機漂移和近親繁殖的綜合影響而喪失遺傳變異(Frankham，2005)。Wang等(2011)基于微衛(wèi)星標記對內(nèi)蒙古東烏珠穆沁旗、阿巴嘎旗、新巴爾虎左旗和正鑲白旗4個布氏田鼠地理種群遺傳多樣性分析顯示，不同種群間等位基因平均數(shù)、有效等位基因平均數(shù)、信息指數(shù)、有效等位基因數(shù)和平均期望雜合度之間無顯著差異，各種群內(nèi)平均觀測雜合度小于平均期望雜合度，4個種群28個位點中有14個位點背離Hardy-Weinberg平衡。結(jié)果表明布氏田鼠遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，其中正鑲白旗種群存在近交現(xiàn)象，遺傳多樣性最低。

分子標記技術(shù)為研究種內(nèi)不同種群形成現(xiàn)有地理分布格局的歷史原因和演化過程提供了有效的途徑(Aviseetal.， 1998)。主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex， MHC)是脊椎動物體內(nèi)與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)密切相關(guān)的一個基因家族，由緊密連鎖的高度多態(tài)性基因座位組成。MHC基因作為分子標記與微衛(wèi)星標記相比顯示了在選擇平衡下的高度遺傳多樣性，其變異可反映基因組水平的變異，而多數(shù)受選擇作用影響的分子標記則因為缺少變異性而無法闡述種群間的差異和適應(yīng)性；微衛(wèi)星位點因其主要受非選擇性機制的影響而不適于闡述種群間的不同適應(yīng)性(Quelleretal.，1993；Kimetal.，1999)。因此，通過分析MHC的遺傳變異可以提供物種的遺傳多樣性水平、進化歷史和種群動態(tài)及種群遺傳結(jié)構(gòu)等信息。

本文以MHCⅡ類基因第二外顯子為分子標記，對內(nèi)蒙古8個布氏田鼠地理種群進行遺傳多樣性分析，以期得到布氏田鼠種群遺傳多樣性的分子證據(jù)，為進一步開展布氏田鼠的分子生物學(xué)研究提供分子數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品來自于正鑲白旗(115°16.331′E，42°25.611′N；n=62)、陳巴爾虎旗(119°44.735′E，49°32.652′N；n=52)、新巴爾虎左旗(118°03.776′E，49°18.152′N；n=56)、新巴爾虎右旗(118°22.573′E，48°21.625′N；n=50)、西烏珠穆沁旗(117°57.324′E，44°5.211′N；n=53)、二連浩特(112°23.564′E，43°53.245′N；n=65)、東烏珠穆沁旗(116°10.846′E，44°59.454′N；n=54)、錫林浩特(115°13.673′E，44°50.351′N；n=68)地區(qū)8個種群，共460只布氏田鼠，各取樣點間的距離不小于200 km。樣品采集信息見圖1。

圖1 布氏田鼠采集地點的分布

1.2 基因組DNA提取與PCR擴增

用DNA試劑盒提取基因組。以GenBank中登錄號為AJ003232、AJ634270、AF084934、U88933、M73960、BC132163、K0012的序列作參考，設(shè)計1對引物：上游引物MF：5’-GGAATACGGTACATCTGAG-3’，下游引物MR：5’-CAACTCTCCGCCGCACAAGG-3’；PCR反應(yīng)在PTC-200型DNA擴增儀上進行，PCR反應(yīng)體系總體積為30 μL，其中1.0 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.3)，1.5 mmol·L-1MgCl2，50 mmol·L-1KCl，150 μmol·L-1dNTPs，引物各0.25mol，1 U Taq DNA聚合酶，30 ng DNA。反應(yīng)程序為：94 ℃變性45 s，54 ℃復(fù)性50 s，72 ℃延伸50 s，共30個循環(huán)。循環(huán)前95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)后繼續(xù)72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并送生工生物工程(上海)股份有限公司進行正反測序。

