中平樹中東莨菪內(nèi)酯的分離鑒定及含量測定

黃建猷++盧文杰++譚曉++陸國壽++黃周鋒++蘭保強

摘要：采用硅膠柱色譜分離純化的方法從中平樹[Macaranga denticulata （Bl.） Muell. Arg.]中分離得到一種香豆素類化合物，根據(jù)理化性質及光譜數(shù)據(jù)鑒定其為東莨菪內(nèi)酯。并采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇∶0.1%冰醋酸（39∶61）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長345 nm的色譜條件，用HPLC法測定中平樹中東莨菪內(nèi)酯的含量。結果表明，東莨菪內(nèi)酯在1.45～7.24 μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關系，平均回收率為99.18%，RSD為1.18%（n=6）。該方法簡便、準確、快速，可用于中平樹藥材的質量控制。

關鍵詞：中平樹[Macaranga denticulata （Bl.） Muell. Arg.]；東莨菪內(nèi)酯；分離純化；高效液相色譜法

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）18-4805-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.044

中平樹[Macaranga denticulata（Bl.） Muell. Arg.]為大戟科血桐屬植物，又名血桐、糠皮樹、賴麻、牢麻等，分布于廣東、廣西、貴州、云南、西藏等地。其根味苦，性涼。具有清熱利濕、退黃的功能，主治黃疸型肝炎，胃脘疼痛[1]。廣西民間主要用其根部治療黃疸性肝炎方面的疾病[2]，應用前景廣闊。為探明中平樹根的化學物質基礎，本試驗從中平樹藥材中分離鑒定得到了東莨菪內(nèi)酯，并采用高效液相色譜法對其含量進行了測定，該方法可用于中平樹藥材的質量控制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中平樹采自廣西馬上縣，由廣西中醫(yī)藥研究院何開家主任中藥師鑒定為中平樹。東莨菪內(nèi)酯對照品為從中平樹中提取分離獲得，經(jīng)結構鑒定并采用HPLC歸一化法測得含量大于98%后使用；甲醇為色譜純；水為去離子水；其余試劑為分析純。

1.2 儀器

IR-470型紅外光譜儀、LC-10AT型高效液相色譜儀、威瑪龍色譜工作站、AUW220D型分析天平、AEL-200型分析天平（日本島津公司），DRX-500MHz型超導核磁共振儀（瑞士布魯克公司），ZDM-83-1型電熱熔點儀（江蘇科教玻璃儀器廠），KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司），HH-S2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠），SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取分離 中平樹粉碎成粗粉，稱取12 kg，加8倍體積95%乙醇浸泡過夜后加熱回流提取4次，每次2 h，合并提取液，減壓回收乙醇，得浸膏。浸膏加入海沙使其分散均勻，依次用石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯回流提取，回收溶劑后分別得到石油醚部位及乙酸乙酯部位。取乙酸乙酯部位進行硅膠柱色譜分離，用石油醚（60～90 ℃）—乙酸乙酯混合溶劑（100∶0→70∶30）梯度洗脫，共收集265個流分。采用薄層鑒別將各流份分別合并，將第150流份到第183流份合并，反復柱層析及重結晶得到黃色針狀結晶。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取東莨菪內(nèi)酯對照品3.62 mg置于250 mL量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為14.48 μg/mL的對照品儲備液，備用。精密量取14.48 μg/mL的對照品儲備液3.0 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為4.34 μg/mL的對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 精密稱定中平樹藥材粉末（過40目篩）2.0 g，置燒瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，置燒瓶中，濃縮至約1 mL，加3 mol/L鹽酸溶液10 mL，水浴中加熱水解1 h，立即冷卻，移入分液漏斗中，用水10 mL洗滌容器，并入分液漏斗中，用氯仿強力振搖5次，每次15 mL，合并氯仿液，立即加甲醇使溶解，轉移至10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.4 色譜條件 采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇∶0.1%冰醋酸水溶液（39∶61），流速1.0 mL/min，柱溫為室溫，檢測波長345 nm。分別精密吸取東莨菪內(nèi)酯對照品、供試品和空白溶液各10 μL，進樣分析，記錄色譜圖（圖1、圖2）。理論塔板數(shù)按東莨菪內(nèi)酯計算應不低于3 000，東莨菪內(nèi)酯峰與相鄰峰的分離度大于1.5，供試品中其他成分不干擾測定。

