梔子種子萌發(fā)過程中的生理生化變化

董艷凱++朱玉野++龔雨虹++胡燕珍++羅光明

摘要：在實(shí)驗(yàn)室條件下，對(duì)不同萌發(fā)階段的梔子（Gardenia jasminoides Ellis）種子進(jìn)行可溶性糖、粗脂肪、淀粉、可溶性蛋白、游離氨基酸含量等生理指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化測(cè)定，以探討梔子種子的萌發(fā)機(jī)制。結(jié)果表明，梔子種子萌發(fā)過程中粗脂肪首先被分解利用，其轉(zhuǎn)化為其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；隨后可溶性糖、淀粉、游離氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在相關(guān)酶的作用下逐步分解，為胚的生長(zhǎng)提供氮源、碳源和能量；蛋白質(zhì)最后被動(dòng)員。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)種子中的氨基酸存在2個(gè)大量積累的階段，可能是為后期的組織生長(zhǎng)、生化反應(yīng)準(zhǔn)備基礎(chǔ)物質(zhì)。因而確定，粗脂肪的分解為梔子種子萌發(fā)的標(biāo)志。

關(guān)鍵詞：梔子（Gardenia jasminoides Ellis）；種子；生理；萌發(fā)機(jī)制

中圖分類號(hào)：S567.7+9.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）18-4726-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.025

中藥梔子來源于茜草科（Rubiaceae）梔子屬（Gardenia Ellis）植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥成熟果實(shí)，其性寒味苦，歸心肺三焦經(jīng)；具有泄火除煩、清熱利尿、涼血解毒之功效；用于黃疸尿赤、血淋澀痛、尿血崩漏等病征[1]。梔子屬植物廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)。中國(guó)主要分布在長(zhǎng)江以南各地，主產(chǎn)于江西、四川、湖北、福建、湖南、廣西、廣東等?。ㄗ灾螀^(qū)）。現(xiàn)代藥理研究證明，梔子的主要活性成分為黃酮類梔子素、三萜類化合物藏紅花素、藏紅花酸及α-藏紅花甙元、環(huán)烯醚萜甙類梔子甙、異梔子甙、去羥梔子甙、山梔子甙等[2]?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)于梔子的需求量很大，且不斷上升，具有很好的市場(chǎng)前景[3]，所以梔子的栽培面積在不斷擴(kuò)大[4]。但栽培梔子的藥材品質(zhì)不穩(wěn)定，而且品種混雜，田間管理粗放，從而使藥材的質(zhì)量存在隱患。種子萌發(fā)是植物源藥材生長(zhǎng)的開始，是控制藥材質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，只有培育出良好的種苗才能獲得優(yōu)質(zhì)的藥材。梔子種子的發(fā)芽期為20 d左右，由于發(fā)芽緩慢，容易導(dǎo)致出苗不齊、出現(xiàn)缺苗現(xiàn)象，嚴(yán)重制約了梔子的生產(chǎn)，因此梔子優(yōu)良種苗的培育問題亟待解決。試驗(yàn)以不同萌發(fā)階段的梔子種子為材料，探討了梔子種子萌發(fā)過程中可溶性糖、粗脂肪、游離氨基酸、可溶性蛋白、淀粉含量的變化，從植物生理的角度分析梔子種子對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)性，以期為弄清梔子種子萌發(fā)的生理適應(yīng)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及處理 2014年11月在江西省樟樹市采集成熟的梔子種子，除去外果皮和果肉后，將種子漂洗干凈，晾干后選取健康飽滿的種子，放入密封袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室里將梔子種子于25 ℃恒溫環(huán)境里浸種1 d；采用濾紙作為發(fā)芽床，30 ℃恒溫?zé)o光照環(huán)境進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。從置床開始，分別取出不同萌發(fā)階段（干種子、吸脹、露白、伸長(zhǎng)、變綠、長(zhǎng)根、長(zhǎng)葉）的適量種子樣品用于各項(xiàng)生理指標(biāo)（可溶性糖、粗脂肪、游離氨基酸、可溶性蛋白、淀粉含量）的測(cè)定。

