小鼠發(fā)情周期陰道上皮細(xì)胞形態(tài)變化的研究

靳 光，薛艷蓉

(山西省農(nóng)科院 畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030000)

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小鼠發(fā)情周期陰道上皮細(xì)胞形態(tài)變化的研究

靳 光，薛艷蓉

(山西省農(nóng)科院 畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030000)

為了區(qū)分小鼠發(fā)情周期各階段陰道內(nèi)部細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化，利用陰道組織涂片法，對6只成年實驗小白鼠連續(xù)6 d進(jìn)行陰道涂片、鏡檢，觀察陰道涂片中細(xì)胞的變化規(guī)律。結(jié)果表明，在小鼠發(fā)情周期各階段陰道涂片特征明顯，其中在發(fā)情前期，陰道涂片特征為形狀不規(guī)則或蝌蚪狀的有核上皮細(xì)胞占絕大多數(shù)，白細(xì)胞和角質(zhì)化上皮細(xì)胞很少。在發(fā)情期，陰道涂片特征幾乎全是片狀的無核角質(zhì)化細(xì)胞。在發(fā)情后期，陰道涂片特征為少量無核角質(zhì)化上皮細(xì)胞，白細(xì)胞占大多數(shù)。在發(fā)情間期，陰道涂片特征為上皮細(xì)胞少而皺縮，涂片中有大量白細(xì)胞。試驗結(jié)果表明，小鼠在整個發(fā)情周期過程中陰道內(nèi)部細(xì)胞組織形態(tài)會發(fā)生一系列變化，特征顯著，可以作為區(qū)分小鼠發(fā)情周期階段的一個簡便方法。

發(fā)情周期；陰道組織涂片；小鼠

小鼠是常用的醫(yī)學(xué)實驗動物，發(fā)情周期一般為5～6 d，根據(jù)其生理變化，可將發(fā)情周期劃分為4個時期，即發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和發(fā)情間期。嚙齒類動物在性周期的不同階段，陰道黏膜發(fā)生不同程度的變化，因此可一次判斷發(fā)情周期的不同階段。為了確定、區(qū)分小鼠各個發(fā)情階段，本實驗采用陰道組織涂片法，對己烯雌酚處理的小鼠，在發(fā)情周期各階段分別進(jìn)行陰道組織涂片觀察，以期探究小鼠發(fā)情周期陰道內(nèi)部細(xì)胞組織發(fā)育變化及形態(tài)特征，為區(qū)分小鼠發(fā)情周期階段提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

以6只雌性未孕小白鼠為實驗動物，在室溫、自然光照、自由飲水的條件下合籠飼養(yǎng)，采用全價顆粒飼料飼養(yǎng)。

1.2 實驗器材與藥品

顯微鏡、10 μL移液槍、1 mL注射器、鼠籠、蘇木精伊紅染液、生理鹽水、己烯雌酚等。

1.3 方法與步驟

1.3.1 誘導(dǎo)發(fā)情

取雌性小鼠4只，其中2只作對照，其余每只皮下注射己烯雌酚50 μg。待實驗鼠外陰部出現(xiàn)發(fā)情癥狀后，每天7：00時、15：00時、23：00時進(jìn)行陰道黏液涂片直到發(fā)情間期。整個實驗大約持續(xù)6 d。

1.3.2 陰道黏液涂片的制作

用右手小拇指和無名指夾住小鼠尾根，手背壓過小鼠背部，再用大拇指和食指握緊小鼠頸部背側(cè)和耳部的皮膚以完成小鼠的固定工作。移液槍插緊槍頭，吸取10 μL生理鹽水，打入小鼠陰道內(nèi)部，并來回抽吸數(shù)次，充分混勻后滴到載玻片中央，均勻涂開，在空氣中自然干燥。然后將干燥好的載玻片放到95%酒精里固定15 min，蘇木精染色15～30 min，自來水沖洗2 min，伊紅染色1 min，蒸餾水沖洗干凈剩余染料，封片鏡檢。

2 實驗結(jié)果

發(fā)情前期是發(fā)情間期向發(fā)情期的過渡，陰道涂片的特征為形狀不規(guī)則或蝌蚪狀的有核上皮細(xì)胞占絕大多數(shù)，白細(xì)胞和角質(zhì)化上皮細(xì)胞很少(圖1-A，圖2-A)；發(fā)情期陰道涂片的特征幾乎全是片狀的，無核角質(zhì)化細(xì)胞(圖1-B，圖2-B)；發(fā)情后期是發(fā)情期向發(fā)情間期的過渡，陰道涂片特征為少量無核角質(zhì)化上皮細(xì)胞，白細(xì)胞占大多數(shù)(圖1-C，圖2-C)；發(fā)情間期陰道涂片特征為上皮細(xì)胞少而皺縮，涂片中有大量白細(xì)胞(圖1-D，2-D)。