1.3 限制性內(nèi)切酶分析

限制性內(nèi)切酶RsaⅠ購自寶生物工程(大連)有限公司。酶切體系和條件按說明書進行。酶切產(chǎn)物用含溴化乙錠的8%瓊脂糖凝膠電泳后拍照，觀察結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 20.0對酶切結(jié)果進行基因型統(tǒng)計。用Clustal X(Thompaonetal.，1997)進行序列比對。利用MEGA 6.0(Tamuraetal.，2013)中的非加權(quán)平均算術(shù)法(UPGMA)對各種群進行聚類分析，利用Bootstrap Test檢驗所得聚類結(jié)果可靠性。用Arlequin (version 3.0)(Excoffieretal.，2007)對基因序列進行分析，統(tǒng)計多態(tài)位點數(shù)(number of polymorphic sites，S)，并以Pairwise difference分子距離計算單倍型多樣性(haplotype diversity，H)、核苷酸平均差異數(shù)(mean number of nucleotide differences，π)和核苷酸多樣性(nucleotide diversity，πn)，種群結(jié)構(gòu)的地理格局通過該軟件的分子變異分析AMOVA模塊來估測。

2 結(jié)果

2.1 MHCⅡ類基因第二外顯子酶切單倍型及等位基因型頻率

8個布氏田鼠地理種群MHCⅡ類基因第二外顯子RsaⅠ酶切共檢測到6個等位基因，13個酶切多態(tài)位點，定義了21種單倍型(表1)，3個單倍型由8個種群共享；經(jīng)卡方檢驗，6個酶切多態(tài)性位點上基因型頻率不符合 Hardy-Weinberg平衡。正鑲白旗種群純合子基因型頻率較高(0.064 5～0.112 9)，雜合子基因型頻率較低(0.016 2～0.048 4)，其他種群純合子基因型頻率與雜合子基因型頻率基本一致。

表1 布氏田鼠MHCⅡ類基因第二外顯子酶切基因型

2.2 MHCⅡ類基因第二外顯子序列分析

8個地理種群共460只布氏田鼠的MHCⅡ類基因第二外顯子序列長度均為261 bp。選取純合單倍型aa作為對比序列，經(jīng)DnaSP分析,整個核苷酸序列無堿基空缺，共發(fā)現(xiàn)57個變異位點，突變位點百分率為21.84%(圖2)。

2.3 聚類分析

用UPGMA法對8個布氏田鼠地理種群進行聚類分析顯示，位于錫林郭勒高原東南渾善達克沙地南部的正鑲白旗種群首先分化出來獨立成一支，顯示了這個區(qū)域與其他2個區(qū)域種群的隔離；位于錫林郭勒高原中部區(qū)域的二連浩特、錫林浩特、東烏珠穆沁旗和西烏珠穆沁旗種群形成一個單元分歧的進化分支；位于呼倫貝爾高原西南區(qū)域的新巴爾虎左旗、新巴爾虎右旗與陳巴爾虎旗種群形成一個單元分歧的進化分支。把這3個進化單元劃分為A、B、C 3個區(qū)域(圖3)。

圖2 布氏田鼠MHCⅡ類基因第二外顯子序列分析

Fig.2 Analysis of MHC class Ⅱ exon 2 ofLasiopodomysbrandtii

方框內(nèi)為Rsa Ⅰ識別序列，向上箭頭表示酶切位點，向下箭頭表示堿基突變位點。

Boxes represent recognized sequence of Rsa Ⅰ; upward arrows represent restriction enzyme sites for Rsa Ⅰ; downward arrows represent mutation site.

