基于陽(yáng)離子型共軛聚合物和核酸適配體的高靈敏鉛離子快速檢測(cè)方法

劉興奮+王亞騰+華笑笑+黃艷琴+馮曉苗+范曲立+黃維

摘 要 建立了基于主鏈含芴的陽(yáng)離子型對(duì)芳撐乙炔衍生物（poly{[9，9bis（6′（N，N，Ndiethylmethyl ammonium）hexyl）2，7fluorenyleneethynylene]altco[2，5bis（3′（N，N，Ndiethylmethylammonium）1′oxapropyl）1，4phenylene]tetraiodide}， PFEP）和核酸適配體快速檢測(cè)Pb2+的新方法。使用選擇性更高的核酸適配體序列，有效降低了Hg2+對(duì)Pb2+檢測(cè)的干擾，提高了檢測(cè)的選擇性和靈敏度。用于識(shí)別Pb2+的核酸探針（TBAA）末端用熒光素標(biāo)記（5′6FAMGGAAGGTGTGGAAGG3′）。當(dāng)其與Pb2+發(fā)生特異性結(jié)合時(shí)，形成電荷密度高于單鏈DNA的G四鏈體結(jié)構(gòu)，與PFEP之間的靜電作用增強(qiáng)，使能量供體（聚合物）與受體（熒光素）之間的距離拉近，發(fā)生更高效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer， FRET）。其它金屬離子由于不能和TBAA結(jié)合，且金屬離子本身對(duì)聚合物和熒光素的熒光有一定程度的猝滅，因此其FRET信號(hào)遠(yuǎn)低于空白對(duì)照。本方法快速、靈敏，幾分鐘內(nèi)即可完成檢測(cè)，常見(jiàn)金屬離子均不干擾檢測(cè)。對(duì)湖水中Pb2+的檢測(cè)限為1 nmol/L，遠(yuǎn)低于飲用水國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)Pb2+濃度的限量標(biāo)準(zhǔn)。本方法為水中Pb2+的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便、快速、高效的新方法。

關(guān)鍵詞 陽(yáng)離子型共軛聚合物； 核酸適配體； 鉛離子； 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

20160105收稿；20160419接受

本文系國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（ No. 2012CB933301、2012CB723402）、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Nos. 21005040、51173080）、"有機(jī)與生物光電子學(xué)"教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（No. IRT1148）、江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20141424）、江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（CXLX12_0792）及南京郵電大學(xué)校科研項(xiàng)目（NY215171）資助

Email： iamxfliu@njupt.edu.cn

1 引 言

鉛離子（Pb2+）是一種常見(jiàn)環(huán)境污染物，具有很強(qiáng)的毒性，極少量的Pb2+就會(huì)對(duì)大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重的損害[1]。進(jìn)入環(huán)境中的Pb2+不易降解， 很容易聚積并污染空氣、水源和土壤。傳統(tǒng)的Pb2+檢測(cè)方法，如原子吸收光譜[2]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜[3]、電化學(xué)伏安檢測(cè)[4]等，具有較高的靈敏度，但存在樣品預(yù)處理復(fù)雜或需要昂貴儀器等不足。因此，開(kāi)發(fā)低成本、快速、靈敏的Pb2+檢測(cè)新方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境中Pb2+的快速檢測(cè)和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，具有重要的實(shí)際意義。

