• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于高通量測序的野生毛葡萄轉錄組數(shù)據(jù)分析

    2016-12-08 19:03:19方輝蔣勝理曲俊杰周思泓
    湖北農(nóng)業(yè)科學 2016年18期
    關鍵詞:核苷酸高通量葡萄

    方輝++蔣勝理++曲俊杰++周思泓

    摘要:利用RNA-seq技術對所構建的野生毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)葉片的轉錄組進行測定,對原始reads進行過濾和組裝,得到了35 238條質量較高的unigene,平均長度為1 081 nt,N50為1 735 nt?;贜CBI蛋白質數(shù)據(jù)庫(Nr)、蛋白質序列數(shù)據(jù)庫(Swiss-Prot)、京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫和直系同源基因簇(COG)進行相似性比對,共注釋了26 751條unigene,另有8 487條unigene未被注釋。物種同源性顯示與葡萄的同源性最高為74.48%。利用COG數(shù)據(jù)庫將unigene分成25類,通過GO分類和KEGG富集性分析,將unigene分別歸類于44個GO類別和122個代謝途徑。此外,在35 238條unigene中共搜索到4 428個SSR位點,二核苷酸的SSR數(shù)目最多(1 906條),其次為三核苷酸(1 762條)。這些信息為毛葡萄功能基因、相關候選基因的發(fā)掘以及分子標記輔助育種提供了重要依據(jù)。

    關鍵詞:毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd);轉錄組;高通量測序

    中圖分類號:S663.1 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2016)18-4827-05

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.050

    野生毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)是葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(Vitis)真葡萄亞屬(Euvitis)東亞種群,盛產(chǎn)于中國,是中國葡萄屬東亞種群中分布最廣的一個野生種[1]。廣西壯族自治區(qū)作為中國野生毛葡萄之鄉(xiāng)和中國野生毛葡萄酒原產(chǎn)地,在桂中、桂北、桂西的喀斯特地貌地區(qū)野生毛葡萄較集中。野生毛葡萄含多種維生素、各種氨基酸、礦物質等營養(yǎng)物質,還含有豐富的花色素雙糖苷、超氧化歧化酶(SOD)及白藜蘆醇(RES)物質,具有軟化血管、抗衰老、防癌的作用[2]。多數(shù)野生毛葡萄表現(xiàn)抗逆性強、耐病性好、耐南方高溫多雨潮濕天氣、耐旱耐瘠等優(yōu)良特性,是南方石漠化治理、生態(tài)重建的優(yōu)良樹種,具有重要的經(jīng)濟價值[3,4]。目前對毛葡萄的研究主要集中在栽培技術和雜交育種方面,缺乏對其分子生物學方面的研究,對其基因信息的研究極少。

    轉錄組是在特定發(fā)育階段和一定生理條件下,細胞內所有轉錄出來的RNA的集合。通過高通量的轉錄組分析,可以獲得機體在生命過程中基因的表達模式[5]。RNA-seq是2008年建立起來的基于深度測序的轉錄組分析技術,它能夠在單核苷酸水平上對任何物種進行整體轉錄活動的檢測,是當前在全基因組水平上研究基因表達模式的主要技術[6]。本研究擬采用RNA-seq技術對所構建的毛葡萄葉片的轉錄組進行測定,并在基因組水平上進行轉錄組分析,旨在獲得毛葡萄更多的轉錄本和更為全面的轉錄組信息,為重要性狀相關基因的克隆及功能分析、鑒定次級代謝物生物合成相關基因奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    植物材料為毛葡萄五峒-1,生長于廣西壯族自治區(qū)河池市都安瑤族自治縣高嶺鎮(zhèn)五峒村,樹齡數(shù)十年、生長旺盛,葉片生長狀況良好,果實產(chǎn)量高,經(jīng)調查與試驗發(fā)現(xiàn)其對多種病害高抗或免疫。采集后液氮速凍,并轉移至-80 ℃水箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 方法