2.4 布氏田鼠種群遺傳多樣性

根據(jù)地理分布及譜系結(jié)果對布氏田鼠進行種群遺傳多樣性分析。遺傳多樣性信息統(tǒng)計結(jié)果顯示，B區(qū)域種群多態(tài)位點數(shù)、單倍型多樣性和核苷酸多樣性最高，A區(qū)域種群次之，C區(qū)域種群最低(表2)，且核苷酸差異分析表明,C區(qū)域種群與其他區(qū)域種群之間的遺傳差異明顯。AMOVA分析結(jié)果表明，區(qū)域類群間的遺傳變異占總變異比率的64.08%，區(qū)域內(nèi)種群間占7.78%，種群內(nèi)占28.14%。除正鑲白旗種群外，布氏田鼠種群具有較豐富的遺傳多樣性。遺傳變異主要發(fā)生在區(qū)域類群之間和種群內(nèi)。

3 討論

盡管瀕危物種的遺傳多樣性是生物多樣性研究中的熱點問題(黃磊,王義權(quán)，2004；常青等，2005；黎燕瓊等，2011)，但生態(tài)學(xué)家及生物學(xué)家同樣關(guān)注其他野生動物如嚙齒類動物種群遺傳多樣性的研究。Bromham等(1996)和Li等(1996)對家鼠種群遺傳多樣性進行了研究，結(jié)果表明該物種的單倍型多樣性和核苷酸多樣性都較高。Hirota等(2004)研究結(jié)果揭示大林姬鼠Apodemusspeciosus隔離種群的核苷酸多樣性較高，而單倍型多樣性較低。蔡振媛等(2007)基于線粒體D-loop序列分析探討了高原鼢鼠Myospalaxbaileyi8個種群的遺傳多樣性，研究結(jié)果揭示該物種的單倍型多樣性較高而核苷酸多樣性較低。謝建云等(2007)對東方田鼠Microtusfortis4個種群線粒體D-loop區(qū)遺傳多態(tài)性分析顯示，該區(qū)遺傳變異豐富，呈廣泛的種類多態(tài)性。梁君(2007)對蒙新區(qū)子午沙鼠Merionesmeridianus和長爪沙鼠M.unguiculatus的研究結(jié)果顯示，2個物種的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.991、0.047和0.976、0.007。Chen等(2010)基于線粒體控制區(qū)(D-loop)研究了分布于橫斷山脈白腹鼠Niviventerexcelsior種群的遺傳多樣性，結(jié)果顯示該物種有較高的單倍型多樣性和核苷酸多樣性，表明在更新世冰期，橫斷山脈復(fù)雜的地形結(jié)構(gòu)為白腹鼠種群提供了避難所從而使其保持了高水平的遺傳多樣性。Fan等(2012)基于線粒體細胞色素b基因研究了分布于青藏高原東南部的中華姬鼠Apodemusdraco種群的遺傳多樣性，結(jié)果表明該物種的單倍型多樣性和核苷酸多樣性較高，種群具有豐富的遺傳多樣性。黃翔和周立志(2012)基于8個多態(tài)性的微衛(wèi)星位點，對子午沙鼠14個局域種群的160只個體進行了種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的分析，結(jié)果表明該物種具有高的遺傳多樣性。

表2 布氏田鼠遺傳多樣性

圖3 布氏田鼠種群的UPGMA聚類分析

支點處的數(shù)字是置信度， 即2 000次bootstrap抽樣檢驗的重復(fù)百分比; ER. 二連浩特， XL. 錫林浩特， XW. 西烏珠穆沁旗， DW. 東烏珠穆沁旗， XZ. 新巴爾虎左旗， XY. 新巴爾虎右旗， CB. 陳巴爾虎旗， ZB. 正鑲白旗； 下同。

The numbers at nodes are the percent occurrence in 2 000 bootstrap replicates; ER. Erlianhaote, XL. Xilinhaote, XW. Xiwuqi, DW. Dongwuqi, XZ. Xinbaerhuzuoqi, XY. Xinbaerhuyouqi, CB. Chenbaerhuqi, ZB. Zhengxiangbaiqi; the same below.