核酸適配體是一類(lèi)DNA或RNA寡聚核苷酸，能特異性識(shí)別金屬離子[5]、有機(jī)小分子[6]、蛋白質(zhì)[7]、病毒[8]、細(xì)菌[9]，甚至整個(gè)細(xì)胞[10]。與傳統(tǒng)的識(shí)別分子（如抗體）相比，具有易合成、易標(biāo)記、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。文獻(xiàn)已報(bào)道了基于核酸適配體的各種光學(xué)、電化學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Pb2+ [11]、K+ [12]、腺苷三磷酸（ATP）[13]、可卡因[14]、神經(jīng)毒劑[15]、生長(zhǎng)因子[16]、凝血酶[17，18]、細(xì)菌[19]及腫瘤細(xì)胞[20]等的高靈敏檢測(cè)。凝血酶的核酸適配體（TBA， 5′GGTTGGTGTGGTTGG3′）為一段富含鳥(niǎo)嘌呤（G）的15個(gè)堿基的序列，在凝血酶存在時(shí)可形成G四鏈體結(jié)構(gòu)[21]。TBA也可用于Pb2+的檢測(cè)[22]。然而，由于該序列含有較多胸腺嘧啶堿基（T），可與Hg2+形成THg2+T發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而干擾對(duì)目標(biāo)Pb2+的檢測(cè)[23]。采用CN、SCN等掩蔽劑結(jié)合Hg2+，可以提高對(duì)Pb2+檢測(cè)的選擇性。但是，這些掩蔽劑具有較高毒性，很容易污染環(huán)境[23，24]。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Lu等[23]對(duì)TBA序列進(jìn)行了改進(jìn)，將其中的4個(gè)胸腺嘧啶（T）分別用腺嘌呤（A）代替（TBAA， 5′GGAAGGTGTGGAAGG3′）。由于A不能與Hg2+結(jié)合，因此該序列可以特異性結(jié)合Pb2+，但不能結(jié)合Hg2+，有效降低了Hg2+的干擾。

水溶性共軛聚合物為一類(lèi)新型的熒光傳感材料，具有良好的光捕獲能力和熒光發(fā)射特性，可作為優(yōu)良的能量供體，通過(guò)與能量受體之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），將熒光信號(hào)放大幾倍至幾百倍，大大提高檢測(cè)的靈敏度[25]，已廣泛應(yīng)用于生物傳感[26]領(lǐng)域。本研究建立了基于主鏈含芴的陽(yáng)離子型聚對(duì)芳撐乙炔衍生物與熒光素標(biāo)記的核酸適配體TBAA之間FRET原理的Pb2+快速檢測(cè)新方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)湖水中Pb2+的快速、靈敏、簡(jiǎn)便檢測(cè)。檢出限為1 nmol/L，大大低于我國(guó)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)水中Pb2+的限量要求（< 0.01 mg/L 或48 nmol/L）[27]。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

RF5301PC型熒光光譜儀（日本島津公司）。熒光素標(biāo)記的核酸探針TBAA由上海生工生物工程有限公司合成，序列為5′6FAMGGAAGGTGTGGAAGG3′。主鏈含芴的陽(yáng)離子型聚對(duì)芳撐乙炔衍生物（Poly{[9，9bis（6′（N，N，Ndiethylmethylammonium）hexyl）2，7fluorenyleneethynylene]altco[2，5bis（3′（N，N，Ndiethylmethylammonium）1′oxapropyl）1，4phenylene]tetraiodide}， PFEP）為課題組自行合成[28]，濃度用其單體濃度表示。NaCl， KCl， ZnCl2和PbCl2等（分析純）購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司。緩沖溶液為20 mmol/L TrisHCl， 100 mmol/L NaCl， pH 7.4。實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ（美國(guó)Millipore公司）超純水（18.2 MΩ cm）。湖水取自江蘇省南京市羊山湖，過(guò)濾離心后用于檢測(cè)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 可行性實(shí)驗(yàn) 在4 μL，100 nmol/L 的Pb2+和Hg2+溶液中，分別加入4 μL 1 μmol/L TBAA溶液和6 μL 5 μmol/L的PFEP溶液，最后加入緩沖液至總體積為400 μL，混勻后進(jìn)行熒光測(cè)量。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，響應(yīng)時(shí)間2 s，電壓900 V。激發(fā)波長(zhǎng)404 nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍410～700 nm。用相同體積的緩沖溶液作為空白樣品。