    1.2.1 野生毛葡萄測序 采取野生毛葡萄的嫩葉并提取總RNA,送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行文庫構建與高通量測序,測序平臺為Illumina HiSeq TM 2000,每個樣品測序量約為4.75 G。

    1.2.2 測序數(shù)據(jù)的組裝 對測序后得到的原始數(shù)據(jù)total raw reads進行質量分析,去除重復、含接頭、測序質量低的reads,獲得clean reads。使用短reads組裝軟件Trinity做轉錄組從頭組裝[7]。首先將具有一定長度重疊的reads連成更長的片段,通過reads重疊關系得到組裝片段contig。然后將reads比對回contig,通過paired-end reads確定來自同一轉錄本的不同contig以及這些contig間的距離,Trinity軟件將這些contig連在一起,最后得到兩端不能再延長的序列,即為unigene。

    1.2.3 功能注釋 利用Blastx將unigene序列與Nr(Non-redundant Protein Sequence Database in GenBank)、Swiss-Prot(Swiss-Prot Protein Sequence Database)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)數(shù)據(jù)庫進行比對,獲取與unigene具有最高序列相似性的蛋白,從而得到該unigene的蛋白功能注釋信息。根據(jù)Nr注釋信息,使用Blast2GO[8]軟件進行GO注釋,得到每個unigene的GO信息后,用WEGO[9]軟件進行GO功能分類統(tǒng)計。

    按照Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG的優(yōu)先級順序,將unigene序列與以上蛋白庫進行Blastx比對,取比對結果中等級最高的蛋白確定該unigene的編碼區(qū)序列,然后根據(jù)標準密碼子表將編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸序列,從而得到該unigene編碼區(qū)的核酸序列(序列方向5′→3′)和氨基酸序列。最后,將與以上蛋白庫都比對不上的unigene再用軟件ESTScan預測其編碼區(qū),得到其編碼區(qū)的核酸序列(序列方向5′→3′)和氨基酸序列[10]。

    1.2.4 SSR位點的篩選 利用MIcroSAtellite(MISA) 軟件在所有unigene中搜索SSR位點,設置二核苷酸重復次數(shù)至少為6次,三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復次數(shù)至少為4次。

    2 結果與分析

    2.1 轉錄組測序和組裝

    通過Illumina Hiseq2000平臺測序,總計產(chǎn)出56 374 280條reads,去除低質量和含有接頭的reads后,得到53 697 490條clean reads,共計5 369 749 000個核苷酸(Nucleotides,nt),GC含量45.52%、Q20為95.63%。利用Trinity軟件對這些reads進行組裝得到35 238條unigene,平均長度為1 081 nt,N50為 1 735 nt。unigene的長度分布(圖1)顯示,長度大于1 000 nt的unigene 13 651條,占全部unigene的38.74%。這些說明本研究中轉錄組文庫的測序和組裝結果都較好,能夠進行后續(xù)生物信息學分析。

    2.2 功能注釋

    為了預測unigene功能,分別將unigene與Nr、Swiss-Prot、COG、KEGG等生物學數(shù)據(jù)庫進行比對。通過Blast比對(表1),共有26 751條unigene獲得了基因注釋,占所有unigene的75.92%;有8 487條unigene(24.08%)未被注釋,這些未被注釋的基因可能認為是新基因。

    利用blastx將組裝出來的unigene序列與Nr數(shù)據(jù)庫進行比對后,取每個unigene在Nr庫中比對結果最好(E值最低)的那一條序列為對應同源序列(如有并列,取第一條)確定同源序列所屬物種,統(tǒng)計比對到各個物種的同源序列數(shù)量,共找到26 719個unigene與其他近緣生物的已知基因具有不同程度的同源性,其中有19 901條(74.48%)與葡萄(Vitis vinifere)同源;1 371條(5.13%)與可可(Theobroma cacao)序列同源;865條(3.24%)與樹棉(Gossypium arboreum)序列同源。35 238條unigene中還有8 519條(24.18%)unigene沒有比對到近源物種 (圖2)。