1.1.2 試劑和儀器 試劑主要有蒽酮、抗壞血酸、苯胼戊三酮、L-亮氨酸、氫氧化鈉、高氯酸、葡萄糖、無水乙醇、無水乙醚；儀器主要是BP211D電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)公司，感量0.000 1）、KQ3200超聲波清洗器（昆山超聲儀器廠）、YF-111B高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）、GZX-9146MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）、UV-1800紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）、LRH-250-Z振蕩培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）以及培養(yǎng)皿（9 cm×3 cm）、濾紙等。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 可溶性糖含量測(cè)定 采用蒽酮比色法[5]來測(cè)定梔子種子的可溶性糖含量，稱取新鮮種子樣品0.5 g，放入研缽中，研磨勻漿，轉(zhuǎn)移至50 mL燒杯中，去離子水少量多次洗滌研缽，合并洗滌液，用塑料膜封口，在沸水中提取30 min。待冷卻后，將提取液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中定容，用移液管吸取可溶性糖提取液1 mL放入具塞試管中，重復(fù)3次，加入5 mL 0.1%蒽酮試劑。搖勻后放入沸水中計(jì)時(shí)10 min，流動(dòng)水冷卻20 min。以空白為對(duì)照，用紫外可見分光光度計(jì)在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程（文中省略）計(jì)算糖含量，再利用公式計(jì)算樣品的可溶性糖含量。

樣品可溶性糖含量=C×V/（a×W×1 000）×100%，

式中，C為用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程所求出的糖含量（mg），a是測(cè)定時(shí)所加入的提取液體積（mL），V為提取液的總體積（mL），W是所測(cè)樣品的鮮重（g）。

1.2.2 淀粉含量測(cè)定 采用高氯酸法測(cè)定梔子種子的淀粉含量，將提取可溶性糖剩余的殘?jiān)D(zhuǎn)移至50 mL燒杯中，加去離子水20 mL，沸水浴15 min之后加入9.2 mol/L高氯酸，沸水浴15 min，過濾至50 mL容量瓶中，定容，搖勻，即淀粉提取液。吸取淀粉提取液1 mL，轉(zhuǎn)至具塞試管中，分別加5 mL葸酮試劑，沸水浴10 min，流動(dòng)水冷卻20 min，以去離子水為對(duì)照，重復(fù)3次。于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算糖含量，再利用公式計(jì)算樣品的淀粉含量。

樣品淀粉含量=[（C×V/A）/（W×1 000）]×100%×0.9，

式中，C為用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求出的糖含量（mg），A為吸取樣品液的體積（mL），V是提取液的總體積（mL），W是所測(cè)樣品的鮮重（g）。

1.2.3 粗脂肪含量測(cè)定 用索氏提取法[6]測(cè)定梔子種子中粗脂肪的含量，取稱過重（W1）且烘干的脫脂濾紙，再稱取適量的梔子種子，嚴(yán)密包裹于濾紙中。包裹的樣品在105 ℃烘2 h后干燥，稱重（W2），烘干后的種子盡量保持在0.1 g，然后放在索氏提取器的承受瓶中，加入100 mL乙醚，置于50 ℃水浴中反復(fù)抽提8 h。待脂肪提取完后，取出濾包并在105 ℃下烘1.5 h，使乙醚完全揮發(fā)，再放入干燥器冷卻，稱重（W3），至恒重。該測(cè)定重復(fù)3次。利用公式計(jì)算樣品的粗脂肪含量。

樣品粗脂肪含量=（W2-W3）/（W2-W1）×100%。

1.2.4 可溶性蛋白含量測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法[7]測(cè)定梔子種子的可溶性蛋白含量，稱取梔子種子樣品0.5 g，置于研缽中，用4 mL去離子水勻漿研磨，轉(zhuǎn)移到離心管中，再用適量去離子水清洗研缽，合并洗液轉(zhuǎn)移至離心管，10 000 r/min離心10 min，取上清液定容至50 mL。再取1.0 mL稀釋液轉(zhuǎn)移至具塞試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250液，充分混合，放置2 min后在595 nm處測(cè)其吸光度，通過g-球蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程（文中省略）計(jì)算蛋白質(zhì)含量，再利用公式計(jì)算樣品的可溶性蛋白含量。

