蛋雞感染新城疫病毒后輸卵管組織中病毒分布與炎癥相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

耿海婷，王晶鈺，唐超超，黎瑞巧

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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蛋雞感染新城疫病毒后輸卵管組織中病毒分布與炎癥相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

耿海婷，王晶鈺*，唐超超，黎瑞巧

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

通過(guò)間接免疫熒光(IFC)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)方法研究了蛋雞感染新城疫病毒(NDV)后輸卵管組織中病毒分布及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果表明，NDV可在輸卵管組織中復(fù)制，證明感染成功，NDV感染引起蛋雞輸卵管膨大部和子宮部IL-2、IL-6、IL-1β、IFN-β、CXCLi1、CXCLi2及CCR5 mRNA mRNA表達(dá)上調(diào)；在感染120 h后，膨大部IL-2、IFN-β和IL-1β mRNA表達(dá)達(dá)到峰值，分別為健康對(duì)照組的137倍、95.1倍和15.9倍；子宮部在感染第9天達(dá)到峰值，分別為36.2倍、59.9倍和10.3倍。在感染前3 d，IFN-α mRNA在膨大部的表達(dá)為下調(diào)的趨勢(shì)，而從感染第5天開(kāi)始上調(diào)；而子宮部IFN-α的mRNA表達(dá)均上調(diào)。NDV感染后趨化因子CXCLi1、CXCLi2及 CCR5 mRNA的在膨大部和子宮部表達(dá)均上調(diào)，其中膨大部CXCLi1、CXCLi2和CCR5 mRNA上調(diào)的最高值分別為20.5倍、78.3倍和22.1倍；其在子宮部分別上調(diào)5.5倍、64.3倍、25.5倍。總的來(lái)說(shuō)， NDV能感染蛋雞輸卵管組織并引起IL-2、IL-6、IL-1β、IFN-β、CXCLi1、CXCLi2及CCR5mRNA表達(dá)上調(diào)，這些細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的上調(diào)可能與輸卵管炎癥的發(fā)生有關(guān)。

新城疫病毒；輸卵管；細(xì)胞因子；趨化因子；炎癥

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種急性、高度接觸傳染性疾病，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失[1]。新城疫病毒感染蛋雞不僅可引起呼吸道出現(xiàn)急性癥狀，也可引起蛋雞輸卵管充血、出血，出現(xiàn)炎癥病理變化，導(dǎo)致輸卵管機(jī)能障礙，產(chǎn)蛋率下降40%～60%，產(chǎn)軟殼蛋、沙殼蛋的的幾率增加[2]。1950年疫苗免疫已經(jīng)被用于對(duì)新城疫的防控，但是該疾病仍然在國(guó)內(nèi)一些地區(qū)流行。Ⅶ型NDV是目前在亞洲流行的主要基因型，對(duì)家禽業(yè)造成了巨大的威脅[3]。關(guān)于Ⅶ型NDV病原學(xué)特點(diǎn)的研究很多，但是Ⅶ型NDV感染蛋雞后輸卵管各部位細(xì)胞因子及趨化因子基因的表達(dá)研究很少。因此，本研究用Ⅶ型NDV感染非免疫產(chǎn)蛋母雞，研究了NDV在蛋雞輸卵管組織中的分布規(guī)律,檢測(cè)與炎癥相關(guān)的白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-6、IL-1β，干擾素-α(IFN-α)、IFN-β和趨化因子CXCLi1、CXCLi2，趨化因子受體 CCR5 mRNA在輸卵管膨大部和子宮部的表達(dá)，為揭示基因Ⅶ型NDV感染蛋雞后導(dǎo)致輸卵管功能障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 基因Ⅶ型NDV(NDV/Chicken/TC/1/2011)毒株，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)系鑒定保存。