2.2.2 特異性實(shí)驗(yàn) 分別取4 μL 1 mol/L的 Li+， Na+， K+， Ca2+， Mg2+溶液； 100 μmol/L的Ba2+， Fe2+， Co2+， Ni2+， Cu2+， Zn2+， Cd2+； 濃度為10 μmol/L的 Hg2+，以及100 nmol/L的Pb2+進(jìn)行檢測(cè)。配制不含Pb2+的上述離子的混合溶液，以及含有Pb2+的上述混合離子溶液，分別進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)條件與2.2.1節(jié)相同。

2.2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn) 取4 μL濃度分別為0.02， 0.1， 0.5， 1.0， 2.0， 4.0， 8.0和10 μmol/L的Pb2+溶液，按照2.2.1節(jié)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定3次。

取4 μL 濃度分別為0.02， 0.1， 0.5， 1.0 μmol/L 的Pb2+溶液，各加入4 μL 1.0 μmol/L TBAA溶液，然后加入適量湖水進(jìn)行檢測(cè)，其它條件與2.2.1節(jié)相同，重復(fù)測(cè)定3次。

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)原理

TBAA探針5′端標(biāo)記了熒光素（FAM），富含鳥(niǎo)嘌呤（G）堿基，在Pb2+存在下可形成G四鏈體結(jié)構(gòu)。當(dāng)體系中不存在Pb2+時(shí)，TBAA以柔性自由卷曲的單鏈形式存在。由于DNA帶負(fù)電荷，共軛聚合物（PFEP）帶正電荷，二者可通過(guò)靜電吸引作用形成復(fù)合物，能量供體（PFFP）與受體（FAM）之間發(fā)生一定程度的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Low FRET）。當(dāng)體系中存在Pb2+時(shí)，TBAA可形成G四鏈體結(jié)構(gòu)。這種折疊結(jié)構(gòu)的G四鏈體比單鏈DNA具有更高的電荷密度[29]。因此，結(jié)合Pb2+后的G四鏈體與共軛聚合物之間的結(jié)合更強(qiáng)，F(xiàn)RET效率顯著提高（High FRET）。通過(guò)共軛聚合物與不同構(gòu)象DNA靜電結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的FRET信號(hào)的不同，可實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb2+的特異性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。

3.2 可行性研究

PFEP為一種主鏈含芴的陽(yáng)離子型聚對(duì)芳撐乙炔衍生物。如圖2所示，PFEP的吸收峰位于380 nm， 熒光發(fā)射峰位于443和465 nm；FAM的吸收峰位于488 nm，發(fā)射峰位于531 nm。因此，PFEP的熒光發(fā)射峰與FAM的吸收峰之間具有很好的光譜重疊，在合適的條件下可發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。前期研究[17，30]表明，由于DNA與PFEP聚合物之間強(qiáng)烈的靜電吸引作用，使熒光素和聚合物之間距離靠近，二者之間可發(fā)生高效的FRET。

以Hg2+溶液為陰性對(duì)照，對(duì)一定濃度的Pb2+溶液進(jìn)行檢測(cè)。與空白樣品相比，含金屬離子的樣品中，PFEP的發(fā)射峰發(fā)生了約3 nm的藍(lán)移。將熒光光譜圖按照440 nm附近的最大熒光強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理，二者發(fā)生FRET的信號(hào)用531 nm和440 nm處的熒光強(qiáng)度比值（I531/I440）表示。如圖3所示，空白樣品的I531/I440為0.93；Hg2+樣品為0.76，比空白樣品降低18%；而Pb2+的FRET信號(hào)明顯增強(qiáng)，I531/I440為1.46，比空白樣品增加57%。從圖3A可見(jiàn)，與空白樣品相比，含有Hg2+ 和Pb2+的體系中，PFEP位于443 nm的主發(fā)射峰有一定程度的展寬，465 nm處的次發(fā)射峰明顯增強(qiáng)，這可能是由于金屬陽(yáng)離子增強(qiáng)了DNA與聚合物之間的相互作用。此外，含有Hg2+的樣品的發(fā)射光譜藍(lán)移了3 nm，這是由于PFEP與G四鏈體的結(jié)合引起的。Hg2+溶液的FRET信號(hào)低于空白組的信號(hào)，這可能是由于金屬離子對(duì)PFEP的熒光有一定程度的猝滅[31～33]。