樣品可溶性蛋白含量=[C×Vt/Vs×Wf×1 000]×100%，

式中，C為用g-球蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求出的蛋白質(zhì)含量（mg），Vt為提取液體積（mL），Wf為樣品的鮮重（g），Vs為測(cè)定時(shí)加入的提取液體積（mL）。

1.2.5 游離氨基酸含量測(cè)定 采用茚三酮比色法[8]測(cè)定梔子種子的游離氨基酸含量，精密稱取梔子種子樣品0.1 g于研缽中，加入5 mL 95%乙醇勻漿研磨，用適量95%乙醇少量多次洗滌研缽，合并清洗液，定容至25 mL，70 ℃保溫30 min后過濾，用95%乙醇補(bǔ)充減少的體積。取濾液1 mL，加3 mL 0.1%茚三酮和0.1 mL 0.1%抗壞血酸，沸水浴15 min后冷卻至室溫，于580 nm處測(cè)其吸光度，通過g-球蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算蛋白質(zhì)含量，再利用公式計(jì)算樣品的游離氨基酸含量。

樣品游離氨基酸含量=[C×Vt/Vs×Wf]×100%，

式中，C為用g-球蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求出的蛋白質(zhì)含量（mg），Vt為提取液總體積（mL），Wf為樣品的鮮重（g），Vs為測(cè)定時(shí)加入的提取液體積（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性糖含量的變化

可溶性糖是種子發(fā)芽生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，在種子的萌發(fā)過程中，可溶性糖既可以被分解以提供能量，又可以轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供原料；梔子種子萌發(fā)階段可溶性糖含量的測(cè)定情況見圖1。由圖1可知，在梔子種子萌發(fā)過程中，可溶性糖的含量發(fā)生了明顯的變化，不同萌發(fā)階段其可溶性糖含量呈升高-降低-升高-降低-升高的變化，整體呈曲線上升趨勢(shì)。具體來看，由萌發(fā)前到長(zhǎng)葉階段整個(gè)萌發(fā)期可溶性糖含量增加了0.308個(gè)百分點(diǎn)，其中以生根階段的可溶性糖含量最低，為0.230%；在吸脹階段含量達(dá)到最高，為1.301%，這一階段可溶性糖的含量變化最大；之后的各階段可溶性糖含量均低于吸脹階段，并且在露白、變綠階段又出現(xiàn)明顯下滑，含量分別為0.721%、0.736%，產(chǎn)生的原因可能是在種子萌發(fā)的初始階段，隨著吸脹過程的進(jìn)程，種子內(nèi)發(fā)生了一系列復(fù)雜的生理生化變化，酶的活性增強(qiáng)，貯藏物質(zhì)在酶的作用下被分解為簡(jiǎn)單的小分子化合物，從而使可溶性糖含量增加；而在后面的一系列萌發(fā)階段里，可溶性糖多已被利用，用以合成或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，如為蛋白質(zhì)合成提供碳骨架和ATP的合成提供底物，并為種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)提供能量，從而導(dǎo)致可溶性糖含量降低[7]。當(dāng)種子長(zhǎng)根后，或者進(jìn)一步有側(cè)根生成時(shí)，種子內(nèi)部的物質(zhì)代謝可以自給自足，因此在后面長(zhǎng)葉階段里，可溶性糖含量又呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。

