耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的OXA酶基因研究*

陸丹倩，芮勇宇，楊 秋，顧向明，鄧 沖，王巧媚，鄧聚輝，劉美嫦

(1.廣東省中山市中醫(yī)院檢驗(yàn)科 528400；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州 510515；3.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東湛江 523770)

?

·論 著·

耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的OXA酶基因研究*

陸丹倩1，芮勇宇2，楊 秋2，顧向明1，鄧 沖1，王巧媚1，鄧聚輝1，劉美嫦3

(1.廣東省中山市中醫(yī)院檢驗(yàn)科 528400；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州 510515；3.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東湛江 523770)

目的 研究廣東省中山市中醫(yī)院分離耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌(CRAB)耐藥性、苯唑西林(OXA)酶基因及流行特性。 方法 收集廣東省中山市中醫(yī)院2012年7月至2013年12月臨床分離40株CRAB，采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)藥敏試驗(yàn)，改良Hodge試驗(yàn)篩查碳青霉烯酶；用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法對(duì)β-內(nèi)酰胺酶基因oxa-23、oxa-24、oxa-51和oxa-58進(jìn)行擴(kuò)增、序列分析。結(jié)果 40株CRAB對(duì)16種藥物中，對(duì)多黏菌素和米諾環(huán)素敏感性最高，耐藥率小于或等于5.0%；改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性29株(占72.5%)；所有菌株均被檢測(cè)到含有oxa-51基因(占100.0%)，oxa-23基因?yàn)?8株(占95.0%)，未檢出oxa-24和oxa-58基因。結(jié)論 oxa-51及oxa-23基因是廣東省中山市中醫(yī)院流行CRAB的主要基因型。

耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌； 改良Hodge試驗(yàn)； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 苯唑西林

近年來(lái)，鮑曼不動(dòng)桿菌成為醫(yī)院感染的重要病原菌[1-2]，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(MDRAB)菌株和耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌(CRAB)的分離比例逐年升高[3-4]。鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)碳青霉烯酶水解酶，且碳青霉烯酶主要為D類苯唑西林(OXA) 酶[5]。OXA酶僅見(jiàn)于不動(dòng)桿菌，其對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物高度耐藥，能降低外膜蛋白表達(dá)或外排系統(tǒng)增強(qiáng)，產(chǎn)生多重耐藥。OXA酶主要包括4組：OXA-23型、OXA-24型、OXA-51型和OXA-58型[6]。筆者對(duì)廣東省中山市中醫(yī)院2012年7月至2013年12月臨床分離40株CRAB的耐藥現(xiàn)狀及其OXA酶基因攜帶情況進(jìn)行研究，以了解其是否存在突變、突變對(duì)耐藥性的影響，摸清醫(yī)院CRAB的耐藥機(jī)制及流行克隆情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 40株CRAB來(lái)自廣東省中山市中醫(yī)院2012年7月至2013年12月住院患者送檢痰液、傷口分泌物、中段尿及血液標(biāo)本，同一患者留取初次分離菌株。采用美國(guó)BD公司Phoenixtm 100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對(duì)所有菌株進(jìn)行分離。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853均由國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.2 抗菌藥物 用于紙片擴(kuò)散法(K-B法)藥敏試驗(yàn)的抗菌藥物共17種：米諾環(huán)素、多黏菌素B、頭孢哌酮/舒巴坦、左氧氟沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、氨芐西林/舒巴坦、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、四環(huán)素、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林、阿米卡星、慶大霉素、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢西丁。藥敏紙片均為英國(guó)oxiod公司產(chǎn)品，MH平板均購(gòu)自江門(mén)凱林公司。

1.3 儀器與試劑 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增儀器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，凝膠成像儀購(gòu)自Bio-Rad公司。dNTPs、TaqDNA、聚合酶、蛋白酶K和 DNA Marker由大連瑞真生物技術(shù)有限公司提供。PCR引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、10%十二烷基磺酸鈉購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)。

1.4 碳青霉烯酶檢測(cè) 采用改良Hodge試驗(yàn)，以0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏拇竽c埃希菌ATCC25922菌懸液涂布MH平板，中間貼10 μg/片美羅培南紙片，將測(cè)試菌用接種環(huán)以美羅培南紙片為中心向平板邊緣劃接種線(注意不要?jiǎng)澠破桨灞砻?。35 ℃孵育18～24 h后觀察結(jié)果，美羅培南抑菌圈處出現(xiàn)變形者為待測(cè)菌產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.5 OXA酶基因檢測(cè) 反應(yīng)總體系為20 μL：含Mg2+的10×buffer 2 μL，dNTP 終水平為200 μmol/L，上下游引物分別為0.2 μmol/L，模板DNA 1 μL，TaqDNA聚合酶1 U，用滅菌去離子水加至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，50～60 ℃退火并延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。具體退火溫度，見(jiàn)表1。電泳PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×Loading buffer上樣緩沖液混勻，在1%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳30 min(緩沖液為0.5×TBE，電壓為5 V/cm)。通過(guò)凝膠成像儀讀取電泳結(jié)果。DNA Marker為DL2000。