1.1.2 試驗(yàn)用雞 40周齡非免疫產(chǎn)蛋高峰期羅曼白殼蛋雞(新城疫HI抗體≤2 log2)，購(gòu)自楊凌綠方生物工程有限公司。

1.1.3 SPF雞胚 10日齡SPF雞胚購(gòu)自楊凌綠方生物工程有限公司。

1.1.4 主要試劑 抗熒光淬滅封片劑為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；Hoechst 33342 染液為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；鼠抗NDV HN蛋白單克隆抗體和FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG熒光二抗為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品； RNA提取和cDNA合成試劑盒、SYBR green熒光定量mix為北京全式金公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 基因Ⅶ型NDV增殖及EID50測(cè)定 復(fù)蘇在-80 ℃保存的新城疫病毒，進(jìn)行1 000倍稀釋。接種0.1 mL稀釋的病毒液于10日齡SPF雞胚尿囊腔中，37℃溫箱孵育，72 h后無(wú)菌收集尿囊液。血凝試驗(yàn)(HA)測(cè)定尿囊液血凝價(jià)為27～8，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10倍梯度稀釋NDV尿囊液，取10-5～10-10稀釋度，將每個(gè)稀釋度的尿囊液接種5枚10日齡SPF雞胚，每枚雞胚接種0.1 mL，37 ℃溫箱中孵育72 h 后，收集尿囊液，HA試驗(yàn)檢測(cè)其血凝性，若出現(xiàn)血凝現(xiàn)象則按照Reed-Muench計(jì)算NDV的EID50。

1.2.2 攻毒試驗(yàn) 將40只40周齡非免疫產(chǎn)蛋高峰期羅曼白殼蛋雞隨機(jī)分為8組，每組5只。第1組為健康對(duì)照組，第2組至第8組分別經(jīng)點(diǎn)眼和滴鼻接種NDV，0.5 mL/只，為攻毒試驗(yàn)組。于感染前處死第1組，其余7組分別在感染后第1、3、5、7、9、11、15天頸部放血處死，分離并采集輸卵管并立即將輸卵管不同部位，一部分保存于40 mL/L多聚甲醛溶液中固定，用于免疫熒光試驗(yàn)，另一部分立即放入液氮保存，用于熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.3 間接免疫熒光(IFC)檢測(cè)NDV在輸卵管組織中的分布

1.2.3.1 石蠟切片制作 參照陳占莉等[4]的方法將健康蛋雞及感染蛋雞輸卵管5個(gè)部位組織進(jìn)行石蠟包埋及切片。

1.2.3.2 新城疫病毒HN蛋白間接免疫熒光檢測(cè) 將組織切片于55℃烘箱中烘片30 min，二甲苯Ⅰ脫蠟5 min，二甲苯Ⅱ脫蠟5 min，二甲苯、乙醇混合液(1∶1)5 min。之后在無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ； 950、90、80、70 mL/L乙醇依次復(fù)水2 min；自來(lái)水沖洗5次，蒸餾水2 min。隨后用1×PBS輕輕潤(rùn)洗切片3次，每次5 min，每個(gè)樣本上滴加100 μL 5 mL/L胎牛血清封閉液，37 ℃反應(yīng)30 min。棄去封閉液，切片潤(rùn)洗15 min，之后每個(gè)樣本上滴加100 μL鼠抗HN蛋白單克隆抗體(PBS 1∶400稀釋)，4℃孵育1 h。一抗孵育過(guò)夜后，用1×PBS 潤(rùn)洗切片3次，每次5 min。之后，每個(gè)樣本滴加100 μL羊抗鼠FITC IgG二抗，37℃避光孵育1 h。反應(yīng)后的樣本片浸入1×PBS 避光潤(rùn)洗15 min；用Hoechst 33342染色液復(fù)染細(xì)胞核，室溫避光反應(yīng)5 min；封片后激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)，使用NIS-Elements高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)照相，記錄觀察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核為藍(lán)色，HN蛋白陽(yáng)性染色為綠色。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)NDV感染蛋雞后輸卵管主要細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

1.2.4.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中公布的雞IL-2、IL-8、IL-1β、IFN-α、IFN-β、CXCLi1、CXCLi2、CCR5、β-actin基因序列，用Primer premiere 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，采用Primer blast工具進(jìn)行檢索來(lái)驗(yàn)證其特異性，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.4.2 RNA的提取和cDNA的合成 RNA的提取和cDNA的合成根據(jù)北京全式金生物技術(shù)有限公司Trizol總RNA提取試劑盒說(shuō)明說(shuō)書(shū)和cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.4.3 Real-time PCR 用核酸測(cè)定儀測(cè)定cDNA濃度。將膨大部和子宮部cDNA稀釋成相同的濃度，作為real-time PCR檢測(cè)的模板。最佳反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 2 μL，SYBR Green Reaction Mix 10 μL，dd H2O 7 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL；real-time PCR程序：95℃ 5 min；94℃ 15 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，設(shè)定收集熒光。