2 結果與分析

2.1 東莨菪內(nèi)酯的結構鑒定

黃色針狀結晶（氯仿），m.p.：202～204 ℃，EI-MS m/z：192[M+]。1H NMR（500 MHz，MeOD）δ 7.85 （1H，d，J=9.4 Hz，H-4），7.11（1H，s，H-8），6.77（1H，s，H-5），6.20（1H，d，J=9.4 Hz，H-3），4.91（1H，s，-OH），3.91（3H，s，-OCH3）；13C NMR（125 MHz，MeOD）δ 164.0（C-2），112.6（C-3），146.1（C-4），109.8（C-5），147.0（C-6），152.9（C-7），103.9（C-8），151.4（C-9），112.5（C-10），56.8（OCH3）。該數(shù)據(jù)與文獻[3]一致，鑒定為東莨菪內(nèi)酯（Scopoletin），東莨菪內(nèi)酯的化學結構見圖3。

2.2 東莨菪內(nèi)酯的含量測定

2.2.1 線性關系考察 分別精密吸取東莨菪內(nèi)酯對照品儲備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度。精密吸取上述系列濃度對照品溶液各10 μL，進樣測定。以對照品濃度（μg/mL）為橫坐標X，色譜峰面積為縱坐標Y，得回歸方程為：Y=42 817X-9 136（r=0.999 9），東莨菪內(nèi)酯1.45～7.24 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.2 精密度試驗 取對照品溶液，按“1.3.4”色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算得東莨菪內(nèi)酯峰面積的RSD為0.51%，表明該儀器精密度良好。

2.2.3 重復性試驗 取同一批樣品6份，按“1.3.3”制備供試品溶液并進樣測定，計算得東莨菪內(nèi)酯的平均含量為36.486 6 μg/g，RSD為1.13%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試液，分別于制備后0、2、4、6、12、24 h進樣測定，計算東莨菪內(nèi)酯峰面積的RSD為1.08%，表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知東莨菪內(nèi)酯含量的中平樹藥材粉末1.0 g，共6份，分別加入一定量的對照品溶液，按“1.3.3”制備供試品溶液并進行測定，東莨菪內(nèi)酯的回收率見表1。

2.2.6 樣品的測定 取3批中平樹藥材，按”1.3.3”制備供試品溶液，取10 μL進樣測定，計算得3批樣品中東莨菪內(nèi)酯的平均含量分別為41.253 6、50.356 8、39.423 5 μg/g；RSD分別為1.23%、1.89%、1.33%（n=3）。

3 小結與討論

文獻[4-10]分別考察了以甲醇、乙醇、70%乙醇為提取溶劑，冷浸、超聲、回流3種提取方法以及提取時間對東莨菪內(nèi)酯提取效率的影響。結果表明，70%乙醇回流提取1 h的效果最佳。

本研究采用硅膠柱色譜分離純化的方法從中平樹[Macaranga denticulata （Bl.） Muell. Arg.]藥材中分離得到一種香豆素類化合物，根據(jù)理化性質及光譜數(shù)據(jù)鑒定其為東莨菪內(nèi)酯，并采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇∶0.1%冰醋酸（39∶61）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長345 nm的色譜條件，用HPLC法測定中平樹中東莨菪內(nèi)酯的含量。結果表明，東莨菪內(nèi)酯在1.45～7.24 μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關系，平均回收率為99.18%，RSD為1.18%（n=6）。該方法簡便、準確、快速，可用于中平樹藥材的質量控制。

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