    將所有unigene基因與COG和GO數(shù)據(jù)庫進行比對,并進行功能注釋與分類。26 816條unigene被注釋到25個COG類別中(圖3),其中一般功能基因(Generalfunction prediction only)是最大類別,包含5 280條unigene,占被注釋unigene總數(shù)的19.69%; 其次是信號傳導機制(Signal transduction mechanisms),包含3 293條(12.28%)unigene,其余依次為翻譯后修飾,蛋白質周轉以及分子伴侶類(Posttranslational modification,protein turnover,chaperones)(2 980條,11.11%),RNA加工與修改(RNA processing and modification)(1 591條,5.93%),而細胞運動(Cell motility)是最小的類別,僅包含10條unigene。

    在已經(jīng)得到的Nr注釋信息基礎上,采用Blast2GO獲得毛葡萄unigene的GO分類信息,共有14 692條unigene得到GO注釋(圖4)。在GO分類體系中,生物學過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(Molecular function)。這3個大的類別又被劃分為詳細的44個小類別,其中“代謝過程(Metabolic process)”(8 819, 60.03%)、“細胞過程(Cellular process)”(8 352, 56.84%)和“結合(Binding)”(8 027,54.64%),3個類群占了主要部分,而“翻譯調節(jié)活性(Translation regulator activity)”(2,0.01%)、“核酸結合轉錄因素活性(Nucleic acid binding transcription factor activity)”(3,0.02%)和“內核(nucleoid)”(4,0.04%)僅有非常少的基因歸入,這一分類結果顯示了毛葡萄基因表達譜的總體情況。

    2.3 代謝通路分析

    對野生毛葡萄葉片的轉錄組進行KEGG分析發(fā)現(xiàn),有6 871條unigene注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中,分布于122條已知的通路中,包括淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)(165條,ko00500)、植物病原物相互作用(Plant-pathogen interaction)(145條,ko04626)和光合生物碳固定(Carbon fixation in photosynthetic organisms)(78條,ko00710)。注釋序列數(shù)目較多的5個通路分別是代謝途徑(Metabolic pathways)(1 743條,ko01100)、次生代謝物生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)(812條,ko01110)、核糖體(Ribosome)(278條,ko03010)、植物激素信號轉導(Plant hormone signal transduction)(220條,ko04075)和真核細胞核糖體合成(Ribosome biogenesis in eukaryotes)(209,ko03008)(表2)。

    2.4 SSR分析

    利用MISA軟件在毛葡萄的35 238條unigene中共搜索到4 428個SSR位點,占unigene總序列數(shù)的12.57%,平均每8.6 kb出現(xiàn)1個SSR,其中包含有兩個及兩個以上SSR的unigene共有576條。二核苷酸和三核苷酸重復類型的SSR數(shù)目最多,其中二核苷酸1 906條、三核苷酸1 762條;而五核苷酸和六核苷酸重復類型在毛葡萄中轉錄組序列中含量較少,僅有165條和201條(表3)。除此之外,不同核苷酸的重復次數(shù)也有很大的變化。在檢測到的SSR中出現(xiàn)頻率最高的5類基序為AG/CT 1 425個、AAG/CTT 552個、AT/TA 345個、ATC/ATG 247個、AGC/CTG 235個,上述SSR特征分析有助于開展毛葡萄及其同屬物種的基因組差異分析通用性標記開發(fā)和遺傳圖譜構建的研究。

    3 討論

    基于高通量測序技術的轉錄組學研究是一種高效、可靠的發(fā)掘功能基因的手段,Illumina高通量測序的數(shù)據(jù)量大、速度快、成本低、效率高[11]。本研究應用Illumina高通量測序技術對毛葡萄轉錄組進行測序,對毛葡萄轉錄組測序獲得了56 374 280個reads序列,去除低質量的和含有接頭的reads以后,得到53 697 490條clean reads,5 369 749 000個核苷酸,GC含量45.52%、Q20為95.63%。利用Trinity軟件對這些reads進行組裝得到35 238條unigene,長度從224 nt到15 540 nt,平均長度為1 081 nt,N50 為1 735 nt,N50值越大反映組裝得到的長片段越多組裝效果就越好。測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量和數(shù)據(jù)組裝質量是評價轉錄組測序完成情況的重要指標。以上研究結果表明,此次序列組裝的質量和長度可以滿足轉錄組分析的基本要求。