表1 Real-time引物表

2 結(jié)果

2.1 蛋雞感染NDV臨床癥狀觀察

在人工感染后第2天可見(jiàn)蛋雞出現(xiàn)輕微的臨床癥狀，嗜睡、羽毛蓬松、精神沉郁。感染第3天，感染蛋雞表現(xiàn)出典型的新城疫臨床癥狀，如呼吸困難，嗜睡，采食和飲水減少；拉黃綠色稀糞，產(chǎn)軟殼蛋。在感染第5～第10天，多數(shù)雞死亡。在感染第15天，有的蛋雞恢復(fù)了健康。剖檢發(fā)現(xiàn)感染蛋雞腺胃出血，氣管出血，大腦水腫，卵泡溶解，輸卵管水腫。健康對(duì)照組未出現(xiàn)臨床癥狀和病理變化。

2.2 新城疫病毒在輸卵管的分布情況

采用間接免疫熒光染色觀察新城疫病毒感染蛋雞后第5天病毒在輸卵管不同部位的分布結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1A為健康組織中未觀察到綠色熒光，健康對(duì)照成立。圖1B為感染雞的輸卵管組織，可觀察到病毒主要存在于傘部、膨大部、峽部黏膜固有層腺上皮細(xì)胞，零散分布在黏膜下層細(xì)胞；在子宮部，病毒主要存在于黏膜下層細(xì)胞，而零散的分布于固有層細(xì)胞；而病毒主要存在于陰道部黏膜上皮細(xì)胞。

2.3 炎癥相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)變化

NDV感染蛋雞后輸卵管膨大部和子宮部細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)。膨大部IL-2、IL-6、IL-1β、IFN-β在感染過(guò)程中都呈現(xiàn)出不同程度的上調(diào)，且在感染第5天達(dá)到峰值，分別為137倍、3.5倍、15.9倍和95.1倍(圖2)，子宮部IL-2、IL-1β、IFN-β在感染第9天達(dá)到峰值，分別為36.3倍、10.3倍和59.9倍(圖2)。引人注意的是，膨大部IFN-α mRNA在感染初期下調(diào)隨后上調(diào)，而子宮部IFN-α mRNA表達(dá)均為上調(diào)。趨化因子CXCLi1、CXCLi2和趨化因子受體CCR5 mRNA的表達(dá)在整個(gè)感染過(guò)程中均上調(diào)。感染第5天，CXCLi1在膨大部和子宮部都達(dá)到峰值，分別為20.5倍和5.5倍； 膨大部CXCLi2和CCR5在感染第5天達(dá)到最大值，分別為78.3倍和22.1倍，子宮部CXCLi2和CCR5分別在第9天和第5天達(dá)到了最高值，分別為64.3倍和25.5倍(圖3)。

3 討論

本試驗(yàn)用間接免疫熒光方法對(duì)輸卵管5個(gè)部位進(jìn)行病毒染色。結(jié)果病毒在傘部、膨大部、峽部主要存在于固有層腺上皮細(xì)胞，零星的分布于黏膜下層細(xì)胞；在子宮部，病毒主要存在于黏膜下層細(xì)胞，零星分布于固有層細(xì)胞；在陰道部病毒主要分布于黏膜上皮細(xì)胞。研究表明NDV HN蛋白是病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白，它能識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞表面表達(dá)的唾液酸受體[5-7]，病毒在5個(gè)部位的分布差異可能反應(yīng)出不同部位的黏膜上皮或固有層腺上皮細(xì)胞表達(dá)唾液酸受體的量存在差異。病毒感染可能導(dǎo)致輸卵管不同部位產(chǎn)生不同的病理變化，從而降低輸卵管腺體細(xì)胞的分泌功能，繼而影響產(chǎn)蛋質(zhì)量和蛋品質(zhì)下降。

A.健康對(duì)照雞的輸卵管5個(gè)部位染色；B.病毒感染后輸卵管5個(gè)部位染色；藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，綠色熒光為陽(yáng)性的HN蛋白染色

"*"P<0.05,"**"P<0.01,"***"P<0.001

圖2 NDV感染后IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-α和IFN-β mRNA在膨大部和子宮部不同時(shí)間的表達(dá)變化

Fig.2 IL-1β，IL-2，IL-6，IFN-α，IFN-β mRNA expressions in oviducts of hens infected with NDV at different time

"*"P<0.05,"**"P<0.01,"***"P<0.001.

