細胞粘附分子-1基因K469E位點多態(tài)性與新疆哈薩克族不同類型腦梗死的相關(guān)性

耿玉榮，陳欣欣，任宏強

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆石河子 832002)

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◇臨床研究◇

細胞粘附分子-1基因K469E位點多態(tài)性與新疆哈薩克族不同類型腦梗死的相關(guān)性

耿玉榮，陳欣欣，任宏強

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆石河子 832002)

目的 探討細胞粘附分子-1(ICAM-1)基因K469E位點在新疆哈薩克族人群中的分布以及與不同類型腦梗死的相關(guān)性。方法 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RELP)，對新疆哈薩克族180例不同類型腦梗死患者(腦梗死組)及180例健康者(對照組)進行ICAM-1基因K469E位點多態(tài)性分析。結(jié)果 ICAM-1基因K469E位點K等位基因在腦梗死組及對照組間有統(tǒng)計學差異(χ2=8.455，P=0.004)，KK基因型在腦梗死組及對照組間有統(tǒng)計學差異(χ2=15.50，P=0.000)，大動脈粥樣硬化(LAA)型腦梗死基因型頻率KK 0.632、KE 0.250、EE 0.118，小動脈閉塞(SAO)型腦梗死基因型頻率KK 0.683、KE 0.192、EE 0.125，兩組相同基因型之間比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.864，P=0.649)，LAA組K等位基因頻率0.757，E等位基因頻率0.243，SAO組K等位基因頻率0.779，E等位基因頻率0.221，兩組間比較無統(tǒng)計學差異(χ2=0.245，P=0.620)。結(jié)論 ICAM-1基因K469E位點多態(tài)性與新疆哈薩克族腦梗死相關(guān)，K等位基因可能是新疆哈薩克族腦梗死患者易感基因。

細胞粘附分子-1(ICAM-1)；K469E；基因多態(tài)性；腦梗死

在我國每年新發(fā)腦卒中患者約有250萬，其中43%～79%是缺血性卒中。2006年開始在全國范圍內(nèi)進行的第3次死因抽樣調(diào)查顯示，腦卒中已成為我國城鎮(zhèn)居民第1位的死亡原因。世界衛(wèi)生組織的心血管病人群監(jiān)測方案(MONICA)表明，我國腦卒中的發(fā)生率正以每年8.7%的速率上升，70%的存活者有偏癱失語等殘障，發(fā)病者約30%死亡[1]。更值得注意的是，在未來的20年里中國的腦卒中發(fā)生率將增加50%[2]。研究表明，腦卒中系遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，可能與年齡、性別、生活方式及其他許多疾病有關(guān)。卒中發(fā)生危險因素的早期識別是降低腦卒中發(fā)生率的重要方式[3]。在對死亡的腦卒中患者進行腦解剖時發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)的表達顯著增加，提示ICAM-1的表達與腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)[4]。在缺血性腦卒中患者的血漿中可溶性ICAM-1水平也有明顯升高[5]，這與ICAM-1基因多態(tài)性有關(guān)[6]。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)新疆哈薩克族腦卒中患者與ICAM-1基因G241R基因多態(tài)性無明確的相關(guān)性，本次研究進一步探討ICAM-1基因K469E位點在新疆哈薩克族人群中的分布以及與不同類型腦卒中的相關(guān)性，為今后腦梗死防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 腦梗死組：符合第四次全國腦血管病會議修訂的腦梗死診斷標準，經(jīng)MRI或CT確診[7]。納入標準：根據(jù)急性卒中治療低分子肝素試驗病因分型法(Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment, TOAST)進行病因分型[8]，納入：①大動脈粥樣硬化型(large artery atherosclerosis, LAA)；②小動脈閉塞型(small artery occlusion, SAO)。LAA型腦梗死符合：通過血管檢查發(fā)現(xiàn)頸動脈、大腦前動脈、大腦中動脈、大腦后動脈、椎基底動脈閉塞或狹窄程度≥50%，臨床表現(xiàn)包括腦皮質(zhì)損傷(失語癥、忽視、失用癥等)、腦干或小腦功能障礙。SAO型腦梗死符合以下3條中的其中1條即可：①臨床有腔隙綜合征表現(xiàn)，影像有與其相符的最大徑小于1.5 cm的位于腦深部的梗死灶；②影像學無相應梗死灶，但臨床表現(xiàn)為腔隙綜合征之一；③臨床不符合腔隙綜合征，但頭顱CT或MRI腦深部有最大徑<1.5 cm的梗死灶。