    結合生物信息學分析方法對毛葡萄unigene與Nr、Swiss-Prot、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對,進行序列相似性和功能注釋分析。26 719個unigene與其他近緣生物的已知基因具有不同程度的同源性,有19 901條(74.48%)與葡萄同源,與葡萄的親緣關系最近。KEGG分析中,19 274條unigene被注釋到128個代謝通路。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫對上述unigene進行代謝途徑分析,涉及112個具體的代謝途徑分支,參與到毛葡萄體內的碳水化合物代謝、脂類代謝、次生物質代謝等過程中,為進一步大量挖掘毛葡萄生長發(fā)育過程中的重要表達基因,開展毛葡萄的基因克隆及功能驗證等研究提供了基礎數(shù)據(jù)。轉錄組數(shù)據(jù)分析結果表明,毛葡萄葉片為植物生長提供了物質、能量、信號轉導以及抗病條件。

    SSR分子標記具有操作簡便、重復性好、多態(tài)性豐富、遺傳信息量大、共顯性遺傳等優(yōu)點,已在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、功能基因發(fā)掘、分子標記輔助育種等研究中得到了廣泛應用。采取實驗室方法開發(fā)SSR標記費時、耗力、成本高、試驗復雜,基于轉錄組數(shù)據(jù)信息進行SSR分子標記開發(fā)是一種經(jīng)濟有效的方法。目前毛葡萄可利用的分子標記數(shù)量非常有限,轉錄組產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)為SSR分子標記的開發(fā)提供了豐富和極有價值的可利用資源。本研究在35 238條unigene中共搜索到4 428個SSR位點,占unigene總序列數(shù)的12.57%。二核苷酸和三核苷酸重復類型的SSR數(shù)目最多,其中二核苷酸1 906條(43.04%)、三核苷酸1 762條(39.79%),前人的研究結果顯示有些物種二核苷酸占優(yōu)勢,另一些物種三核苷酸占優(yōu)勢,這種現(xiàn)象的出現(xiàn)與MISA搜索時相關參數(shù)的設置有很大的關系[12],后續(xù)可對這些SSR進行引物設計和擴增檢測,篩選出擴增穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性好的引物為進一步開發(fā)新的SSR標記奠定了基礎。

    本研究采用Illumina Hiseq2000高通量測序技術建立了毛葡萄轉錄組數(shù)據(jù)庫,獲得了大量的轉錄本信息,并對表達基因進行了序列組裝、功能注釋、代謝途徑等分析,為今后更深入研究毛葡萄功能基因組、基因克隆及抗逆機理研究提供了極大的方便。

    參考文獻:

    [1] 林 玲,張 瑛,盧 江,等.中國葡萄屬野生資源毛葡萄的研究與利用進展[J].中外葡萄與葡萄酒,2015(2):66-69.

    [2] 涂 佳,鄧學良,周文化,等.野生毛葡萄常規(guī)營養(yǎng)成分和原花青素含量分析[J].食品與機械,2010(2):82-85.

    [3] 鄒 瑜,吳代東,張 瑛,等.毛葡萄霜霉病防治試驗[J].廣西農(nóng)業(yè)科學,2002(6):315-317.

    [4] 鄒 瑜. 野生毛葡萄種質資源及利用研究進展[J].南方農(nóng)業(yè)學報,2008,39(5):664-667.

    [5] WANG Z,GERSTEIN M,SNYDER M. RNA-Seq:A revolutionary tool for transcriptomics[J].Nature Reviews Genetics,2009, 10(1):57-63.

    [6] COSTA V,ANGELINI C,DE FEIS I,et al. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq[J]. Journal of Biomedicine and Biotechnology,2010:853916.

    [7] HAAS B J,PAPANICOLAOU A,YASSOUR M,et al. De novo transcript sequencere construction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis[J].Nature Protocols,2013,8(8):1494-1512.