表1 OXA酶基因PCR引物

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本來(lái)源及臨床分布 40株CRAB標(biāo)本來(lái)源痰液29株(占72.5%)、傷口分泌物9株(占22.5%)、靜脈血1株(占2.5%)及中段尿1株(占2.5%)；臨床分布重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)18株(占45.0%)、內(nèi)科10株(占25.0%)、骨科7株(占17.5%)、外科5株(占12.5%)。

2.2 耐藥性分析 40株CRAB對(duì)常用17種抗菌藥物的耐藥性分布，見(jiàn)表2。

表2 40株CRAB對(duì)17種抗菌藥物的耐藥率(%)

2.3 碳青霉烯酶檢測(cè) 改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果，40株CRAB的改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果顯示，陽(yáng)性29株(占72.5%)呈矢狀生長(zhǎng)，陰性11株(占27.5%)。

2.4 OXA酶基因檢測(cè)結(jié)果 40株CRAB中，40株oxa-51陽(yáng)性(占100.0%)，38株oxa-23陽(yáng)性(占95.0%)，未檢出oxa-24和oxa-58。電泳結(jié)果，見(jiàn)圖1。

注：圖1A為oxa-51電泳結(jié)果，圖1B為oxa-23電泳結(jié)果。

3 討 論

目前，鮑曼不動(dòng)桿菌臨床檢出率逐年升高，以呼吸道感染最常見(jiàn)[4,7-8]。本研究顯示，其以呼吸道感染為主(占72.5%，29/40)，其次為傷口感染(占22.5%，9/40)、血流感染(占2.5%，1/40)和泌尿系感染(占2.5%，1/40)。提示鮑曼不動(dòng)桿菌在呼吸系統(tǒng)容易引起感染或定植，難以清除。分布科室主要是以ICU為主[9-10]，可能與ICU患者住院時(shí)間長(zhǎng)、病情嚴(yán)重、機(jī)體免疫功力差、大量使用廣譜抗菌藥物及各種侵入性檢查和治療等有關(guān)。

耐藥性分析顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥情況嚴(yán)重，呈多重耐藥和泛耐藥。目前，廣東省中山市中醫(yī)院40株CRAB對(duì)多黏菌素B、米諾環(huán)素敏感性最高，耐藥率分別為2.5%、5.0%，對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為20.0%，故上述3種藥物可作為CRAB感染的治療選擇。其他13種抗菌藥物耐藥率為55%～100%，表明CRAB耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，臨床應(yīng)嚴(yán)格控制抗菌藥物應(yīng)用，減少鮑曼不動(dòng)桿菌感染。

鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶是其主要耐藥機(jī)制。碳青霉烯酶主要包括A、B和D等3類酶，主要為產(chǎn)D類酶(OXA 酶)，僅見(jiàn)于不動(dòng)桿菌。國(guó)內(nèi)流行耐藥基因?yàn)閛xa-23和oxa-51[11-13]。本試驗(yàn)檢測(cè)40株CRAB的OXA酶基因，結(jié)果顯示所有菌株均攜帶有oxa-51(占100.0%)，38株oxa-23陽(yáng)性(占95.0%)，未檢測(cè)到oxa-24和oxa-58，說(shuō)明廣東省中山市鮑曼不動(dòng)桿菌的基因型是以oxa-51和oxa-23為主，與國(guó)內(nèi)流行相符。oxa-51是鮑曼不動(dòng)桿菌的重要標(biāo)志，也是鮑曼不動(dòng)桿菌的固有基因[14]，可用以區(qū)別于其他不動(dòng)桿菌屬；水解碳青霉烯酶類藥物能力較弱，不能水解頭孢菌素類藥物[15]。oxa-23能介導(dǎo)細(xì)菌耐碳青霉烯類藥物，是目前流行傳播最廣的D類碳青霉烯類基因。40株CRAB中有29株改良Hodge試驗(yàn)表型檢測(cè)為陽(yáng)性(占72.5%)，11株表型檢測(cè)為陰性(占27.5%)，可能由于基因表達(dá)水平受諸多因素影響，低水平表達(dá)時(shí)表型無(wú)法檢測(cè)而呈陰性。