排除標準：①TOAST分型中其他類型，心源性腦栓塞；其他原因所致的腦梗死；不明原因的腦梗死。②其他可能與ICAM-1基因相關(guān)的疾病:如冠心病心肌梗死、腦出血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風濕性關(guān)節(jié)炎等。

對照組：為年齡、性別與病例組匹配的同期哈薩克族健康體檢者180例，男性98例，女性82例，平均年齡(67.28±8.15)歲，彼此間無血緣關(guān)系，排除標準同腦梗死組。

本試驗所有研究對象均簽署知情同意書，通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 空腹后用含EDTA-Na2抗凝生化管抽取靜脈血5 mL，-80 ℃儲存。

1.2.2 基因組DNA的提取 使用北京百泰克基因組DNA提取試劑盒，嚴格按照說明書操作提取基因組DNA，產(chǎn)物保存在-4 ℃冰箱內(nèi)。

1.2.3 基因擴增 采用聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)，對ICAM-1基因K469E目的片段進行擴增，使用引物設計軟件premier5.0設計引物，K468E位點上游引物：5′-CTCCATGTCATCTCATCGTGT-3′，下游引物：5′-CATTATGACTGCGGCTGCTAC-3′(由上海生工生物工程公司合成提供)。擴增體系為15 μL，含10倍緩沖液1.5 μL、MgCl21.2 μL、dNTP 0.3 μL、引物各0.2 μL、模板DNA 0.5 μL、TaqDNA聚合酶0.1 μL。K469E位點反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，20個循環(huán)，72 ℃延伸6min，4 ℃保存。

1.2.4 基因型測定 取PCR產(chǎn)物10 μL，對ICAM-1基因K469E位點PCR產(chǎn)物加入限制性內(nèi)切酶Bsh12361 2.0 μL，37 ℃水浴過夜，對酶切產(chǎn)物使用40 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，運用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并保存。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。臨床資料中數(shù)值型變量用均數(shù)±標準差表示，采用兩獨立樣本t檢驗；分類變量用頻數(shù)及百分比表示，采用χ2檢驗；組間等位基因頻率及組間基因型比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。計算腦梗死組及對照組之間ICAM-1基因K469E基因型頻率，確認是否符合Hardy-Weinberg平衡。

2 結(jié) 果

2.1 腦梗死組與對照組臨床資料的比較 腦梗死組和對照組在對性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、甘油三酯、低密度脂蛋白進行比較時差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)，而在收縮壓、舒張壓、膽固醇、空腹血糖、同型半胱氨酸之間進行比較時差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

表1 腦梗死組和對照組一般臨床參數(shù)的比較Tab.1 Comparison of general clinical data of the patients in cerebral infarction group and control group

2.2 SNP基因位點分型

2.2.1 PCR擴增產(chǎn)物 ICAM-1 K469E擴增產(chǎn)物為414 bp(圖1)。使用限制性內(nèi)切酶Bsh12361對產(chǎn)物進行酶切電泳(圖2)，有3種基因型KE型(414 bp、252 bp、162 bp)，KK型(414 bp一條帶)，EE型(252 bp、162 bp二條帶)。

圖1 ICAM-1基因K469E位點PCR電泳圖Fig.1 PCR products electrophoresis of ICAM-1 gene K469E

圖2 ICAM-1基因 K469E位點 Bsh1236I酶切電泳圖Fig.2 Electrophoresis of ICAM-1 gene K469E digested by Bsh1236I enzymeM：DNA marker；1、4、6：KE基因型；3：EE基因型；2、5：KK基因型。