2.2 淀粉含量的變化

淀粉是種子內(nèi)的大分子物質(zhì)，是最重要和分布最廣泛的碳水化合物與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在種子成熟后就作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而貯存于種子內(nèi)；也可以在萌發(fā)過程中，通過自身的代謝、利用可溶性糖或其他營(yíng)養(yǎng)物轉(zhuǎn)化而來。種子萌發(fā)時(shí)，淀粉在淀粉酶的作用下降解為小分子量的可溶性物質(zhì)，同時(shí)釋放出大量的能量供胚吸收利用，所以其含量的變化是種子代謝狀況的重要指標(biāo)。梔子種子萌發(fā)階段淀粉含量的測(cè)定情況見圖2。由圖2可知，梔子種子的淀粉含量很低，干種子僅為0.000 54%；在吸脹階段顯著增加，且淀粉含量達(dá)到最大，為0.001 35%，增加了0.000 81個(gè)百分點(diǎn)，此變化表明梔子種子萌發(fā)初期淀粉的代謝水平增強(qiáng)，可能是其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解后轉(zhuǎn)化為淀粉所致；之后的露白階段種子里淀粉含量急劇減少，為0.000 37%；但此后淀粉代謝又增強(qiáng)，原貯藏的淀粉被水解為可溶性的碳水化合物供胚生長(zhǎng)所用；隨著胚芽的生長(zhǎng)伸長(zhǎng)，淀粉的含量緩慢回升；之后又緩慢下降，至生根階段降至最低，為0.000 08%，說明淀粉被分解代謝后轉(zhuǎn)化為小分子量簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并運(yùn)轉(zhuǎn)到生長(zhǎng)部位，作為構(gòu)成新組織的成分和產(chǎn)生能量的原料了。

2.3 粗脂肪含量的變化

脂肪是種子主要的貯藏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，它與糖和蛋白質(zhì)共同構(gòu)成細(xì)胞的組成物質(zhì)；梔子種子萌發(fā)階段粗脂肪含量的測(cè)定情況見圖3。由圖3可知，梔子種子內(nèi)貯藏的粗脂肪含量較高，為10.54%，這應(yīng)該是其種子生長(zhǎng)所需能量的重要來源。隨著種子的萌發(fā)進(jìn)程，粗脂肪含量呈現(xiàn)降低-升高-降低的變化，在吸脹階段粗脂肪含量大幅減少，為3.79%，可能是在脂肪酶的作用下轉(zhuǎn)化成小分子量物質(zhì)的緣故，從而為胚根的生長(zhǎng)提供物質(zhì)保障和能量需求；以后隨著胚繼續(xù)生長(zhǎng)，粗脂肪含量呈不斷升高，到達(dá)變綠階段時(shí)含量達(dá)到最大，為18.75%，個(gè)中原因可能是可溶性糖和淀粉轉(zhuǎn)化為粗脂肪造成的；再以后粗脂肪含量不斷下降，至長(zhǎng)葉階段降至5.07%，說明隨著胚芽的不斷伸長(zhǎng)，種子內(nèi)部代謝活動(dòng)也越加旺盛，且組織不斷分化，胚需要更多的能量、營(yíng)養(yǎng)來供其生長(zhǎng)；貯藏的粗脂肪可被分解為脂肪酸和甘油，然后運(yùn)輸?shù)缴L(zhǎng)部位，形成新的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和為呼吸作用提供能量，既可通過乙醛酸循環(huán)轉(zhuǎn)化為糖，又可作為呼吸基質(zhì)被消耗掉，所以粗脂肪是種子萌發(fā)過程里重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與能量來源。

2.4 可溶性蛋白含量的變化

蛋白質(zhì)也是種子內(nèi)貯藏的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在種子萌發(fā)時(shí)蛋白質(zhì)可水解產(chǎn)生氨基酸，用于新蛋白質(zhì)的合成，從而為種子萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)提供氮素營(yíng)養(yǎng)；同時(shí)可溶性蛋白含量的提高，還會(huì)增加細(xì)胞的滲透濃度和功能蛋白的數(shù)量，有助于維持細(xì)胞的正常代謝。梔子種子萌發(fā)階段可溶性蛋白含量的測(cè)定情況見圖4。由圖4可知，在梔子種子萌發(fā)過程中，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)升高-降低的變化，其中在干種子中的含量?jī)H為0.098%，而在變綠階段含量達(dá)到1.320%，升高了1.222個(gè)百分點(diǎn)，可能原因是胚乳的生理活動(dòng)尚未加強(qiáng)，代謝水平弱，胚細(xì)胞伸長(zhǎng)所需的養(yǎng)料和能量需求較少，貯藏蛋白開始降解，加之部分淀粉和可溶性糖轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)的含量急劇增加。此后含量迅速下降，至長(zhǎng)葉階段含量最低，為0.002%，比干種子含量還低了0.096個(gè)百分點(diǎn)。這反映出長(zhǎng)葉階段種子內(nèi)的代謝活動(dòng)較強(qiáng)，不斷伸長(zhǎng)的胚根和后期的組織分化、長(zhǎng)出葉片等對(duì)可溶性蛋白的需求迅速增加，促使貯藏蛋白大量水解，而根系此時(shí)還不能從土壤中吸收新的氮元素來補(bǔ)充所致。