遺傳多樣性是生物進化的內(nèi)在源泉，其水平能反映出物種進化潛力和種群遺傳適應(yīng)潛力。遺傳多樣性常用單倍型多樣性、核苷酸多樣性來度量(Tajima，1983)。單倍型多樣性、核苷酸多樣性值越大，群體的遺傳多樣性越高。本研究結(jié)果顯示，8個種群460只布氏田鼠MHCⅡ類基因第二外顯子酶切基因型頻率分析顯示，除正鑲白旗種群純合子基因型頻率較高，雜合子基因型頻率較低外，其他種群純合子基因型頻率與雜合子基因型頻率基本一致?？ǚ綑z驗顯示，13個酶切位點中6個位點偏離Hardy-Weinberg平衡，其中4個位點出現(xiàn)在正鑲白旗種群，揭示正鑲白旗種群純合子所占的比例較高，雜合子所占的比例較低。序列分析表明，B區(qū)域種群序列多態(tài)性較高，A區(qū)域種群次之、C區(qū)域種群最低。8個種群460只布氏田鼠MHCⅡ類基因第二外顯子酶切結(jié)果共檢出21種單倍型，B區(qū)域的3個種群單倍型多樣性最高，A區(qū)域的4個種群次之，C區(qū)域種群最低。本研究中B區(qū)域種群的單倍型多樣性較A區(qū)域、C區(qū)域高，核苷酸多樣性也比A區(qū)域、C區(qū)域高，符合上述規(guī)律。布氏田鼠與子午沙鼠和長爪沙鼠的單倍型多樣性和核苷酸多樣性類似，呈現(xiàn)出單倍型多樣性高、核苷酸多樣性低的特點。究其原因：首先，單個堿基的突變可以影響單倍型多樣性，但對核苷酸多樣性的影響卻較小，與單倍型多樣性相比，核苷酸多樣性的提高需要更長時間的積累。因此，環(huán)境反復(fù)變化造成的種群縮小和快速增長被認為是造成這種遺傳多樣性特征的主要原因之一(緱敬軒，2004；曹華猛，2005)。布氏田鼠長期受特定的地理環(huán)境條件脅迫和棲息地片段化的雙重作用，與其他北方嚙齒類一樣，種群大小受反饋調(diào)節(jié)的影響，數(shù)量在短時間內(nèi)經(jīng)歷了漲落波動(Elton，1942；Zhongetal.，1985)，種群數(shù)量極端的波動即種群增長瓶頸效應(yīng)能消除過去時間積累的核苷酸多樣化變異，但又能快速導(dǎo)致少數(shù)堿基位點的快速進化而引起種群遺傳結(jié)構(gòu)的變化(Wright，1943)。其次，由于布氏田鼠營地下生活，環(huán)境相對穩(wěn)定以及有限的遷徙擴散能力限制了基因流，任何短時間內(nèi)的變異都能積累起來，從而使單倍型的多樣性高，但提高核苷酸多樣性卻需要長時間的積累。

國內(nèi)外許多學(xué)者研究過不同地理種群遺傳多樣性水平的差異并探討了差異產(chǎn)生的原因。Paetkau等(1998)和周樂等(2007)研究表明，種群的遺傳多樣性水平與其種群的大小有顯著的相關(guān)性。Wisely等(2002)對黑足鼬Mustelanigripes的研究表明，大種群的遺傳多樣性水平明顯高于被隔離的小種群。這些研究結(jié)果揭示種群的遺傳多樣性水平與其種群的大小有顯著的相關(guān)性，大種群的遺傳多樣性水平明顯高于被隔離的小種群。本研究結(jié)果表明布氏田鼠種群總的遺傳多樣性水平較高，但就區(qū)域種群而言，A區(qū)域、B區(qū)域的種群均顯示出較高的單倍型多樣性和核苷酸多樣性，C區(qū)域的正鑲白旗種群較低。出現(xiàn)這種情況可能有以下原因：首先，布氏田鼠作為內(nèi)蒙古草原的主要嚙齒類動物，分布范圍從內(nèi)蒙古東部的典型草原、干草原到中部的荒漠草原，分布區(qū)中地理環(huán)境復(fù)雜多樣，表明布氏田鼠對高寒環(huán)境有良好的適應(yīng)能力，環(huán)境條件的差異對其遺傳多樣性水平影響較小。其次，A區(qū)域種群分布在呼倫貝爾高原，B區(qū)域種群分布在錫林郭勒高原，區(qū)域內(nèi)沒有大的山脈、河流的阻隔，地理屏障作用不明顯，且區(qū)域內(nèi)種群相對較大，種群之間的基因交流也相對較多。再次，C區(qū)域種群位于渾善達克沙地南部，因沙漠形成了它與其他地理種群之間基因交流的自然屏障而成為隔離封閉種群，且種群都相對較小，這可能是C區(qū)域種群遺傳多樣性較低的重要原因。