    [8] CONESA A,G?魻TZ S,GARC?魱A-G?譫MEZ J M,et al. Blast2GO:A universal tool for annotation,visualization and analysis in functional genomics research[J].Bioinformatics,2005,21(18):3674-3676.

    [9] YE J,F(xiàn)ANG L,ZHENG H,et al. WEGO:A web tool for plotting GO annotations[J].Nucleic Acids Research,2006,34(1):293-297.

    [10] BIAO J,DASEN X,WENRUI L,et al. De Novo assembly and characterization of the transcriptome, and development of SSR markers in wax gourd(Benicasa hispida)[J].Plos One,2013, 8(8):653-661.

    [11] SUN C, LI Y,WU Q,et al. De novo sequencing and analysis of the American ginseng root transcriptome using a GS FLX Titanium platform to discover putative genes involved in ginsenoside biosynthesis[J]. BMC Genomics,2010,11:262.

    [12] WEI W L,QI X Q,WANG L H,et al. Characterization of the sesame(Sesamum indicum L.) global transcriptome using Illumina paired-end sequencing and development of EST-SSR markers[J].BMC Genomics,2011,12:451.

    猜你喜歡
    核苷酸高通量葡萄
    高通量衛(wèi)星網(wǎng)絡及網(wǎng)絡漫游關鍵技術
    國際太空(2023年1期)2023-02-27 09:03:42
    單核苷酸多態(tài)性與中醫(yī)證候相關性研究進展
    徐長風:核苷酸類似物的副作用
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:28
    葡萄熟了
    當葡萄成熟時
    女報(2020年10期)2020-11-23 01:42:42
    高通量血液透析臨床研究進展
    Acknowledgment to reviewers—November 2018 to September 2019
    Ka頻段高通量衛(wèi)星在鐵路通信中的應用探討
    中國通信衛(wèi)星開啟高通量時代
    小青蛙報(2016年2期)2016-10-15 05:05:56
    天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产精品蜜桃在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 美女主播在线视频| 免费av观看视频| 亚洲无线观看免费| 亚洲av电影不卡..在线观看| 一级av片app| 嫩草影院入口| 最近视频中文字幕2019在线8| 夫妻午夜视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 最后的刺客免费高清国语| 国产黄色小视频在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| av福利片在线观看| 欧美区成人在线视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 免费看a级黄色片| eeuss影院久久| 看十八女毛片水多多多| 午夜福利网站1000一区二区三区| 永久免费av网站大全| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 哪个播放器可以免费观看大片| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 91av网一区二区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产精品一及| 一边亲一边摸免费视频| 美女大奶头视频| 亚洲精品成人久久久久久| 国产一区二区在线观看日韩| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲欧美精品专区久久| 我的老师免费观看完整版| 国产精品一区二区性色av| 日韩一本色道免费dvd| 国产av在哪里看| av在线观看视频网站免费| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产黄频视频在线观看| 亚洲自拍偷在线| 欧美bdsm另类| 久久久成人免费电影| 日日撸夜夜添| 国产男人的电影天堂91| 亚洲欧洲日产国产| 欧美性感艳星| 男女视频在线观看网站免费| 久久久久网色| 国产69精品久久久久777片| 极品教师在线视频| 欧美成人午夜免费资源| 丝瓜视频免费看黄片| 日日啪夜夜爽| 午夜久久久久精精品| 午夜精品一区二区三区免费看| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美不卡视频在线免费观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 欧美最新免费一区二区三区| av天堂中文字幕网| 精品人妻偷拍中文字幕| 中文字幕av成人在线电影| 中文欧美无线码| 看非洲黑人一级黄片| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲18禁久久av| 久久精品国产自在天天线| 国产成人福利小说| 日韩成人av中文字幕在线观看| 一本一本综合久久| 国产中年淑女户外野战色| 久久精品久久久久久久性| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲在线观看片| 99久久精品一区二区三区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 日韩成人伦理影院| 日韩成人伦理影院| 亚洲色图av天堂| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产 亚洲一区二区三区 | 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产男人的电影天堂91| 