圖1 40x鏡下陰道涂片HE染色結(jié)果

圖2 100x鏡下陰道涂片HE染色結(jié)果

3 討論

小鼠陰道黏膜為復(fù)層扁平上皮，又稱為復(fù)層鱗狀上皮，由不同層數(shù)的細(xì)胞所組成，其細(xì)胞形狀由底部的立方狀逐漸轉(zhuǎn)變成表面的扁平狀。基底細(xì)胞可持續(xù)分裂，新形成的細(xì)胞會逐漸推向游離表面，之后便會脫落。在此過程中，細(xì)胞會先成熟然后再退化，表面細(xì)胞會有明顯的退化；這在核方面特別明顯，它們會逐漸變得致密、扁平，之后完全瓦解。

因此小鼠的發(fā)情周期是一個連續(xù)變化的周期性過程，所以各階段陰道脫落的細(xì)胞組成內(nèi)容也是逐漸轉(zhuǎn)變的，這在本實驗中發(fā)情期頻繁采樣觀察的結(jié)果中得到很好的體現(xiàn)。在發(fā)情前期，己烯雌酚未完全吸收入血，小鼠血液的己烯雌酚水平還未達(dá)到頂峰，陰道上皮細(xì)胞發(fā)育或成熟速度緩慢，脫落的上皮細(xì)胞仍以有核上皮細(xì)胞為主。當(dāng)處于發(fā)情期時，體內(nèi)的己烯雌酚水平達(dá)到最大，己烯雌酚刺激陰道上皮增厚，上皮細(xì)胞迅速生長發(fā)育，表面的細(xì)胞變得大而扁平，呈多邊形，有鈍角，成熟后退化，細(xì)胞核逐漸消失，此時上皮細(xì)胞合成和聚集的大量糖原會在陰道桿菌的作用下分解成乳酸，使陰道保持酸性，抑制病菌的生長繁殖。隨著己烯雌酚水平慢慢下降，上皮細(xì)胞的發(fā)育速度慢慢趨向正常，上皮變薄，在脫落掉剩余的發(fā)情期時過度成熟的無核上皮細(xì)胞后發(fā)生白細(xì)胞浸潤，防止由于糖原減少引起微生物感染，所以此時白細(xì)胞是此時陰道涂片主要的細(xì)胞成分，但仍有部分或較少的無核上皮細(xì)胞。

雖然陰道涂片法可以較明顯地區(qū)分小鼠發(fā)情周期各階段特征，但當(dāng)實驗鼠出現(xiàn)個別發(fā)情不明顯或個別發(fā)情階段特征不明顯的現(xiàn)象時，在各階段陰道脫落的細(xì)胞組成成分差別不大，比如本實驗中發(fā)情間期和發(fā)情后期的鏡檢結(jié)果，該方法便表現(xiàn)出一定的局限性，需要進(jìn)一步通過其他方法來確認(rèn)是否發(fā)情。在本實驗中影響實驗結(jié)果相關(guān)的實驗設(shè)計及實驗操作方面因素及注意事項有：

3.1 實驗安排

小鼠的發(fā)情周期不同于大鼠，發(fā)情周期內(nèi)各階段持續(xù)的時間也與大鼠有異，而且考慮到實驗鼠數(shù)量有限，可能存在的個體差異大的問題會影響實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，因此實驗并沒有完全按照資料上提供的數(shù)據(jù)安排小鼠陰道黏液采樣時間，而是根據(jù)每次涂片制作后的鏡檢結(jié)果來決定下次采樣時間。盡管小鼠的發(fā)情周期約為5～6 d，但陰道黏液變化最為明顯的時間則集中在前3天時間內(nèi)，所以本實驗在前3天內(nèi)的采樣次數(shù)比較集中，即每天3次采樣，后3天采樣則沒有如此頻繁，一天一采即可。

3.2 采樣

每次采樣時，小鼠陰道內(nèi)壁柔嫩，用槍頭吸取黏液時動作要輕柔，避免動作過大劃傷小鼠陰道，影響實驗結(jié)果觀察。

考慮到每次采樣對小鼠是強應(yīng)激刺激，勢必會影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，本實驗將實驗鼠分兩批采樣，有兩只實驗鼠在發(fā)情前期發(fā)情期時制作涂片，另外兩只鼠在發(fā)情后期時制作涂片，而當(dāng)4只實驗鼠處于發(fā)情間期時，均制作涂片。

3.3 涂片制作

因不同階段細(xì)胞組成成分不同，要保證細(xì)胞核充分染色，所以蘇木精染色時間較長。另外，15 min的染色時間并不固定，要根據(jù)染色效果實時調(diào)整。

[1] 魏泓. 醫(yī)學(xué)動物實驗學(xué)[M]. 成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社， 1998： 164-165.

[2] 南京醫(yī)學(xué)院，浙江醫(yī)科大學(xué)，上海第二醫(yī)科大學(xué).組織胚胎學(xué)(第3版)[M]. 南京： 科學(xué)技術(shù)出版社， 1990： 176-177.

[3] Chateau， Geiger J M， Samama B， et al. Vaginal keratinization during the estrous cycle in rats ： a model for evaluating retinoid activity [J]. Skin Pharmacol， 1996， 9： 9-16.

[4] Yamaguchi Y， Brenner M， Hearing V J. The regulation of skin pigmentation [J]. Biol Chem， 2007， 282(38)： 27557-61.

2016-08-29

靳光(1981-)，男，助理研究員，主要研究方向為動物醫(yī)學(xué)。

S814.3

A

1005-2739(2016)06-0006-03