2.2.2 基因型測序結(jié)果 詳見圖3。

圖3 ICMA-1基因K469E位點測序結(jié)果Fig.3 Sequence chromatograms of ICAM-1 K469E gene

2.2.3 兩組間基因型及等位基因分布 符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有群體代表性。在腦梗死與對照組中ICAM-1基因K496E位點基因型及等位基因頻率分布情況見表2，兩組基因型及等位基因之間比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2.4 不同類型腦梗死患者基因型和等位基因頻率的分布 大動脈粥樣硬化(LAA)型腦梗死基因型頻率KK 0.632、KE 0.250、EE 0.118，小動脈閉塞(SAO)型腦梗死基因型頻率KK 0.683、KE 0.192、EE 0.125，兩組基因型比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.864，P=0.649)，LAA組K等位基因頻率0.757、E等位基因頻率0.243，SAO組K等位基因頻率0.779、E等位基因頻率0.221，兩組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.245，P=0.620，表3)。

表2 兩組間基因型和等位基因頻率的分布Tab.2 Distribution of different genotypes and allele frequencies

表3 不同類型腦梗死患者基因型和等位基因頻率的分布Tab.3 The genotype frequency and allele distribution in patients with different types of cerebral infarction

3 討 論

ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員之一，主要表達于活化的內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、巨噬細胞以及平滑肌細胞表面，分子質(zhì)量為80～114 ku。ICAM-1可介導單核細胞粘附于內(nèi)皮細胞，進入血管內(nèi)膜層，表達更多的細胞炎癥因子，促使大量的單核細胞進入斑塊內(nèi)，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[9]。腦梗死主要的病因系動脈粥樣硬化，為進一步明確病因，探討與炎癥有關(guān)的因子及其基因多態(tài)性成為腦梗死病因研究的熱點。有研究表明，在腦梗死急性期血漿sICAM-1水平較健康對照組明顯升高，sICAM-1還可能是腦梗死預后的炎癥標志物，血漿中sICAM-1水平與ICAM-1 基因型有關(guān)[10]。人類ICAM-1基因定位在19 p13.3～p13.2，有兩個單核苷酸多態(tài)性，其一為第4外顯子的12959G>A多態(tài)性編碼第3結(jié)構(gòu)域的Gly241/Arg241(G241R)，其二為第6外顯子的13848A>G多態(tài)性編碼第5結(jié)構(gòu)域的LYS469/Gly469(K469E)[11]。本課題組曾對新疆哈薩克族ICAM-1基因G241R進行基因檢測，發(fā)現(xiàn)腦梗死組和健康對照組之間基因型及等位基因頻率無統(tǒng)計學差異，沒有證實ICAM-1 G241R多態(tài)性與新疆哈薩克族腦梗死有關(guān)[12]。國際上著名的社區(qū)動脈粥樣硬化風險研究(ARIC)是有14 595例患者參與的前瞻性隊列研究，VOLCIK等[13]入選13 491例研究對象，有517例發(fā)生腦梗死，對參與者進行ICAM-1基因K469E、G241R檢測發(fā)現(xiàn)，腦梗死組中ICAM-1基因G241R位點RR和GR基因型頻率高于對照組，R等位基因是腦梗死的一個重要預警指標。在所研究的黑人和白種人群中，ICAM-1基因K469E位點基因型頻率在腦梗死組與健康對照組之間無統(tǒng)計學差異。國內(nèi)韋葉生等[14]對廣西壯族195例腦梗死患者、210例健康對照組進行ICAM-1基因K469E位點基因檢測，發(fā)現(xiàn)E等位基因攜帶者患腦梗死的風險是K等位基因的1.454倍，ICAM-1 K469E位點E等位基因是廣西壯族人腦梗死患者的遺傳易感基因。LI等[15]對漢族309例腦梗死患者和309例健康對照組進行ICAM-1基因K469E位點檢測，發(fā)現(xiàn)EE、EK是導致女性腦梗死的危險因素，與男性腦梗死發(fā)生無相關(guān)性。WANG等[16]對大連地區(qū)漢族腦梗死患者進行ICAM-1基因K469E位點檢測發(fā)現(xiàn)，KK基因型是急性腦梗死的危險因素。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1基因K469E位點在哈薩克族人群呈多態(tài)性分布，K等位基因是新疆哈薩克族腦梗死易感基因，KK基因型攜帶者可能更易患腦梗死。出現(xiàn)不同的結(jié)果考慮與所研究對象的生活環(huán)境及種族差異有關(guān)。