2.5 游離氨基酸含量的變化

氨基酸是生物機(jī)體的眾多生物活性物質(zhì)之一，是構(gòu)建細(xì)胞、修復(fù)組織的基礎(chǔ)材料；氨基酸對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)貢獻(xiàn)不只是提供氮源，還對(duì)植物的生理代謝產(chǎn)生不可低估的影響，如氨基酸具有減輕環(huán)境重金屬離子對(duì)植物的毒害作用；梔子種子萌發(fā)階段游離氨基酸含量的測(cè)定情況見圖5。由圖5可知，梔子種子在不同的萌發(fā)階段游離氨基酸的含量變化十分明顯，如在干種子時(shí)含量為0.092 5%，而到了吸脹階段則含量最高，為0.265 0%，升高了0.172 5個(gè)百分點(diǎn)；但到露白階段，游離氨基酸含量又急劇下降，變?yōu)?.019 8%，而此時(shí)的可溶性蛋白含量呈明顯增加的趨勢(shì)，有可能是游離氨基酸被用來合成了蛋白質(zhì)緣故，并且至伸長(zhǎng)階段仍然很低；不過到變綠階段急劇升高，為0.226 0%，此時(shí)種子內(nèi)部的淀粉和可溶性糖的含量都有所降低，極有可能是轉(zhuǎn)化為游離氨基酸的緣故；到生根階段又降到低位，并且是整個(gè)種子萌發(fā)階段里最低的水平，游離氨基酸含量只有0.002 6%，此時(shí)種子內(nèi)部物質(zhì)代謝旺盛，胚根和葉片的生長(zhǎng)都消耗了大量的氨基酸；之后至長(zhǎng)葉階段含量才略有上升，此時(shí)可溶性蛋白的含量不斷下降，可能有部分蛋白質(zhì)被水解而補(bǔ)充了氨基酸緣故。

3 小結(jié)與討論

種子內(nèi)的淀粉、粗脂肪、可溶性糖含量的變化反映了種子內(nèi)可利用態(tài)物質(zhì)和能量的供應(yīng)基礎(chǔ)水平[9]，而可溶性蛋白有一部分是參與各種代謝的酶類，其含量的變化是了解植物代謝狀況的一個(gè)重要指標(biāo)[10]。測(cè)定植物體內(nèi)游離氨基酸含量對(duì)研究植物在不同條件下及不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期氮代謝的變化以及植物對(duì)氮素的吸收、運(yùn)輸、同化及營(yíng)養(yǎng)狀況等都有著重要意義。植物體內(nèi)的生理指標(biāo)反映了植物的生存狀態(tài)，不同環(huán)境因素對(duì)這些指標(biāo)有著不同的影響，通過對(duì)這些指標(biāo)的探討，可以推斷體內(nèi)多種生理反應(yīng)的機(jī)制[11]。試驗(yàn)結(jié)果表明，梔子種子萌發(fā)過程中，隨著種子吸水量的增加，各種酶被激活，粗脂肪首先被分解利用，轉(zhuǎn)化為其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，隨后可溶性糖、淀粉、游離氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在相關(guān)酶的作用下也逐步分解，為胚的生長(zhǎng)提供氮源、碳源和能量，蛋白質(zhì)最后被動(dòng)員。它們?cè)谥参锓N子內(nèi)的分布與變化反映了植物種子萌發(fā)階段營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)情況，而且在種子萌發(fā)階段中起著重要的調(diào)控作用[12]。其中氨基酸存在2個(gè)大量積累的階段，可能是為后期的組織生長(zhǎng)準(zhǔn)備物質(zhì)基礎(chǔ)；而粗脂肪的分解可視為種子萌發(fā)的標(biāo)志。

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