本研究表明，廣東省中山市中醫(yī)院CRAB對(duì)常用抗菌藥物耐藥情況嚴(yán)重，最主要碳青霉烯酶基因型為oxa-23，存在克隆傳播流行。因此，醫(yī)院應(yīng)規(guī)范臨床合理使用抗菌藥物，加強(qiáng)對(duì)本地區(qū)CRAB耐藥性及耐藥機(jī)制的監(jiān)測(cè)及關(guān)注，加強(qiáng)手衛(wèi)生、患者隔離、環(huán)境清潔消毒等感控措施，其對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥、避免CRAB醫(yī)院感染暴發(fā)流行具有重要意義。

[1]汪復(fù),朱德妹,胡付品,等.2012年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志,2013,13(5):321-330.

[2]胡付品,朱德妹,汪復(fù),等.2013年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志,2014,14(5):365-374.

[3]楊均均,黃文祥,史芳靜,等.耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌流行特征及耐藥基因分析[J].中國(guó)抗生素雜志,2012,37(5):343-347.

[4]吳偉元,金曉菲,吳詩(shī)品,等.深圳市人民醫(yī)院近8年耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌感染特征及其克隆變遷[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2015,95(8):585-590.

[5]王輝,孫宏莉,廖康,等.北京和廣州地區(qū)四家醫(yī)院不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶基因型研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,28(6):636-641.

[6]Jan WJ,Hoiby N.OXA-type carbapenemases[J].J Antimiccrob Chemother,2006,57(3):373-383.

[7]孫晴,張正銀.臨床分離廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌同源性分析及常見(jiàn)耐藥基因檢測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志,2015,15(1):28-31.

[8]王娟,宋立強(qiáng),王磊,等.下呼吸道感染廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性分析和部分碳青霉烯酶基因檢測(cè)[J].國(guó)際呼吸雜志,2015,35(2):87-90.

[9]毛璞,李建春,邱桂霞,等.重癥監(jiān)護(hù)病房耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制研究[J].中國(guó)感染與化療雜志,2015,15(3):253-256.

[10]葉繼輝,李超芬,丁群力.亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌醫(yī)院感染危險(xiǎn)因素分析[J].浙江醫(yī)學(xué),2015,37(4):300-303.

[11]楊正海,李小寧.碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌OXA酶基因研究[J].中國(guó)抗生素雜志,2015,40(3):203-207.

[12]李茜,李慶淑,李智,等.青島兩所醫(yī)院鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶基因及同源性分析[J].中國(guó)感染控制雜志,2015,14(7):437-442.

[13]劉超梅,李雪梅,陳志英,等.呼和浩特地區(qū)耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性及OXA 基因檢測(cè)[J].中國(guó)感染控制雜志,2015,14(5):289-293.

[14]鐘敏,黃文芳.耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)OXA酶的研究進(jìn)展[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2013,25(1):122-125.

[15]Brown S,Young HK,Amyes SGB.Characterization of oxa-51,a novelclass D carbapenemase found in genetically unrelated clinical strains of Acinetobacter baumannii from Argentina[J].Clin Microbiol Infect,2005,11(1):15-23.

Research on OXA carbapenemases gene of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii*

LUDanqian1,RUIYongyu2,YANGQiu2,GUXiangming1,DENGChong1,WANGQiaomei1,DENGJuhui1,LIUMeichang3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ZhongshanMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Zhongshan,Guangdong528400,China;2.NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China;3.GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang,Guangdong523770,China)

Objective To investigate the drug resistance of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii(CRAB) clinically isolated from hospital,OXA carbapenemases gene and epidemiological characteristics.Methods A total of 40 clinically isolated strains of CRAB were collected in this hospital from July 2011 to December 2012.oxa-23,oxa-24,oxa-51 and oxa-58 were amplified and sequenced by adopting the PCR method.Results Forty strains of CRAB had the highest sensitivity to polymyxin B and minocycline among 16 kinds of drugs,with the resistance rate less than 5.0%;29 strains(72.5%) were positive in the modified Hodge test;the oxa-51 gene was detected in all strains,accounting for 100.0%,in which 38 strains(95.0%) contained oxa-23 gene,no oxa-24 and oxa-58 genes were detected.Conclusion oxa-51 and oxa-23 genes are the main genotypes of epidemic CRAB in Zhongshan Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine.

CRAB; modified Hodge test; PCR; OXA

廣東省中山市科技局基金資助項(xiàng)目(2014A1FC052)。

陸丹倩，女，副主任技師，主要從事臨床微生物學(xué)方面的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.006

A

1673-4130(2016)22-3108-03

2016-04-11

2016-06-17)