乱人视频在线观看| 中国国产av一级| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 人妻系列 视频| 99热这里只有精品一区| 国产高清三级在线| 国产探花在线观看一区二区| 欧美日本视频| 最近中文字幕2019免费版| 一区二区三区高清视频在线| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲精品色激情综合| 搡老乐熟女国产| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲内射少妇av| av在线天堂中文字幕| 一区二区三区免费毛片| 能在线免费观看的黄片| 色视频www国产| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产淫语在线视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 99热这里只有是精品50| 久久久久久久久中文| 国产v大片淫在线免费观看| 午夜久久久久精精品| 如何舔出高潮| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产又色又爽无遮挡免| 三级经典国产精品| 国产高潮美女av| 亚洲国产精品sss在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产高清国产精品国产三级 | 欧美日韩综合久久久久久| 国产精品综合久久久久久久免费| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 我要看日韩黄色一级片| 日本一二三区视频观看| 色视频www国产| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产一区有黄有色的免费视频 | 中文字幕av成人在线电影| 久久这里只有精品中国| 国产成年人精品一区二区| 青春草亚洲视频在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品一区www在线观看| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲精品一区蜜桃| 波多野结衣巨乳人妻| 岛国毛片在线播放| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩欧美精品v在线| 草草在线视频免费看| 少妇的逼好多水| 在线观看免费高清a一片| 大香蕉97超碰在线| 成年免费大片在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 人妻一区二区av| 亚洲成人av在线免费| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产精品av视频在线免费观看| 日韩强制内射视频| 嫩草影院入口| 51国产日韩欧美| 日日啪夜夜爽| a级一级毛片免费在线观看| 九草在线视频观看| 国产高潮美女av| 国产不卡一卡二| 色哟哟·www| 色播亚洲综合网| 精品人妻熟女av久视频| 欧美 日韩 精品 国产| 免费少妇av软件| 免费无遮挡裸体视频| 国产爱豆传媒在线观看| 久久99热这里只有精品18| 街头女战士在线观看网站| 亚洲av.av天堂| 青春草亚洲视频在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产69精品久久久久777片| 一级爰片在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 日本一二三区视频观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲欧美精品自产自拍| 日本色播在线视频| 床上黄色一级片| 男女视频在线观看网站免费| 一级黄片播放器| 又爽又黄a免费视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产极品天堂在线| 欧美精品国产亚洲| 精品久久久精品久久久| 国产视频内射| 一级毛片aaaaaa免费看小| 九九在线视频观看精品| 国产极品天堂在线| xxx大片免费视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产91av在线免费观看| 午夜视频国产福利| 成年女人看的毛片在线观看| 日本色播在线视频| 有码 亚洲区| 性色avwww在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩人妻高清精品专区| 久久人人爽人人爽人人片va| 性色avwww在线观看| 国产单亲对白刺激| 久久久精品免费免费高清| 三级经典国产精品| 日韩欧美 国产精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 99热网站在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| 国产麻豆成人av免费视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 免费观看av网站的网址| 国产伦精品一区二区三区视频9| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲精品第二区| 少妇的逼水好多| 两个人的视频大全免费| 七月丁香在线播放| 日本爱情动作片www.在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品人妻久久久影院| 精品久久久精品久久久| 日日啪夜夜爽| 看免费成人av毛片| 五月伊人婷婷丁香| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 午夜激情欧美在线| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 国产精品精品国产色婷婷| 久久精品国产亚洲网站| 久久久欧美国产精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产男人的电影天堂91| 在线 av 中文字幕| 亚洲av成人精品一区久久| 1000部很黄的大片| 黑人高潮一二区| 国产美女午夜福利| 联通29元200g的流量卡| 高清午夜精品一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 成年人午夜在线观看视频 | 两个人的视频大全免费| 色吧在线观看| 精品久久久精品久久久| 国产色爽女视频免费观看| 99视频精品全部免费 在线| 七月丁香在线播放| 国产精品熟女久久久久浪| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 