圖3 NDV感染后CXCLi1、CXCLi2和CCR5 mRNA在膨大部和子宮部不同時(shí)間的表達(dá)變化

Fig.3 CXCLi1,CXCLi2,CCR5 mRNA expressions in oviducts of hens infected with NDV at different time

由于膨大部和子宮部為雞蛋形成的重要部位，本試驗(yàn)特地檢測(cè)了NDV感染誘導(dǎo)蛋雞的膨大部和子宮部細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-1β、IFN-α、IFN-β和趨化因子CXCLi1、CXCLi2、CCR5 mRNA的表達(dá)變化。膨大部和子宮部細(xì)胞因子及趨化因子基因表達(dá)的增加可能與臨床癥狀和輸卵管局部炎癥有關(guān)[8-9]。除IFN-α外，輸卵管膨大部細(xì)胞因子及趨化因子mRNA的上調(diào)倍數(shù)幾乎都高于子宮部，且膨大部基因表達(dá)幾乎都在第5天達(dá)到最高值，而子宮部多在第九天達(dá)到峰值。膨大部和子宮部相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子基因表達(dá)變化的差異反應(yīng)出膨大部對(duì)NDV感染的免疫應(yīng)答更為敏感。病毒對(duì)膨大部固有層腺上皮細(xì)胞的感染可能促進(jìn)了局部細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)及分泌，從而加速對(duì)局部淋巴細(xì)胞的招募以及病毒的清除。

值得注意的是膨大部IFN-α在感染早期呈現(xiàn)明顯的下調(diào)趨勢(shì)，抑制IFN-α的基因表達(dá)可能是病毒促進(jìn)自身快速?gòu)?fù)制的機(jī)制，也是病毒與宿主細(xì)胞相互作用的結(jié)果[10]。雞的趨化因子CXCLi1 和 CXCLi2主要趨化單核細(xì)胞[11]。本研究中，趨化因子CXCLi1、CXCLi2和趨化因子受體都呈現(xiàn)出上調(diào)的趨勢(shì)，可能是感染基因Ⅶ型NDV后，蛋雞輸卵管黏膜上皮或是腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子基因表達(dá)上調(diào)，趨化因子的分泌增多，繼而使帶有CCR5受體的淋巴細(xì)胞從血液當(dāng)中移行到感染部位，參與炎癥反應(yīng)。

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Virus Distributions and Related Cytokine mRNA Expressions in Oviducts of Layers Infected with Newcastle Disease Virus

GENG Hai-ting,WANG Jing-yu，TANG Chao-chao,LI Rui-qiao

(CollegeofVeterinatyMedicine,NorthwestA&FUniversity，Yangling，Shaanxi,712100，China)

To investigate the main cytokine mRNA expression changes in oviducts of layers infected with NDV,real-time PCR was used to detect the mRNA expression changes of IL-2,IL-6,IL-1β,IFN-β,CXCLi1,CXCLi2 and CCR5 in magnum and uterus.The results showed that the cytokine and chemokine mRNA expressions of IL-2,IL-6,IL-1β,IFN-β,CXCLi1，CXCLi2 and CCR5 mRNA were up-regulated in magnum and uterus after NDV infection.At the fifth day post infection(dpi),the mRNA expressions of IL-2,IFN-β,IL-1β reached peak,the changes were 137-fold,15.9-fold and 95.1-fold respectively compared with healthy controls; while the mRNA expression changes of IL-2,IFN-β,IL-1β peaked at 9 dpi in uterus,respectively 36.2-fold,59.9-fold and 10.3-fold.IFN-αmRNA expressions in magnum were down-regulated during the three days post infection,while at 5dpi,it began to up regulate.In uterus,IFN-α mRNA expression was always up-regulated during infection process.CXCLi1，CXCLi2 and CCR5 mRNA were up-regulated in magnum and uterus after NDV infection,CXCLi1， CXCLi2,CCR5 mRNA were up-regulated in magnum,the peak values were 20.5-fold,78.3-fold and 22.1-fold,respectively.In general,oviuctal tissues can be infected with NDV，and IL-2，IL-6，IL-1β，IFN-β，CXCLi1，CXCLi2 and CCR5 mRNA expressions were induced by NDV infection.The induction of mRNA expressions of the cytokines and chemokines may be associated with the inflammation occurred in oviduct tissues after NDV infection.

Newcastle disease virus；oviduct；cytokine；chemokine; inflammation

2016-04-06

耿海婷(1989年—)，女，陜西咸陽(yáng)人，獸醫(yī)碩士，主要從事獸用生物制品的研發(fā)。*通訊作者

S852.659.5

A

1007-5038(2016)11-0043-05