3.3 特異性研究

實(shí)際樣品中常含有各種離子，為了研究離子是否會(huì)影響體系的熒光，進(jìn)而影響Pb2+的檢測(cè)，首先分析了3組不同濃度共13種常見(jiàn)金屬離子對(duì)PFEP和熒光素的熒光猝滅作用。第一組為L(zhǎng)i+， Na+， K+， Ca2+和Mg2+，濃度各為10 mmol/L；第二組為Ba2+， Fe2+， Co2+， Ni2+， Cu2+， Zn2+和Cd2+，濃度各為1.0 μmol/L； 第三組為Hg2+和Pb2+，濃度為100 nmol/L。研究表明，各種金屬離子本身對(duì)PFEP和熒光素的熒光都有一定程度的猝滅作用。其中，各種離子對(duì)熒光素的猝滅程度約為2%～18%，Pb2+的猝滅程度為13%。各種離子對(duì)PFEP熒光的猝滅稍強(qiáng)，猝滅程度為16%～38%，Pb2+的猝滅最小，為16%。這可能是對(duì)照樣品的FRET信號(hào)低于空白樣品的原因。

為評(píng)價(jià)方法的特異性，將上述濃度的13種金屬離子，與1 nmol/L Pb2+樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4A所示。Pb2+的I531/I440平均值為1.66，明顯高于空白樣品；而其它對(duì)照離子的FRET信號(hào)（I531/I440 =0.30～0.54）均明顯低于空白組（I531/I440=1.0）。一方面是由于除Pb2+以外的其它離子均不能和TBAA形成G四鏈體；另一方面是由于各種金屬離子本身對(duì)PFEP和熒光素的熒光的猝滅作用，致使PFEP和熒光素的熒光都比無(wú)金屬離子時(shí)低，因而能量轉(zhuǎn)移效率也降低。對(duì)由上述離子構(gòu)成的混合體系（Mix，離子種類(lèi)及濃度與上述相同）及含Pb2+（1.0 nmol/L）的混合體系進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖4B所示。Mix樣品的FRET信號(hào)低于空白樣品和含有Pb2+的樣品，并且含有Pb2+的混合體系（Mix+Pb2+）產(chǎn)生的信號(hào)略低于相同濃度的單獨(dú)的Pb2+的檢測(cè)信號(hào)（降低了8.7%）?？梢?jiàn)，雖然其它金屬離子對(duì)體系的熒光有一定程度的猝滅作用，但并不影響對(duì)復(fù)雜體系中Pb2+的檢測(cè)，本方法檢測(cè)Pb2+具有較好的選擇性。

3.4 傳感器的分析性能

不同濃度Pb2+（0， 0.2， 1.0， 5.0， 10， 20， 40， 80和100 nmol/L）的熒光響應(yīng)曲線(xiàn)如圖5A和5B所示。歸一化的熒光光譜圖（圖5A）顯示，隨著Pb2+濃度增加，F(xiàn)RET信號(hào)逐漸增強(qiáng)。當(dāng)Pb2+濃度大于80 nmol/L時(shí)，F(xiàn)RET信號(hào)基本趨于穩(wěn)定；在1～20 nmol/L范圍內(nèi)，Pb2+濃度與FRET信號(hào)具有較好的線(xiàn)性關(guān)系（R2=0.978），檢出限為 0.2 nmol/L（3σ）。為進(jìn)一步研究本方法對(duì)復(fù)雜體系中Pb2+的檢測(cè)性能，以湖水（經(jīng)原子吸收光譜測(cè)定，未檢出Pb2+）為基質(zhì)，對(duì)不同濃度Pb2+（0， 0.2， 1.0， 5.0和10 nmol/L）進(jìn)行檢測(cè)，如圖5C和5D所示。隨著Pb2+濃度增加，F(xiàn)RET信號(hào)呈線(xiàn)性增加。對(duì)湖水中Pb2+的檢出限為1 nmol/L（3σ）。上述結(jié)果表明，本方法可用于實(shí)際水體系中Pb2+的定量檢測(cè)。