成人毛片60女人毛片免费| 高清av免费在线| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 成人亚洲精品一区在线观看 | 老司机影院成人| 免费观看精品视频网站| 日韩欧美 国产精品| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久久久九九精品二区国产| 久久人人爽人人爽人人片va| 午夜老司机福利剧场| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美三级亚洲精品| 久久久久久久久久黄片| 亚洲国产精品成人久久小说| a级一级毛片免费在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 国产精品日韩av在线免费观看| 97精品久久久久久久久久精品| 可以在线观看毛片的网站| 日韩精品青青久久久久久| 丰满乱子伦码专区| 少妇熟女欧美另类| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲真实伦在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 日韩av免费高清视频| 能在线免费看毛片的网站| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产老妇女一区| 久久人人爽人人爽人人片va| 能在线免费观看的黄片| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产永久视频网站| av一本久久久久| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲成人中文字幕在线播放| 校园人妻丝袜中文字幕| 91精品国产九色| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品久久久久久精品电影| 婷婷色综合www| 国产色婷婷99| 男的添女的下面高潮视频| 久久久久久久午夜电影| 欧美xxxx性猛交bbbb| 麻豆成人av视频| 久久精品国产自在天天线| 亚洲高清免费不卡视频| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 18禁在线播放成人免费| 亚洲久久久久久中文字幕| 精品国产露脸久久av麻豆 | 丝袜喷水一区| 国产免费福利视频在线观看| 777米奇影视久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 伦精品一区二区三区| 日本wwww免费看| 久久久久精品性色| 少妇的逼水好多| 五月伊人婷婷丁香| 一级毛片我不卡| 日韩欧美一区视频在线观看 | av免费在线看不卡| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 一个人看视频在线观看www免费| 国产不卡一卡二| 丰满少妇做爰视频| 免费观看精品视频网站| 午夜福利在线在线| 成人午夜高清在线视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 免费观看在线日韩| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产精品久久久久久久久免| 国产高清不卡午夜福利| 高清av免费在线| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费黄色在线免费观看| 成年版毛片免费区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| www.av在线官网国产| 亚洲内射少妇av| 中文字幕制服av| 亚洲av日韩在线播放| 精品久久国产蜜桃| 亚洲av不卡在线观看| 九九在线视频观看精品| 最近视频中文字幕2019在线8| 免费看av在线观看网站| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲欧洲日产国产| 91精品国产九色| 大话2 男鬼变身卡| 午夜亚洲福利在线播放| 日本三级黄在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 国产大屁股一区二区在线视频| 午夜福利高清视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 十八禁国产超污无遮挡网站| 午夜福利高清视频| 国产免费视频播放在线视频 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 男人爽女人下面视频在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 人妻少妇偷人精品九色| 免费大片黄手机在线观看| 少妇的逼好多水| 国产精品久久久久久久久免| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 如何舔出高潮| 国产午夜精品论理片| 国产黄片美女视频| 国产高清不卡午夜福利| 欧美日韩综合久久久久久| 看黄色毛片网站| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲四区av| 精品人妻熟女av久视频| 丝瓜视频免费看黄片| 国产免费一级a男人的天堂| 免费观看性生交大片5| 免费人成在线观看视频色| 亚洲国产av新网站| 国产69精品久久久久777片| 欧美xxⅹ黑人| 国产黄色小视频在线观看| 丝袜喷水一区| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲国产色片| 一个人看的www免费观看视频| 高清av免费在线| 别揉我奶头 嗯啊视频| 午夜福利在线在线| 国产精品熟女久久久久浪| 色综合色国产| 国产精品三级大全| 欧美成人午夜免费资源| 久久久亚洲精品成人影院| 久久久久久久午夜电影| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 永久免费av网站大全| 午夜福利在线观看吧| 97超碰精品成人国产| 热99在线观看视频| 在线 av 中文字幕| h日本视频在线播放| 激情 狠狠 欧美| 国产大屁股一区二区在线视频| 午夜福利在线在线| 国产在视频线精品| 麻豆成人av视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 五月玫瑰六月丁香| 一级av片app| 日本免费在线观看一区| 一级二级三级毛片免费看| 免费黄频网站在线观看国产| 久久99精品国语久久久| 亚洲最大成人手机在线| 伦精品一区二区三区| 亚洲精品色激情综合| 免费看日本二区| 国产免费一级a男人的天堂| 六月丁香七月| 看黄色毛片网站| 日韩大片免费观看网站| 