本研究腦梗死組與對照組在體質(zhì)量指數(shù)、甘油三酯、低密度脂蛋白比較時，差異無統(tǒng)計學意義；在收縮壓、舒張壓、膽固醇、空腹血糖、同型半胱氨酸兩組間比較時具有統(tǒng)計學差異?？紤]這與哈薩克族獨特的生活習慣有關(guān)，他們?nèi)粘Ｉ疃嘁匝鉃橹?，蔬菜、水果攝入量較少，且喜飲咸奶茶等造成了哈薩克族人腹型肥胖比例高，高血壓占有比例大，系腦梗死高發(fā)人群。哈薩克族人生活在新疆北疆山區(qū)，以游牧為主，很少與外界通婚，生活較為封閉，為基因測定研究提供了良好的基礎。國際上大型實驗亦選取ICAM-1基因位點的多態(tài)性作為腦梗死易感基因的候選基因，故本課題組在原有基礎上進一步擴大樣本量，對新疆哈薩克族ICAM-1基因K469E位點進行檢測，ICMA-1基因多與炎癥相關(guān)，故通過TOAST分型，選取與炎癥關(guān)系密切的大動脈粥樣硬化型、小動脈閉塞型腦梗死患者進行基因型及等位基因檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大動脈粥樣硬化型腦梗死KK占63.2%，小動脈粥樣硬化型腦梗死KK基因占68.3%，二者之間無統(tǒng)計學差異。在兩種類型的腦梗死中，K及E及等位基因之間無統(tǒng)計學差異，這說明ICAM-1基因可能在大動脈粥樣硬化型腦梗死及小動脈閉塞型腦梗死的發(fā)病機制中均起作用，沒有過高的選擇性，但要進一步證實仍需擴大樣本量及行相關(guān)類型血管內(nèi)皮細胞基因測定。

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(編輯 卓選鵬)

Correlation between polymorphism of intercellular adhesion molecule-1 K469E gene and different types of cerebral infarction in Kazaks minority ethnic population of Xinjiang

GENG Yu-rong, CHEN Xin-xin, Ren Hong-qiang

(Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Medical College,Shihezi University, Shihezi 832002, China)

Objective To explore the distribution of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) K469E gene among Kazak people in Xinjiang and its correlation with different types of cerebral infarction. Methods Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism methods were used to analyze the polymorphism of ICAM-1 gene K469E from 180 Xinjiang Kazak patients with different types of cerebral infarction (cerebral infarction group) and 180 healthy people (control group). Results The frequencies of K allele of ICAM-1 gene K469E in cerebral infarction group were significantly different from those in control group (χ2=8.455,P=0.004). The frequencies of KK genotype in cerebral infarction group were significantly different from those in control group (χ2=15.50,P=0.000). Large artery atherosclerosis (LAA) type cerebral infarction genotype frequency was KK 0.632, KE 0.250, and EE 0.118. Small artery occlusion (SAO) type cerebral infarction genotype frequency was KK 0.683, KE 0.192, and EE 0.125. The two groups with the same genotypes showed no significant difference (χ2=0.864,P=0.649). In LAA group, K allele frequency was 0.757 and E allele frequency 0.243; in SAO Group, K allele frequency was 0.779 and E allele frequency 0.221. The two groups revealed no obvious difference (χ2=0.245,P=0.620). Conclusion The polymorphism of ICAM-1 gene K469E is associated with cerebral infarction in Kazaks people in Xinjiang. Its K allele may be the genetic susceptibility gene for cerebral infarction in Kazaks people in Xinjiang.

intercelluar adhesion molecule-1; K469E; gene polymorphism; cerebral infarction

2016-04-29

2016-07-10

國家自然科學基金資助項目(No.81160368)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.8116036)

任宏強. E-mail: 455952229@qq.com

743.33

A

10.7652/jdyxb201606010

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160903.1027.002.html(2016-09-03)