將本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的幾種基于共軛聚合物或TBA探針的熒光傳感器綜合性能進(jìn)行了比較，如表1所示?；赑b2+本身對(duì)共軛聚合物熒光猝滅作用的傳感器，通常使用特殊結(jié)構(gòu)的共軛聚合物（如含冠醚基團(tuán)的聚合物）[34～37]，檢測(cè)Pb2+時(shí)具有高特異性，Hg2+的干擾很小，但是靈敏度普遍不高?；诟籊的TBA探針的熒光傳感器[5，22，38]具有較高的靈敏度，但Hg2+對(duì)檢測(cè)有干擾， 本研究建立的以TBAA為識(shí)別探針，通過(guò)與共軛聚合物之間的FRET實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的光學(xué)檢測(cè)方法，不僅可實(shí)現(xiàn)快速（幾分鐘）檢測(cè)，而且具有很高的選擇性和靈敏度。對(duì)湖水中Pb2+的檢出限可達(dá)1 nmol/L，遠(yuǎn)低于飲用水國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[27]對(duì)Pb2+的限量水平（<0.01 mg/L或<48 nmol/L），可以滿(mǎn)足日常檢測(cè)的需要。

4 結(jié) 論

建立了基于主鏈含芴的陽(yáng)離子型聚對(duì)芳撐乙炔衍生物PFEP和核酸適配體的Pb2+檢測(cè)新方法，利用只含2個(gè)T的核酸適配體序列TBAA，有效降低了Hg2+對(duì)Pb2+檢測(cè)的干擾。其它常見(jiàn)金屬離子對(duì)檢測(cè)基本無(wú)干擾。利用PFEP和熒光染料之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，大大提高了檢測(cè)的靈敏度，對(duì)湖水中Pb2+的檢出限可達(dá)1 nmol/L， 有望為各種水源中Pb2+的檢測(cè)提供一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的新方法。

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Abstract A sensitive method for Pb2+ detection based on a cationic conjugated polymer and aptamer was established. By selecting a more specific aptamer probe， the interference of Pb2+ detection from Hg2+ was eliminated remarkably. The probe for Pb2+ recognition and combination is a single stranded oligonucleotide labeled with fluorescein （TBAA， 5′6FAMGGAAGGTGTGGAAGG3′）. When combining with Pb2+ with high specificity， the random coiled probe changed to a Gquadruplex with higher charge density， which enhanced the electrostatic interactions between the oligonucleotide and cationic conjugated polymer， thus the two fluorophores were in more close proximity， leading to a significantly increased fluorescence resonance energy transfer （FRET） signal. However， other nontarget metal ions produced much lower FRET signals because they could not combine with the probe and thus quenched the fluorescence of the conjugated polymer and fluorescein. This method was rapid， highly specific and sensitive， and the common metal ions including Li+， Na+， K+， Ca2+， Mg2+， Ba2+， Fe2+， Co2+， Ni2+， Cu2+， Zn2+， Cd2+ and Hg2+ exhibited no influence on the detection of Pb2+ . The limit of detection for Pb2+ in lake water was estimated to be 1 nmol/L （3σ）， which was far below the maximum permitted level of Pb2+ in drink water regulated by the national standard for drinking water quality. Therefore， this FRETbased method provides a new simple， rapid， and efficient method for detection of Pb2+ in various source of water.

Keywords Cationic conjugated polymer； Aptamer； Lead ion ； Fluorescence resonance energy transfer