嘟嘟电影网在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产午夜精品一二区理论片| 国产不卡一卡二| 午夜激情福利司机影院| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 欧美xxxx性猛交bbbb| 色综合色国产| 国产黄a三级三级三级人| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲真实伦在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 久久精品国产亚洲av涩爱| 色5月婷婷丁香| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 久久久久网色| 欧美日韩综合久久久久久| 最近中文字幕高清免费大全6| 免费观看精品视频网站| 日韩制服骚丝袜av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久精品人妻少妇| 亚洲最大成人手机在线| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 免费观看精品视频网站| 亚洲国产av新网站| 欧美3d第一页| av在线蜜桃| 国产在视频线精品| 黄色日韩在线| 一夜夜www| 欧美高清成人免费视频www| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 免费黄色在线免费观看| av网站免费在线观看视频 | 欧美丝袜亚洲另类| 我的老师免费观看完整版| 一区二区三区乱码不卡18| 三级经典国产精品| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日韩三级伦理在线观看| 国产一级毛片在线| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 禁无遮挡网站| .国产精品久久| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产激情偷乱视频一区二区| 黄片wwwwww| 久久精品久久久久久久性| 亚洲精品自拍成人| 精品一区二区三区视频在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 97热精品久久久久久| 欧美不卡视频在线免费观看| 日本免费a在线| 中文字幕久久专区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 日日啪夜夜爽| 少妇丰满av| 女人被狂操c到高潮| 久久久午夜欧美精品| 日韩 亚洲 欧美在线| av在线蜜桃| 国内精品宾馆在线| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 免费大片黄手机在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产高清国产精品国产三级 | 色综合站精品国产| 国产淫语在线视频| 亚洲av成人av| 国产免费又黄又爽又色| 国产男人的电影天堂91| 成人美女网站在线观看视频| 日韩欧美三级三区| 在线观看人妻少妇| 久久久久久伊人网av| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲美女视频黄频| 晚上一个人看的免费电影| av免费观看日本| 午夜精品国产一区二区电影 | 岛国毛片在线播放| 亚洲国产精品成人综合色| 一个人看的www免费观看视频| 欧美zozozo另类| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 两个人视频免费观看高清| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 黄色一级大片看看| 毛片一级片免费看久久久久| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲高清免费不卡视频| 欧美最新免费一区二区三区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 老司机影院毛片| 午夜福利视频1000在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 精品一区二区三区视频在线| 日韩欧美 国产精品| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日韩av不卡免费在线播放| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲乱码一区二区免费版| 婷婷色av中文字幕| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产午夜精品论理片| 搡老妇女老女人老熟妇| 天天一区二区日本电影三级| 丝袜美腿在线中文| h日本视频在线播放| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 精品一区二区三区视频在线| 在线观看av片永久免费下载| 午夜激情欧美在线| 免费看a级黄色片| 亚洲国产成人一精品久久久| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产在视频线在精品| 久久久久久久久久黄片| 国产免费又黄又爽又色| 97在线视频观看| av在线亚洲专区| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产男女超爽视频在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 免费观看av网站的网址| 能在线免费观看的黄片| 午夜福利在线在线| 免费看日本二区| 亚洲国产av新网站| 99热这里只有是精品50| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 国产亚洲最大av| 欧美人与善性xxx| 欧美成人a在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 国产亚洲精品久久久com| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 麻豆乱淫一区二区| 街头女战士在线观看网站| 精品久久久久久成人av| 美女黄网站色视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 欧美一区二区亚洲| 久久久久久久久久久免费av| 日本一二三区视频观看| 边亲边吃奶的免费视频| 天堂俺去俺来也www色官网 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美区成人在线视频| 好男人在线观看高清免费视频|