致謝：感謝中國科學(xué)院植物研究所內(nèi)蒙古錫林郭勒草原生態(tài)系統(tǒng)國家野外觀測研究站的全體工作人員，中國科學(xué)院動物研究所農(nóng)業(yè)蟲害鼠害國家重點實驗室的張強博士和鄭州大學(xué)生物系謝東明在樣品采集過程中給予的幫助。

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Genetic Diversity ofLasiopodomysbrandtiiPopulations in Inner Mongolia

WEI Lei1， 3， ZHAO Suhua2， HU Yi3， WANG Chengmin3， HE Hongxuan3*

(1. Bozhou University， Bozhou， Anhui Province 236800， China; 2. Suzhou Vocational Technology College， Suzhou，Anhui Province 234101， China; 3. National Research Center for Wildlife Born Diseases， Key Laboratory of Animal Ecology and Conservation Biology， Institute of Zoology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China)

The genetic diversity of 8 geo-populations ofLasiopodomysbrandtiiwere analyzed using PCR-RFLP and sequence analysis based on MHC class Ⅱ exon 2. The results showed that 6 alleles， 21 haplotypes and 13 restriction enzyme polymorphic loci were detected， and 3 haplotypes were shared by all the populations. The Chi-square test results suggested that the 8 populations ofL.brandtiiin the present study did not follow with the Hardy-Weinberg equilibrium at six restriction enzyme polymorphic loci. Sequence analysis showed that there were 57 bases mutations. Haplotype diversity (H) and nucleotide diversity (πn) were 0.746 5～0.873 3 and 0.006 06～0.016 55， respectively. Phylogenetic analyses suggested that the sampled individuals were clustered into three clades： populations of Xilinhaote， Erlianhaote， Dongwuqi， and Xiwuqi were clustered as Zone A; populations of Xinbaerhuzuoqi， Chenbaerhuqi and Xinbaerhuyouqi were clustered as Zone B; while the Zone C was comprised of the sole population from Zhengxiangbaiqi. And this clustering pattern was consistent with their geographical distributions. The result of AMOVA analysis showed that regional genetic variation was accounted for 64.08% of the total， intraregional population variation was accounted for 7.78%， and individual variation was accounted for 28.14%. There was a rich genetic diversity among the populations ofL.brandtiiexcept Zhengxiangbaiqi population. The majority of genetic variation occurred among groups and within populations.

Lasiopodomysbrandtii; MHC class Ⅱ gene; genetic diversity

2016-06-06 接受日期：2016-08-22

安徽省高校學(xué)科(專業(yè))拔尖人才學(xué)術(shù)資助重點項目(gxbjZD2016108); 安徽省教育廳自然科學(xué)基金重點項目(KJ2012Z406); 國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項目(9732007BC109103); 國家自然科學(xué)基金項目(31101806)

魏磊(1969—)， 男， 教授， 博士， 研究方向： 功能基因、分子系統(tǒng)地理學(xué)， E-mail：weileisu@163.com

*通信作者Corresponding author， E-mail：hehx@ioz.ac.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20160157

Q959.837

A

1000-7083(2016)06-0818-07